Name: Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Poznaj szybką metodę ekstrakcji DNA genomowego z Caenorhabditis elegans przy użyciu gotowego zestawu do lizy. Ta technika jest idealna do zastosowań PCR w edukacji i badaniach naukowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczep N2 i bakterie E. coli OP50 zostały uzyskane z Caenorhabditis Genetics Center (CGC), które jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Szczep blmp-1(tm548) został uzyskany z National Bioresource Project w Japonii. Autorzy dziękują WormBase. Praca ta była wspierana przez NIH R01GM097591 dla TLG, wewnętrzne finansowanie przez Texas Woman's University dla TLG oraz Centrum Badań Studenckich TWU dla MFL.

1. Utrzymanie C. elegans
UWAGA: Szczepy N2 (typ dziki) i blmp-1(tm548) C. elegans były utrzymywane na standardowych płytkach z pożywkami do hodowli nicieni (NGM) w temperaturze 20 °C.
<ol>
	<li>Przygotować płytki NGM, rozpuszczając 23,005 g proszku NGM w 973 ml wody w kolbie o pojemności 2 l. Przykryj otwór kolby folią aluminiową (lub nasadką nadającą się do sterylizacji w autoklawie, która umożliwia odpowietrzenie) i zabezpiecz pokrywę taśmą autoklawową. Autoklaw w celu rozpuszczenia proszku i sterylizacji zawartości w cyklu sterylizacji trwającym co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Schłodzić podłoże do temperatury 60 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Do schłodzonej pożywki dodać 25 ml sterylnego 1 M buforu fosforanowego (KH2PO4) o pH 6,0, 1 ml 1 M roztworu chlorku wapnia i 1 ml 1 M roztworu siarczanu magnezu.</li>
	<li>Wymieszać pożywkę na magnetycznej płytce mieszającej, aby uzyskać jednorodną mieszaninę i zapobiec nierównomiernemu chłodzeniu i krzepnięciu (~5 min). Upewnij się, że mieszadło obraca się wystarczająco szybko, aby wytworzyć wir, ale nie tak szybko, aby wprowadzić bąbelki (~250-300 obr./min).</li>
	<li>Wlej ~25 ml pożywki do każdej 10 cm płytki Petriego (w sumie ~40 płytek). Wysuszyć płytki w temperaturze pokojowej przez noc (zwykle 16-25 °C).</li>
	<li>Hoduj kolonię Escherichia coli OP50 w 30-50 ml bulionu LB przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wysiewaj każdą płytkę 500 μl kultury E. coli OP50 i pozwól jej wyschnąć w temperaturze pokojowej przed użyciem (zwykle 16-25 °C)8. Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni.</li>
	<li>Przenieś C. elegans na płytki z nasionami za pomocą drucianego kilofa lub innej metody i pozwól im urosnąć do stadium L4 lub dorosłego w temperaturze wymaganej dla szczepu (zwykle 16-25 °C, 1-2 dni, jeśli zwierzęta były posiewane głodzone jako dauery, 3-4 dni, jeśli zwierzęta były posiewane jako zarodki)8.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA pojedynczego robaka
UWAGA: Ta metoda jest przydatna do ekstrakcji DNA z pojedynczego robaka (jeden robak na 1,8 μL całkowitej objętości). Mieszankę wzorcową można wykonać, jeśli jednocześnie będzie lizowanych wiele robaków.
<ol>
	<li>Zaprogramować termocykler na jeden cykl w temperaturze 55 °C na 10 minut, a następnie 95 °C na 3 minuty (program lizy).</li>
	<li>Podwielokrotność 0,8 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu na wewnętrzną ściankę 0,2 ml probówki do PCR na lodzie. Dodać 0,2 μl roztworu do przygotowania tkanek z zestawu do kropelki roztworu ekstrakcyjnego. Wymieszać pipetując.</li>
	<li>Zidentyfikuj L4 lub dorosłe zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym9. Aby zidentyfikować hermafrodyty L4, poszukaj charakterystycznego sromu, który jest widoczny jako blade półkole w środku zwierzęcia. Zidentyfikuj dorosłe hermafrodyty, szukając największych zwierząt na talerzu, które mogą mieć owalne zarodki widoczne w macicy.</li>
	<li>Za pomocą platynowego drucianego wykałacza przenieś wybrane zwierzę do roztworu10.</li>
	<li>Krótko odwirować probówkę (2-3 s, ≤6 000 obr./min / 2 000 × g) w temperaturze pokojowej, aby zebrać zawartość na dnie probówki.</li>
	<li>Umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program lizy ustawiony w kroku 2.1.</li>
	<li>Po zakończeniu programu krótko odwiruj probówkę i umieść ją na lodzie. Dodać 0,8 μl roztworu neutralizującego z zestawu do mieszaniny. Wymieszać pipetując.</li>
	<li>Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).</li>
	<li>Lizat należy stosować bezpośrednio do PCR lub przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: Wyekstrahowane DNA jest stabilne w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy7.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja DNA kilku osób
