Name: Wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj izolację mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek przy minimalnym zanieczyszczeniu komórek śródbłonka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu Ojas Tikoo za pomoc w filmowaniu i produkcji wideo. Dziękujemy również za pomoc otrzymaną od personelu GARBH-Ini (Interdyscyplinarna Grupa ds. Zaawansowanych Badań i Wyników Porodu - DBT India), pielęgniarek i starszych pracowników naukowych w Szpitalu Cywilnym Gurugram oraz dr Pallavi Kshetrapal za pomoc w logistyce. Prace te zostały wsparte grantami przyznanymi Suchitrze Gopinath z Wydziału Biotechnologii w Indiach (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Użycie tkanki pępowinowej w tym badaniu zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Badań nad Komórkami Macierzystymi (IC-SCR), Instytucjonalną Komisję Etyki, Instytut Nauki i Technologii Zdrowia Translacyjnego (IEC-THSTI), Instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Cywilnego, Gurugram, Haryana, oraz Instytucjonalną Komisję Bezpieczeństwa Biologicznego, THSTI. Próbki tkanki pępowinowej pobrano z porodów donoszonych w momencie porodu. Uzyskano świadomą pisemną zgodę od uczestników. Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.
1. Izolacja MSCs z tkanki pępowinowej
<ol>
	<li>W momencie porodu odetnij co najmniej 5 cm pępowiny, najlepiej bliżej łożyska, i wysterylizuj pępowinę, przecierając zewnętrzną powierzchnię 70% etanolem. Przenieść kawałek tkanki pępowinowej sekwencyjnie z jednej probówki o pojemności 50 ml zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do innej zawierającej to samo. Przetransportować probówkę z imieniem i nazwiskiem pacjenta na lodzie do laboratorium w ciągu 1 godziny 
	UWAGA: W przypadku większego badania przydatne może być oznaczenie próbek kodem kreskowym, aby umożliwić ich śledzenie przez cały czas trwania badania. Co ważne, cały personel mający kontakt z tkankami ludzkimi powinien otrzymać pełny schemat szczepienia przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.</li>
	<li>W laboratorium włącz UV na 25 minut w okapie BSL-2, aby wysterylizować autoklawowane narzędzia i pipety przed użyciem.</li>
	<li>Przenieś fragment tkanki pępowinowej z probówki zbiorczej do naczynia o długości 10cm2 poddanego kulturze tkankowej zawierającej PBS wzbogacony o 5 g / l glukozy, 50 μg / ml gentamycyny, 2,5 μg / ml amfoterycyny B, 100 U / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny (schemat w <silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Za pomocą skalpela przetnij tkankę pępowinową pionowo wzdłuż jej osi podłużnej, aby uzyskać dwa półcylindryczne kawałki. Ze względu na skręt rdzenia i powierzchnię śluzowatą, przygwoźdź tkankę za pomocą kleszczy trzymanych w drugiej ręce.</li>
	<li>W tym momencie obserwuj tętnice pępowinowe i żyłę i usuń naczynia krwionośne za pomocą skalpela, aby zeskrobać je w jednym kierunku od powierzchni. Ponownie przepłucz tkankę pępowinową w PBS, aby usunąć całą pozostałość krwi związaną z tkanką. Upewnij się, że skrobanie jest delikatne, aby zachować integralność komórek w WJ otaczających naczynia.</li>
	<li>Zmiel każdą połówkę tkanki pępowinowej na 0,5 cm 3 kawałki i umieść je powierzchnią światła skierowaną w dół na naczyniu. Inkubować naczynie krótko przez 10 minut w komorze nawilżanej o temperaturze 37 °C zawierającej 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji zalać szalkę zawierającą fragmenty tkanki pępowinowej 20 ml pożywki zawierającej modyfikację MEM Alpha bez L-glutaminy, rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów, 15% płodowej surowicy bydlęcej (nieinaktywowanej termicznie) i 50 μg/ml gentamycyny. Delikatnie dodaj pożywkę wzrostową wzdłuż boków, aby zapobiec wyparciu eksplantatów tkanek z ich orientacji. Dodać nadmiar pożywki, aby uwzględnić frakcję, która zostanie wchłonięta przez eksplantaty tkanek podczas inkubacji.</li>
