Wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych

Opisujemy nasz protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej oraz solidną metodę różnicowania ich w linię mięśni szkieletowych. Technika ta pozwala nam wyizolować mezenchymalne komórki macierzyste o wysokiej żywotności i cieple, przy niewielkim lub zerowym zanieczyszczeniu komórek pochodzenia śródbłonkowego oraz skutecznie indukować różnicowanie miogenne w tych chorobach. Skręcanie sznurka i konsystencja śluzu utrudniają obchodzenie się z przewodem.

Pokazujemy, jak przetwarzać pępowinę, aby nie zeskrobać galaretki Whartona i wykluczyć komórki śródbłonka z populacji. Po pobraniu tkanki pępowinowej w czasie porodu, przenieś kawałek tkanki pępowinowej z probówki do naczynia poddanego hodowli tkankowej o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych i dokładnie umyj tkankę świeżym PBS. Aby zadbać o skręt pępowiny i powierzchnię śluzową, przypnij tkankę za pomocą kleszczy trzymanych w jednej ręce.

Za pomocą skalpela przetnij tkankę pępowinową pionowo wzdłuż jej podłużnego dostępu, aby uzyskać dwa półcylindryczne kawałki. W tym momencie obserwuj tętnice i żyły pępowinowe. Za pomocą skalpela usuń naczynia krwionośne, zeskrobując je w jednym kierunku z powierzchni i przepłucz tkankę pępowinową w PBS, aby usunąć całą pozostałość krwi związaną z tkanką.

Zmiel każdą połówkę tkanki pępowinowej na fragmenty o wielkości 0,5 centymetra sześciennego. Umieść fragmenty powierzchnią świecącą skierowaną w dół na naczyniu i krótko inkubuj naczynie przez 10 minut. Pod koniec inkubacji delikatnie dodać 20 mililitrów pożywki zawierającej modyfikację MEM Alpha wzdłuż boków naczynia zawierającego tkankę pępowinową.

Upewnij się, że eksplantaty nie zostały wyjęte z ich orientacji i dodaj nadmiar pożywki, aby uwzględnić frakcję, którą eksplantaty tkankowe wchłoną podczas inkubacji. Następnie umieść naczynie w inkubatorze na trzy dni. Po zakończeniu inkubacji dodaj świeże podłoże do kultury i upewnij się, że kultury są chronione przed wstrząsami i ruchem eksplantatów podczas obchodzenia się z szalkami.

Po tygodniu, za pomocą sterylnych kleszczy, usuń fragmenty tkanek pojedynczo i wyrzuć je za pomocą odpowiednich worków na zagrożenia biologiczne do utylizacji. Zachowaj istniejące podłoże i dodaj 10 mililitrów świeżego podłoża wzrostowego. Wymieniaj pożywkę wzrostową co cztery dni, aż poszczególne kolonie osiągną zbieg 70%Po wybarwieniu komórek zgodnie z opisem w manuskrypcie, przeanalizuj znakowane komórki za pomocą cytometrii przepływowej i określ procent komórek CD105, CD90 dodatnich i CD105 CD73 dodatnich.

Analizuj oddzielnie komórki dodatnie CD105 i CD34 CD45. Pokryj płytkę do hodowli tkankowej 0,01% kolagenu i 20 mikrogramów na mililitr lamininy w PBS i umieść ją na bujaczku na co najmniej cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usuń kolagen i umyj płytkę PBS, a następnie płytkę uMSC o gęstości 10 000 komórek na centymetr kwadratowy w pożywce wzrostowej.

Gdy komórki osiągną 70% zbieżności, odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie przepłukać płytkę hodowlaną PBS. Aby określić kinetykę progresji miogennej, dodawaj pożywkę M1 co drugi dzień do kultur i analizuj uMSC pod kątem ekspresji łańcucha ciężkiego pax7, MyoD, miogeniny i miozyny odpowiednio po dwóch dniach, czterech do pięciu dniach, sześciu do siedmiu dniach i dziesięciu do czternastu dni. uMSC wykazują ekspresję CD105 i CD90 i nie wykazują ekspresji markerów krwiotwórczych CD34 i CD45.

UMSCs były również dodatnie pod względem ekspresji markera uMSCs CD73, co wskazuje, że uMSCs wykazywały ekspresję wielu kluczowych markerów. uMSCs wykazywały ekspresję pax7 w ciągu pierwszych dwóch dni od dodania M1, a następnie ekspresję MyoD w ciągu pierwszych czterech dni po dodaniu M1. Komórki wyrażają białko miogeniny po sześciu dniach różnicowania, po którym następuje ekspresja łańcucha ciężkiego miozyny między 10 a 14 dniem od indukcji różnicowania.

970 genów zostało podwyższonych w odpowiedzi na indukcję różnicowania miogennego w porównaniu z niezróżnicowanymi uMSC. Więcej genów miogennych było regulowanych w górę w uMSC pochodzących z tkanki pępowinowej w porównaniu z uMSC pochodzącymi z krwi pępowinowej. Zarówno tkanka pępowinowa, jak i krew pępowinowa wykazywały regulację w górę genów związanych z białkami cytoszkieletu, związanymi z wiązaniem aktyny i składaniem sarkomerów, transporterami związanymi z funkcją skurczu, utrzymaniem masy mięśniowej, sygnalizacją wapnia i funkcją enzymatyczną.

Zebrać tkankę w warunkach aseptycznych i utrzymać sterylną hodowlę. Sznur powinien być zewnętrznie zamiatany 70% etanolem i przetwarzany tak szybko, jak to możliwe. Wiele terapii regeneracyjnych wymaga dużej liczby komórek z wczesnych pasaży.

Może być również używany jako model do naśladowania całego suchego środowiska i odzwierciedlania metabolizmu poporodowego.