UWAGA: Ta metoda jest przydatna do ekstrakcji DNA z kilku robaków. Mieszankę wzorcową można przygotować, jeśli wiele szczepów będzie poddanych lizie w tym samym czasie.
<ol>
	<li>Zaprogramować termocykler na jeden cykl w temperaturze 55 °C na 10 minut, a następnie 95 °C na 3 minuty (program lizy).</li>
	<li>Podwielokrotność 2,0 μl roztworu ekstrakcyjnego z zestawu na wewnętrzną ściankę 0,2 ml probówki do PCR na lodzie. Dodać 0,5 μl roztworu do przygotowania tkanek z zestawu do kropelki roztworu ekstrakcyjnego. Wymieszać pipetując.</li>
	<li>Zidentyfikuj L4 lub dorosłe zwierzęta pod mikroskopem preparacyjnym9. Hermafrodyty L4 mają charakterystyczny srom, który jest widoczny jako blade półkole w środku zwierzęcia. Dorosłe hermafrodyty są największymi zwierzętami na talerzu i mogą mieć owalne zarodki widoczne w macicy.</li>
	<li>Za pomocą platynowego drucianego szpikulca przenieś kilka zwierząt do roztworu: 9 zwierząt daje 1 zwierzęcy odpowiednik genomowego DNA na 0,5 μl lizatu, a 16 zwierząt daje ~1 zwierzęcy odpowiednik genomowego DNA w 0,25 μl (3,5 nicienia / μL) 10, 
	UWAGA: Trudno jest przenieść do tego tomu więcej niż 16 zwierząt.</li>
	<li>Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).</li>
	<li>Umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program lizy ustawiony w kroku 3.1.</li>
	<li>Po zakończeniu programu krótko odwiruj probówkę i umieść ją na lodzie. Dodać 2 μl roztworu neutralizującego z zestawu do mieszaniny. Wymieszać pipetując.</li>
	<li>Krótko odwirować probówkę w temperaturze pokojowej (2-3 s, ≤6 000 obr./min/2 000 × g).</li>
	<li>Bezpośrednio użyj lizy do PCR lub przechowuj ją w temperaturze 4 °C lub -20 °C do wykorzystania w przyszłości. 
	UWAGA: Wyekstrahowane DNA jest stabilne w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy7.</li>
</ol>
4. Reakcja PCR
UWAGA: Opisano jedno z dalszych zastosowań tej techniki lizy robaków, wykrywające mutację delecji za pomocą szybkiej polimerazy. Wykazano również skuteczność dwóch protokołów lizy robaków w wytwarzaniu matrycy genomowej DNA do udanego PCR w rozcieńczeniach do 1/50 robaka na reakcję.
<ol>
	<li>Wyodrębnij DNA z pojedynczego robaka i 16 robaków przy użyciu N2 typu dzikiego i zmutowanych szczepów, jak opisano powyżej w Kroku 2 i Kroku 3.</li>
	<li>Przygotować 2-, 10-, 20- i 50-krotne rozcieńczenia DNA pojedynczego robaka od zwierząt N2 typu dzikiego.</li>
	<li>Skonfigurować reakcje PCR zgodnie z protokołem producenta, używając starterów specyficznych dla sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania i głównej mieszanki PCR na gorąco (Tabela 1 i Tabela 2). Użyć 1 μl nierozcieńczonego DNA lub 2 μl rozcieńczonego DNA jako matrycy w każdej reakcji.</li>
	<li>Potwierdź produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania11.</li>
</ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).</li>
<li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li>
<li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li>
<li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNPs%3A+introduction+and+two-point+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).</li>
<li>Biron, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiron%2C+D+%22C.+elegans%3A+Methods+and+Applications%22">C. elegans: Methods and Applications</a>. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).</li>
<li>Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).</li>
<li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SMA-10%2FLRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).</li>
<li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).</li>
<li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li>
<li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRE-1%2FFBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1%2FBLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li>
<li>Huang, T. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1%2FBlimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).</li>
<li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+the+DBL-1%2FBMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Określenie genotypów C. elegans jest ważnym krokiem podczas wykonywania krzyżówek genetycznych w celu stworzenia nowych szczepów C. elegans . Ekstrakcja genomowego DNA przy użyciu jednego lub kilku C. elegans jest kluczowym krokiem w genotypowaniu C. elegans. Protokół ten opisuje ekstrakcję genomowego DNA z C. elegans przy użyciu komercyjnego zestawu. Ta metoda jest szybka i działa solidnie. Genomowe DNA wyekstrahowane tą metodą może być wykorzystane do dalszych zastosowań, w ...

Tutaj przedstawiono dwa powiązane protokoły lizy Caenorhabditis elegans, aby DNA stało się dostępne dla zastosowań opartych na PCR. PCR jest powszechnie stosowaną techniką molekularną wykorzystywaną do wielu zastosowań, w tym między innymi do genotypowania i amplifikacji fragmentów DNA do klonowania i sekwencjonowania. Mała (1 mm), wolno żyjąca glista C. elegans jest popularnym systemem zwierzęcym do badań biologicznych. Uzyskanie odpowiedniego genomowego DNA od pojedynczego zwierzęcia lub kilku zwierząt jest wystarczające do amplifikacji sekwencji za pomocą PCR. Późne larwy L4 i dorosłe osobniki zawierają tylko ~1,000 komórek somatycznych (w tym niektóre wielojądrowe, poliploidalne komórki), komórki rozrodcze i (jeśli zwierzę jest grawitacyjnym hermafrodytą) potomstwo w macicy1. Jednak zwierzęta te są chronione przez naskórek, który musi zostać przerwany, aby wyodrębnić genomowe DNA2. Standardowe metody przygotowania matrycy genomowego DNA nicieni do PCR obejmują wiele etapów i zajmują kilka godzin. Zwierzęta są najpierw zamrażane w buforze do lizy robaków zawierającym proteinazę K (-70 °C lub niższą) na co najmniej 15-45 minut (dłużej jest zalecane przez niektóre protokoły)3,4,5,6. Ten krok otwiera zwierzęta.
Po zamrożeniu, zwierzęta są inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze 60-65 °C, aby proteinaza K działała, następnie enzym jest inaktywowany przez 15-30 minut w temperaturze 95 °C. Proteinaza K niszczy nukleazy, które degradują DNA. Inaktywacja proteinazy K przed PCR jest ważna, aby zapobiec degradacji polimerazy DNA przez proteinazę K. Opisane tutaj dwa protokoły oparte na zestawach są szybkimi, niezawodnymi i opłacalnymi metodami ekstrakcji genomowego DNA od pojedynczego zwierzęcia lub kilku nicieni do codziennych zastosowań badawczych i dydaktycznych. Używany zestaw został pierwotnie zoptymalizowany przez producenta do ekstrakcji DNA z tkanek zwierzęcych, śliny i włosów7. Wykorzystuje opatentowany roztwór do przygotowania tkanek i roztwór do ekstrakcji w celu lizy komórek i udostępnienia genomowego DNA. Opatentowany roztwór neutralizujący neutralizuje następnie składniki, które mogą hamować PCR (np. sole, jony i cząsteczki wiążące Mg2+).
Podczas genotypowania można przetestować pojedyncze zwierzę. Przy określaniu, czy szczep jest homozygotyczny, testowanie sześciu lub więcej potomstwa z jednego zwierzęcia daje dużą pewność, że linia jest homozygotyczna, czy nie (istnieje 0,02% szansy na losowe wybranie sześciu homozygotycznych zmutowanych potomków od heterozygotycznego rodzica [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Ta metoda 1) jest prosta, składa się z mniejszej liczby etapów niż metoda proteinazy K i 2) skraca czas przygotowania matrycy do 15 minut. Wyniki tej pracy pokazują, że opracowany protokół działa niezawodnie w ekstrakcji genomowego DNA z jednego lub kilku robaków, co może być niezawodnie wykorzystywane do dalszych zastosowań, które nie wymagają wysoce oczyszczonego DNA, w tym PCR.

<table><tbody><tr><td>taśma autoklawu</td><td>Defend</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>folia aluminiowa, wytrzymała</td><td>Reynolds Wrap</td><td>2182934</td><td></td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Millipore Sigma</td><td>102382 (CAS 10035-04-8)</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Extract-N-Amp (zawiera roztwór do przygotowania tkanek, roztwór ekstrakcyjny i roztwór neutralizacyjny)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>XNAT2-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Izotemp płyta grzejna/mieszadło</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-495H</td><td></td></tr><tr><td>LB media, Lennox, kapsułki</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>3002-131</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu, 97% czysty, bezwodny</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td><td></td></tr> <tr><td>mikrowirówka</td><td>Labnet International, Inc.</td><td>PrismR, C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>NEB Q5U Hot Start Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0515S</td> <td>"Pol E" użyty na rysunku uzupełniającym S1, szybka polimeraza o wysokiej wierności (20&ndash; 30 s / kb)</td></tr> <tr><td>NGM w proszku</td><td>US Biological Life Sciences</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF New</td><td>England Biolabs, Inc.</td><td>M0531S</td> <td>"Pol D" na rysunku 1B, szybka polimeraza o wysokiej wierności (15&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>startery</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>niestandardowe oligonukleotydy</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL polimeraza</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>R050B</td> <td>"Pol C" na rysunku 1B, polimeraza o wysokiej wierności (1 min/kb) dla matryc bogatych w GC i matryc do 30 kb</td></tr><tr><td>Szybko ładowana fioletowa drabina DNA o długości 2 log (0,1 i nd; 10.0 kb)</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>RR350A</td> <td>"Pol A" na rysunku 1B, polimeraza stosowana na rysunku 1A, C, D, szybka polimeraza (10 s/kb) dla celów do 5 kb</td></tr><tr><td>Mieszanina reakcyjna Sigma ReadyMix Taq PCR</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>P4600</td><td>"Pol B" na rysunku 1B, polimeraza (1 min/kb) dla celów do 7 kb</td></tr><tr><td>Termocykler SimpliAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24812</td><td></td></tr><tr><td>mieszadło</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-126</td><td></td></tr><tr><td>mieszalnik wirowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>kilof do robaków</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja genomowego dna caenorhabditis elegans na małą skalę

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Ekstrakcja genomowego DNA z jednego lub kilku Caenorhabditis elegans ma wiele dalszych zastosowań, w tym PCR do genotypowania linii, klonowania i sekwencjonowania. Tradycyjne metody ekstrakcji genomowego DNA z C. elegans oparte na proteinazie K trwają kilka godzin. Komercyjne zestawy do ekstrakcji, które skutecznie otwierają naskórek C. elegans i ekstrahują genomowe DNA, są ograniczone. Łatwa, szybsza (~15 min) i opłacalna metoda ekstrakcji genomowego DNA C. elegans, która dobrze sprawdza się w zastosowaniach szkolnych i badawczych, została opisana tutaj. Ta metoda ekstrakcji DNA jest zoptymalizowana pod kątem wykorzystania pojedynczych lub kilku późnych larw (L4) lub dorosłych nicieni jako materiału wyjściowego do uzyskania wiarygodnej matrycy do przeprowadzenia PCR. Wyniki wskazują, że jakość DNA jest odpowiednia do amplifikacji celów genów o różnych rozmiarach za pomocą PCR, co pozwala na genotypowanie pojedynczych lub kilku zwierząt nawet przy rozcieńczeniu do jednej pięćdziesiątej genomowego DNA od pojedynczej osoby dorosłej na reakcję. Zgłoszone protokoły mogą być niezawodnie wykorzystane do szybkiego wytworzenia matrycy DNA z pojedynczej lub małej próbki C. elegans do zastosowań opartych na PCR.

Genomic DNA z pojedynczych lub kilku dorosłych osobników typu dzikiego wyekstrahowano za pomocą komercyjnego zestawu lub tradycyjnego protokołu lizy, aby porównać skuteczność tych dwóch metod. Uzyskane lizaty wykorzystano następnie jako matryce w reakcji PCR w celu amplifikacji większego fragmentu docelowego o długości ~2 100 bp (kodującego blmp-1) lub mniejszego fragmentu docelowego o długości ~500 bp (kodującego fragment sma-10). Obie metody pozwoliły na uzyskanie odpowiednich produktów PCR (<strong c...

Prezentowany tutaj jest opis prostej i stosunkowo szybkiej izolacji genomowego DNA Caenorhabditis elegans od jednego lub kilku zwierząt przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu tkanek. Otrzymany preparat gDNA jest odpowiednią matrycą do PCR.

Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Opracowaliśmy łatwą, szybką i opłacalną metodę ekstrakcji genomowego DNA C.elegans, która doskonale sprawdza się w zastosowaniach szkolnych i badawczych. Protokoły te mogą być niezawodnie wykorzystywane do szybkiego wytwarzania matryc DNA z pojedynczej lub małej próbki C.elegance do zastosowań opartych na PCR. Użytkownicy, którzy nie mają doświadczenia w zbieraniu robaków lub używaniu mikropipetera, mogą mieć trudności z czynnościami wymagającymi tych umiejętności.Obserwowanie wykwalifikowanego praktyka i praktykowanie może pomóc. Procedurę zademonstruje Farhan Lakdawala, starszy doktorant z mojego laboratorium. Aby wyodrębnić DNA z pojedynczego robaka Caenorhabditis elegans, najpierw ustaw program lizy składający się z jednego cyklu w temperaturze 55 stopni Celsjusza na 10 minut, a następnie 95 stopni Celsjusza na trzy minuty w termocyklerze.Aby przygotować roztwór do lizy, najpierw dodaj 0,8 mikrolitra roztworu ekstrakcyjnego z zestawu do wewnętrznej ścianki 0,2 mililitrowej probówki do PCR na lodzie. Następnie dodać 0,2 mikrolitra roztworu do przygotowania tkanek z zestawu do kropli roztworu ekstrakcyjnego i wymieszać przez głaskanie. Przy wyborze robaka do ekstrakcji DNA, najpierw zidentyfikuj L4 lub dorosłe zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym.Hermafrodytę L4 można rozpoznać po charakterystycznym sromie, który jest widoczny jako blade półkole w środku zwierzęcia. Aby zidentyfikować dorosłego hermafrodytę, wybierz jedno z największych zwierząt na płytce, które może mieć owalne zarodki widoczne w macicy. Następnie za pomocą platynowego drucianego wykałacza przenieś wybrane zwierzę do roztworu.Aby zebrać zawartość na dnie probówki, odwiruj probówkę przez dwie do trzech sekund w temperaturze 2000 x g w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę w termocyklerze i uruchom ustawiony wcześniej program lizy. Po zakończeniu tego programu lizy krótko odwiruj probówkę i umieść ją na lodzie.Następnie dodać 0,8 mikrolitra roztworu neutralizacyjnego z zestawu i wymieszać pipetując. Ponownie odwiruj probówkę przez dwie do trzech sekund przy 2000 x g w temperaturze pokojowej. Jeśli lizat nie zostanie natychmiast zużyty, przechowuj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.Aby wyekstrahować DNA z pojedynczego robaka, najpierw ustaw program lizy jednego cyklu na 55 stopni Celsjusza na 10 minut, a następnie 95 stopni Celsjusza na trzy minuty w termocyklerze. Następnie przygotuj roztwór do lizy, najpierw dodając dwa mikrolitry roztworu ekstrakcyjnego z zestawu na wewnętrzną ściankę 0,2 mililitrowej probówki do PCR na lodzie, a następnie dodając 0,5 mikrolitra roztworu do przygotowania tkanek z zestawu do kropelki roztworu ekstrakcyjnego, a następnie wymieszaj zawartość pipetując. Po zidentyfikowaniu L4 lub dorosłych zwierząt, użyj platynowego drucianego szpikulca, aby przenieść odpowiednią liczbę zwierząt do roztworu.Następnie odwiruj probówkę przez dwie do trzech sekund przy 2000 x g w temperaturze pokojowej, a następnie umieść probówkę w termocyklerze i uruchom wcześniej ustawiony program lizy. Po zakończeniu programu krótko odwiruj probówkę i umieść ją na lodzie. Następnie dodać dwa mikrolitry roztworu neutralizacyjnego z zestawu do probówki i wymieszać przez pipetowanie.Ponownie odwiruj probówkę przez dwie do trzech sekund przy 2000 x g w temperaturze pokojowej. Jeśli nie zostanie natychmiast użyty, przechowuj lizat w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Genomowe DNA wyekstrahowane za pomocą protokołu może być z powodzeniem wykorzystane jako matryca PCR, zarówno komercyjny zestaw, jak i tradycyjna metoda proteinazy K wytworzyły DNA o podobnych poziomach amplifikacji PCR produktu 2100 par zasad i produktu 500 par zasad.Opracowana przez zestaw metoda lizy DNA dostarczyła również matryc PCR skutecznych dla różnych enzymów polimerazy DNA. Nawet przy różnych rozcieńczeniach, DNA wyekstrahowane od pojedynczego zwierzęcia za pomocą komercyjnego zestawu wspierało amplifikację PCR fragmentu DNA o parze zasad 2100 z równoważną wydajnością. Jednak amplifikacja fragmentu DNA o długości 500 par zasad zmieniała się w zależności od stężenia matrycy.Przydatność DNA wyekstrahowanego od pojedynczego zwierzęcia lub od wielu zwierząt jako matrycy PCR do określenia genotypu została dodatkowo wykazana przez udaną amplifikację genu i jego zmutowanego wariantu. Ponieważ protokół ten obejmuje pipetowanie małych objętości odczynników, aby zapewnić spójność, należy używać mieszanki wzorcowej do wielu reakcji, dobrej techniki i dobrze skalibrowanych pipet. Również odwirowanie zawartości probówki zapewnia prawidłową lizę.Metoda ta może zostać rozszerzona, dostosowana do ekstrakcji genomowego DNA C. elegans do innych dalszych zastosowań, a także może być wykorzystana do ekstrakcji DNA od innych gatunków nicieni. Biorąc pod uwagę prostotę, szybkość, solidność i niski koszt protokołu, doskonale nadaje się on zarówno do zastosowań badawczych, jak i klasowych, gdzie czas i zasoby są ograniczone.

small-scale-extraction-of-caenorhabditis-elegans-genomic-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Ten film opisuje technikę szybkiego badania pojedynczego nicienia pod kątem markera genetycznego za pomocą badania przesiewowego PCR. W przykładowym protokole przeprowadzamy badania przesiewowe pod kątem edycji genomu opartej na CRISPR.

PCR z pojedynczym robakiem: metoda ekstrakcji i amplifikacji genomowego DNA

Tutaj prezentujemy protokół izolacji RNA, DNA i białka z tej samej próbki, w celu zmniejszenia zmienności, poprawy odtwarzalności i ułatwienia interpretacji.

Połączone ekstrakcje nukleotydów i białek w Caenorhabditis elegans

Ta metoda opisuje protokół wysokoprzepustowego przygotowania ekstraktu białkowego z próbek Caenorhabditis elegans i późniejszej koimmunoprecypitacji.

Preparat ekstraktu białkowego i koimmunoprecypitacja z Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Obecny protokół opisuje procedurę ręcznego izolowania jelit od dorosłych nicieni Caenorhabditis elegans w celu wprowadzenia ich do genomiki, proteomiki, mikrobiomu lub innych testów.

Ręczna sekcja jelit Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Poznaj szybką metodę ekstrakcji DNA genomowego z Caenorhabditis elegans przy użyciu gotowego zestawu do lizy. Ta technika jest idealna do zastosowań PCR w edukacji i badaniach naukowych.

Ekstrakcja genomowego DNA Caenorhabditis elegans na małą skalę

Przeglądaj więcej filmów