	<li>Po 3 dniach inkubacji dodaj świeże podłoże do kultur. Upewnij się, że kultury są chronione przed wstrząsami i ruchem eksplantatów podczas obchodzenia się z naczyniami.</li>
	<li>Po 1 tygodniu usuń fragmenty tkanek pojedynczo za pomocą sterylnych kleszczy i wyrzuć za pomocą odpowiednich worków na zagrożenia biologiczne w celu usunięcia. Zachowaj istniejącą pożywkę i dodaj 10 ml świeżej pożywki. Pożywkę należy wymieniać co 4 dni, aż poszczególne kolonie osiągną zbieżność 70%. 
	UWAGA: Jest prawdopodobne, że komórki nie będą równomiernie rozmieszczone w całej naczyniu, ponieważ będą istniały indywidualne kolonie proliferacyjne, które będą musiały być monitorowane pod kątem zbiegania się z czasem. Ogólnie rzecz biorąc, w ciągu miesiąca szalka o długości 10cm2 generuje wystarczającą ilość komórek, aby można je było podzielić na osobne naczynie.</li>
	<li>Zbierz przylegające komórki za pomocą roztworu trypsyny/EDTA (1x 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA w zrównoważonym roztworze soli Hanksa [HBSS]). Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 470 × g przez 5 minut w temperaturze 25 °C i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce wzrostowej.</li>
</ol>
2. Immunofenotypowanie i rozmnażanie uMSCS
<ol>
	<li>Przejdź do immunofenotypowania, gdy przylegające komórki osiągną 50%-60% konfluencji i są dobrze rozprowadzone. Nie należy wykonywać analizy markerów MSC na w pełni zlewających się kulturach, ponieważ ma to tendencję do obniżania poziomu kluczowych markerów MSC.</li>
	<li>Po trypsynizacji rozprowadzić zawiesinę komórek 1 × 106 komórek/ml w probówkach FACS (1 × 105 komórek/probówkę) i wybarwić odpowiednimi przeciwciałami związanymi z fluoroforem (wszystkie rozcieńczenie 1:50) w połączeniu: niebarwiony; CD105 + CD90; CD105 + CD73; Płyta CD105; Płyta CD90; Płyta CD73; CD34 + CD45 (powszechny fluorofor); kontrole izotypu dla każdego fluoroforu. Zapisz łączną liczbę zdarzeń wynoszącą co najmniej 10 000 na cytometrze przepływowym w celu dalszej analizy. 
	UWAGA: Ponieważ komórki są analizowane osobno dla każdego znacznika powierzchni, bramkowanie na podzbiorach komórek nie jest wymagane.</li>
	<li>Oprócz powyższych markerów należy potwierdzić obecność dodatnich i ujemnych markerów powierzchniowych w liniach uMSC utworzonych z pojedynczych próbek tkanki pępowinowej (tab. 1).</li>
	<li>Przeanalizuj znakowane komórki za pomocą cytometrii przepływowej i określ procent komórek CD105 + CD90 + i CD105 + CD73 +. Analizuj oddzielnie komórki CD105+ i CD34−CD45−.</li>
</ol>
3. Różnicowanie uMSC w mięśnie szkieletowe
<ol>
	<li>Pokryj płytki do hodowli tkankowych 0,01% kolagenu i 20 μg/ml lamininy w PBS. Talerze te należy pokrywać przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płytki uMSC o gęstości 10 000 komórek/cm2 w pożywce wzrostowej.</li>
	<li>Gdy komórki są w 70% zlewne, odessać pożywkę wzrostową i przepłukać kultury 2x PBS. Dodać miogenną pożywkę różnicującą (M1) składającą się z DMEM + 5% surowicy końskiej + 0,1 μM deksametazonu + 50 μM hydrokortyzonu do uMSC. W celu określenia kinetyki progresji miogennej należy dodawać pożywkę M1 co drugi dzień do kultur.</li>
	<li>Aby określić kinetykę progresji miogennej, przeanalizuj uMSC pod kątem ekspresji Pax7, MyoD, Myogenin i MyHC odpowiednio po 2 dniach, 4-5 dniach, 6-7 dniach i 10-14 dniach.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Kroki krytyczne Kluczowym krokiem w tym protokole jest pobieranie tkanek w warunkach aseptycznych, od momentu dostarczenia do utrzymania sterylnych kultur, przez cały czas rozmnażania. Podczas pobierania pępowiny ważne jest, aby pępowina nie dotykała żadnej niewysterylizowanej powierzchni i była zewnętrznie przecierana 70% etanolem przed pobraniem do probówek zawierających PBS uzupełniony antybiotykami. Ważne jest, aby ograniczyć czas między pobraniem pępowiny a przetworzeniem tkanki w celu izolacji...

Ludzka pępowina została uznana za posiadającą solidny rezerwuar mezenchymalnych komórek macierzystych, które są obecnie badane pod kątem terapii regeneracyjnych ze względu na ich wysokie tempo proliferacji i różnicowania, właściwości immunomodulacyjne i zdolność do generowania komórek ze wszystkich trzech listków zarodkowych1. Tkanka pępowinowa składa się z wielu przedziałów, takich jak krew pępowinowa, podśródbłonek żyły pępowinowej i galaretka Whartona (WJ), która sama w sobie obejmuje trzy niewyraźne obszary - strefę okołonaczyniową, strefę międzynaczyniową i sub-owodnię lub wyściółkę pępowiny (CL)2. Chociaż uMSC mogą być izolowane ze wszystkich tych różnych regionów i szeroko wyrażać kluczowe markery MSC, nie ma jasności co do tego, czy te przedziały zawierają tę samą populację uMSC, czy też wykazują różnice w ich potencjach różnicowania3. W związku z tym protokoły izolacji uMSC wymagają większej precyzji w ich trybie i regionie izolacji, solidnej charakterystyki potencjałów różnicowania i wreszcie analizy porównawczej z różnych przedziałów pępowiny. 
W tym kontekście, niewiele badań wykazało różnice w potencjale proliferacyjnym i różnicującym uMSC między różnymi częściami rdzenia. Spośród nich analizy porównawcze między uMSC wyizolowanymi z regionów CL i WJ wykazały większy potencjał proliferacyjny w uMSCs pochodzących z CL3,4. W innym badaniu uMSC pochodzące z WJ osiągały lepsze wyniki w testach proliferacji w porównaniu z komórkami okołonaczyniowymi (HUCPV) 5. Badając różnice między uMSC pochodzącymi z krwi pępowinowej a uMSC pochodzącymi z tkanki pępowinowej pozbawionymi zanieczyszczenia naczyniowego, stwierdzono różnicową ekspresję kluczowych markerów MSC między tymi dwoma przedziałami, a także zwiększone tempo proliferacji w uMSC pochodzących z tkanki pępowinowej6. 
Spośród kilku badań badających potencjał różnicowania uMSC, głównie w tkankach linii mezodermy, takich jak linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne, bardzo niewiele dostarczyło szczegółowych protokołów różnicowania miogennego i późniejszej charakterystyki, a także analiz porównawczych między różnymi przedziałami pępowiny. W tym kontekście opracowaliśmy solidny protokół różnicowania mięśni i zaobserwowaliśmy, że uMSC pochodzące z tkanki pępowinowej wykazują lepsze zdolności różnicowania miogennego w porównaniu z krwią pępowinową6. W tym miejscu szczegółowo opisano protokół krokowy izolacji uMSC z całej tkanki pępowinowej pozbawionej komórek związanych z naczyniem, ich charakterystyki i różnicowania się w linię miogenną.

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotyku 100x Płyn, testowany pod kątem endotoksyn (10 000 U penicylina i 10 mg Streptomycyna / ml w 0,9% normalnej soli fizjologicznej)</td> <td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GAPDH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MyHC (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MyoD (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-miogeninowe (klon F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Pax7</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC Mysz anty-ludzka klon CD90 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II lub FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana Brazylia</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td> nie <td>być inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>Mysz FITC anty-ludzka Klon CD106 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka klon CD14 M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzki klon CD31 WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka klon CD34 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka klon CD45 HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Mysz FITC anty-ludzki klon CD49D 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka klon CD90 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzki klon HLA-A,B,C G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka klon IgG G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie FlowJo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alfa Modyfikacja bez L-glutaminy, rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów</td><td>Hyclon</td><td>SH30568. FS</td><td>Podłoże podstawowe dla uMSCs</td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka klon CD105 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz antyludzka klon CD44 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz antyludzka klon CD49E llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka klon IgG G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mysz anty-ludzka CD73 CLONE AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH = 7,4</td><td>HiMedia</td><td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA (1x 0,25% trypsyny i 0,02% EDTA w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS)</td><td>HiMedia</td><td>TCL049-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

Badanie potencjału terapeutycznego mezenchymalnych komórek macierzystych zależy od łatwości izolacji, zdolności do różnicowania oraz niezawodności i odporności źródła. Opisujemy tutaj krokowy protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej (uMSC), ich immunofenotypowania oraz namnażania takich kultur przez kilka pasaży. W tej procedurze żywotność uMSC jest wysoka, ponieważ nie zachodzi trawienie enzymatyczne. Ponadto usunięcie naczyń krwionośnych, w tym tętnic pępowinowych i żyły, zapewnia, że nie dochodzi do zanieczyszczenia komórek pochodzenia śródbłonkowego. Stosując cytometrię przepływową, uMSC po izolacji są CD45−CD34−, co wskazuje na brak komórek z linii krwiotwórczej. Co ważne, wyrażają one kluczowe znaczniki powierzchni, CD105, CD90 i CD73. Po założeniu kultur w artykule opisano skuteczną metodę indukowania różnicowania tych uMSC w linię mięśni szkieletowych. Szczegółowa analiza progresji miogennej w zróżnicowanych uMSC ujawnia, że uMSC wyrażają Pax7, marker dla miogennych przodków w początkowych stadiach różnicowania, następnie ekspresję MyoD i Myf5, a na końcu końcowy marker różnicowania, łańcuch ciężki miozyny (MyHC).

Skuteczność izolacji uMSC z tkanki pępowiny wynosi &gt;95%, w przeciwieństwie do niskich wskaźników sukcesu przy użyciu krwi pępowinowej. Po pomyślnej izolacji uMSC analiza FACS wykazuje, że wszystkie komórki są CD34−CD45−CD105+CD90+. Jednak w analizie porównawczej uMSC izolowane z krwi pępowinowej wykazują heterogeniczne populacje, w których część komórek wykazuje CD34+CD45+CD105+ (~15%). Dodatkowo, komórki podwójnie dodatnie CD105+C...

Opisujemy protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowania w linię mięśni szkieletowych.

Wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Opisujemy nasz protokół izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej oraz solidną metodę różnicowania ich w linię mięśni szkieletowych. Technika ta pozwala nam wyizolować mezenchymalne komórki macierzyste o wysokiej żywotności i cieple, przy niewielkim lub zerowym zanieczyszczeniu komórek pochodzenia śródbłonkowego oraz skutecznie indukować różnicowanie miogenne w tych chorobach. Skręcanie sznurka i konsystencja śluzu utrudniają obchodzenie się z przewodem.Pokazujemy, jak przetwarzać pępowinę, aby nie zeskrobać galaretki Whartona i wykluczyć komórki śródbłonka z populacji. Po pobraniu tkanki pępowinowej w czasie porodu, przenieś kawałek tkanki pępowinowej z probówki do naczynia poddanego hodowli tkankowej o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych i dokładnie umyj tkankę świeżym PBS. Aby zadbać o skręt pępowiny i powierzchnię śluzową, przypnij tkankę za pomocą kleszczy trzymanych w jednej ręce.Za pomocą skalpela przetnij tkankę pępowinową pionowo wzdłuż jej podłużnego dostępu, aby uzyskać dwa półcylindryczne kawałki. W tym momencie obserwuj tętnice i żyły pępowinowe. Za pomocą skalpela usuń naczynia krwionośne, zeskrobując je w jednym kierunku z powierzchni i przepłucz tkankę pępowinową w PBS, aby usunąć całą pozostałość krwi związaną z tkanką.Zmiel każdą połówkę tkanki pępowinowej na fragmenty o wielkości 0,5 centymetra sześciennego. Umieść fragmenty powierzchnią świecącą skierowaną w dół na naczyniu i krótko inkubuj naczynie przez 10 minut. Pod koniec inkubacji delikatnie dodać 20 mililitrów pożywki zawierającej modyfikację MEM Alpha wzdłuż boków naczynia zawierającego tkankę pępowinową.Upewnij się, że eksplantaty nie zostały wyjęte z ich orientacji i dodaj nadmiar pożywki, aby uwzględnić frakcję, którą eksplantaty tkankowe wchłoną podczas inkubacji. Następnie umieść naczynie w inkubatorze na trzy dni. Po zakończeniu inkubacji dodaj świeże podłoże do kultury i upewnij się, że kultury są chronione przed wstrząsami i ruchem eksplantatów podczas obchodzenia się z szalkami.Po tygodniu, za pomocą sterylnych kleszczy, usuń fragmenty tkanek pojedynczo i wyrzuć je za pomocą odpowiednich worków na zagrożenia biologiczne do utylizacji. Zachowaj istniejące podłoże i dodaj 10 mililitrów świeżego podłoża wzrostowego. Wymieniaj pożywkę wzrostową co cztery dni, aż poszczególne kolonie osiągną zbieg 70%Po wybarwieniu komórek zgodnie z opisem w manuskrypcie, przeanalizuj znakowane komórki za pomocą cytometrii przepływowej i określ procent komórek CD105, CD90 dodatnich i CD105 CD73 dodatnich.Analizuj oddzielnie komórki dodatnie CD105 i CD34 CD45. Pokryj płytkę do hodowli tkankowej 0,01% kolagenu i 20 mikrogramów na mililitr lamininy w PBS i umieść ją na bujaczku na co najmniej cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usuń kolagen i umyj płytkę PBS, a następnie płytkę uMSC o gęstości 10 000 komórek na centymetr kwadratowy w pożywce wzrostowej.Gdy komórki osiągną 70% zbieżności, odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie przepłukać płytkę hodowlaną PBS. Aby określić kinetykę progresji miogennej, dodawaj pożywkę M1 co drugi dzień do kultur i analizuj uMSC pod kątem ekspresji łańcucha ciężkiego pax7, MyoD, miogeniny i miozyny odpowiednio po dwóch dniach, czterech do pięciu dniach, sześciu do siedmiu dniach i dziesięciu do czternastu dni. uMSC wykazują ekspresję CD105 i CD90 i nie wykazują ekspresji markerów krwiotwórczych CD34 i CD45.UMSCs były również dodatnie pod względem ekspresji markera uMSCs CD73, co wskazuje, że uMSCs wykazywały ekspresję wielu kluczowych markerów. uMSCs wykazywały ekspresję pax7 w ciągu pierwszych dwóch dni od dodania M1, a następnie ekspresję MyoD w ciągu pierwszych czterech dni po dodaniu M1. Komórki wyrażają białko miogeniny po sześciu dniach różnicowania, po którym następuje ekspresja łańcucha ciężkiego miozyny między 10 a 14 dniem od indukcji różnicowania.970 genów zostało podwyższonych w odpowiedzi na indukcję różnicowania miogennego w porównaniu z niezróżnicowanymi uMSC. Więcej genów miogennych było regulowanych w górę w uMSC pochodzących z tkanki pępowinowej w porównaniu z uMSC pochodzącymi z krwi pępowinowej. Zarówno tkanka pępowinowa, jak i krew pępowinowa wykazywały regulację w górę genów związanych z białkami cytoszkieletu, związanymi z wiązaniem aktyny i składaniem sarkomerów, transporterami związanymi z funkcją skurczu, utrzymaniem masy mięśniowej, sygnalizacją wapnia i funkcją enzymatyczną.Zebrać tkankę w warunkach aseptycznych i utrzymać sterylną hodowlę. Sznur powinien być zewnętrznie zamiatany 70% etanolem i przetwarzany tak szybko, jak to możliwe. Wiele terapii regeneracyjnych wymaga dużej liczby komórek z wczesnych pasaży.Może być również używany jako model do naśladowania całego suchego środowiska i odzwierciedlania metabolizmu poporodowego.

generation-mesenchymal-stem-cells-from-human-umbilical-cord-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Izolacja dorosłych komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórek do kolby.

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Tutaj proponujemy protokół chondrogenicznego różnicowania od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.

Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

Ludzka pępowina (UC) może być uzyskana w okresie okołoporodowym w wyniku porodu przedwczesnego, terminowego i poterminowego. W tym protokole opisujemy izolację i charakterystykę mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z WZJG (UC-MSC) od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Poznaj izolację mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych. Ta metoda zapewnia wysoką żywotność komórek przy minimalnym zanieczyszczeniu komórek śródbłonka.

Wytwarzanie mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkiej tkanki pępowinowej i ich różnicowanie w linię mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów