Name: Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj model zPDX z przeszczepami tkanek nowotworowych pacjentów do Danio rerio w celu oceny wrażliwości na chemioterapię. Metoda zachowuje mikrośrodowisko guza i pozwala przewidywać odpowiedź pacjenta w ciągu tygodnia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Fondazione Pisa (projekt 114/16). Autorzy pragną podziękować Raffaele Gaeta z Oddziału Histopatologii Azienda Ospedaliera Pisana za wybór próbki pacjenta i wsparcie patologiczne. Dziękujemy również Alessii Galante za wsparcie techniczne w eksperymentach. Ten artykuł jest oparty na pracy przeprowadzonej przez COST Action TRANSPAN, CA21116, wspieranej przez COST (Europejska Współpraca w Nauce i Technologii).

Włoskie Ministerstwo Zdrowia Publicznego zatwierdziło wszystkie opisane doświadczenia na zwierzętach, zgodnie z Dyrektywą 2010/63/UE w sprawie wykorzystywania zwierząt i opieki nad nimi. Lokalna Komisja Etyczna zatwierdziła badanie pod numerem rejestracyjnym 70213. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników badania. Przed rozpoczęciem należy przygotować wszystkie roztwory i sprzęt (sekcja 1) i skrzyżować ryby (sekcja 2).
1. Przygotowanie roztworów i sprzętu
UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby zapoznać się z rozwiązaniami i mediami, które należy przygotować.
<ol>
	<li>Wsparcie w żelu agarozowym
	<ol>
		<li>Zważyć proszek agarozy w kolbie nadającej się do kuchenki mikrofalowej i rozpuścić go w określonej objętości pożywki E3 dla danio pręgowanego, aby uzyskać 1% żel. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. 
		UWAGA: Nie przegotuj roztworu.</li>
		<li>Wlej stopioną agarozę na szalkę Petriego i poczekaj, aż żel całkowicie stwardnieje.</li>
		<li>Wykonaj małe cylindry z agarozy (o wysokości ~5 mm) za pomocą plastikowej pipety Pasteura z odciętą końcówką. Po przygotowaniu przechowywać na szalce Petriego w temperaturze 4 °C, zawinięta w folię aluminiową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroigły szklane
	<ol>
		<li>Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza, aby uzyskać drobne igły (ustawienia: HEAT 990, PULL 550). 
		UWAGA: Z jednej kapilary można uzyskać dwie cienkie igły o średnicy końcówki 10 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przejście dla ryb i zbieranie jaj
<ol>
	<li>Przenieś dorosłe ryby do zbiorników hodowlanych 3 dni przed implantacją tkanki, zgodnie z opisem Avdesh et al.17.</li>
	<li>UWAGA: Zalecany jest stosunek 1:1 lub 2:3 mężczyzn do kobiet. Zagęszczenie ryb powinno wynosić maksymalnie pięć ryb na litr wody. Samce i samice należy oddzielać barierą na noc.</li>
	<li>Następnego dnia usuń barierę i pozwól rybie na kopulację.</li>
	<li>Usuń ryby ze zbiorników hodowlanych i włóż je z powrotem do zbiorników mieszkalnych.</li>
	<li>Wlej wodę ze zbiornika hodowlanego przez siatkę o drobnych oczkach. Przenieś zapłodnione jaja na szalkę Petriego z podłożem E3 dla danio pręgowanego.</li>
	<li>Sprawdź szalkę Petriego za pomocą mikroskopu stereoskopowego i wyrzuć mętne jaja. Zapłodnione jaja należy przechowywać w świeżym podłożu E3 dla danio pręgowanego w temperaturze 28 °C.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek
UWAGA: Kleszcze do autoklawu i uchwyt do skalpela.
<ol>
	<li>Natychmiastowe przetwarzanie
	<ol>
		<li>Pobrać próbkę chirurgiczną guza w 10 ml pożywki nowotworowej w temperaturze 4 °C (próbka guza o średnicy od 5 mm do 10 mm). Przenieść próbkę w temperaturze 4 °C z żądanego miejsca do natychmiastowego przetworzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie przez noc (opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Pobrać chirurgiczną próbkę guza w 10 ml pożywki nowotworowej i przechowywać próbkę przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie w temperaturze -80 °C (opcjonalnie, najmniej zalecane)
	<ol>
		<li>Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C w fiolce kriogenicznej z pożywką nowotworową uzupełnioną 5% dimetylosulfotlenkiem (DMSO).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie próbek
UWAGA: Wykonaj te kroki pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Umyj całą tkankę nowotworową 5 ml świeżej pożywki nowotworowej, pipetując 10 razy w górę iw dół za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Odessać i wyrzucić środek myjący. Powtórz ten krok 3x. 
	UWAGA: Należy unikać aspiracji tkanki nowotworowej, ponieważ może ona pozostać przymocowana do plastikowej pipety Pasteura.</li>
	<li>Przenieś próbkę na szalkę Petriego i zanurz ją w 1-2 ml świeżej pożywki nowotworowej. Pokrój próbkę guza na małe kawałki (1-2 mm3) za pomocą ostrza skalpela i umieść je w sterylnej plastikowej probówce o pojemności 5 ml z pożywką nowotworową.</li>
	<li>Ustaw rozdrabniacz do tkanek McIlwain na grubość 100 μm. Umieść fragmenty próbki na okrągłym plastikowym stole rozdrabniacza i posiekaj je. Obróć stół o 90° i powtórz siekanie.</li>
	<li>Odwirować fragmenty w temperaturze 300 × g przez 3 minuty. Następnie ostrożnie odessać supernatant i wyrzucić go.</li>
	<li>Inkubować fragmenty za pomocą fluorescencyjnego urządzenia do śledzenia komórek, CM-DiI (końcowe stężenie 10 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco [DPBS]), Deep Red (końcowe stężenie 1 μL/ml w DPBS) lub CellTrace (końcowe stężenie 5 μM w DPBS) przez 30 minut, umieszczając probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zawiesić fragmenty, delikatnie pipetując w górę i w dół co 10 minut. 
	UWAGA: W przypadku CellTrace pod koniec inkubacji dodać pożywkę zawierającą co najmniej 1% białka, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 3 minuty i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok 3 razy z 1 ml DPBS, aby usunąć niezmieszany barwnik.</li>
	<li>Zawiesić fragmenty w 5 ml DPBS na szalce Petriego o średnicy 60 mm. 
	UWAGA: Upewnij się, że chusteczka nie wysycha.</li>
</ol>
5. Założenie zPDX
UWAGA: Wykonaj te kroki pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Zarodki należy znieczulić 2 dni po zapłodnieniu (dpf) 0,16 mg/ml trikainy w pożywce E3 dla danio pręgowanego.</li>
	<li>Umieścić trzy cylindry agarozy (krok 1.1.3) na szalce Petriego i położyć zarodek danio pręgowanego na cylindrze, odsłaniając jedną stronę. Usuń nadmiar roztworu, aby utrzymać zarodek w cienkiej warstwie.</li>
	<li>Przenieś kawałek zabarwionej tkanki za pomocą sterylnych kleszczyków z szalki Petriego na 1% podporę agarozy, w której leży zarodek. Podnieś tkankę, połóż ją na żółtku zarodka, a następnie wepchnij ją do przestrzeni okołowitelowej za pomocą mikroigły szklanej ciągniętej na gorąco (krok 1.2.1).</li>
	<li>Delikatnie dodaj kilka kropli E3 1% penicyliny-streptomycyny (Pen-Strep) do zarodka, aby wprowadzić go z powrotem do płynu.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.2-5.4 dla wszystkich zarodków, a na koniec usunąć podpory agarozy z szalki Petriego i inkubować zarodki w temperaturze 35 °C.</li>
	<li>Sprawdzić zarodki pod kątem prawidłowych ksenoprzeszczepów (barwienie dodatnie) 2 godziny po implantacji za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Wyrzuć zarodki z fragmentami guza, które nie znajdują się całkowicie w przestrzeni okołowitelicznej, a także martwe zarodki. Losowo rozmieścić zarodki na sześciu płytkach wielodołkowych (maksymalnie n = 20 zarodków/basenik), równo podzielonych na grupy zgodnie z planem eksperymentalnym (np. kontrola i FOLFOXIRI).</li>
</ol>
6. Leczenie
<ol>
	<li>Rozcieńczyć lek (np. 5-fluorouracyl, oksaliplatynę, irynotekan) do E3 1% Pen-Strep, dokładnie mieszając, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Zgodnie z propozycją Usai et al.12, należy użyć pięciokrotnego rozcieńczenia leku w wodzie dla ryb, w odniesieniu do równoważnego stężenia w osoczu (EPC).</li>
	<li>Wymieszaj leki, aby przygotować koktajl (np. FOLFOXIRI).</li>
	<li>Usuń pożywkę z każdej studzienki i dodaj koktajl leków 2 godziny po implantacji.</li>
	<li>Traktuj zarodki przez 3 dni. Codziennie odnawiaj koktajl leków.</li>
</ol>
7. Barwienie immunofluorescencyjne w całości
UWAGA: Zanim zaczniesz, umieść aceton w temperaturze -20 °C i przygotuj roztwory wymienione w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Dzień 1:
	<ol>
		<li>Utrwalić larwy za pomocą 1 ml 4% paraformaldehydu w szklanych fiolkach w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2:
	<ol>
		<li>Przemyć larwy 3 x 5 min 1 ml PBS, delikatnie mieszając na kołysce platformy laboratoryjnej (400 obr./min).</li>
		<li>Przechowywać w 1 ml 100% metanolu w temperaturze -20 °C przez noc (lub do długotrwałego przechowywania).</li>
		<li>Nawadniaj 3 x 10 minut za pomocą 1 ml PTw (0,1% tween w PBS), delikatnie mieszając na kołysce platformy laboratoryjnej (400 obr./min).</li>
		<li>Przepuszczalność 1 ml 150 mM Tris-HCl o pH 8,8 przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ogrzewanie przez 15 minut w temperaturze 70 °C.</li>
		<li>Przemyć 2 x 10 min 1 ml PTw, delikatnie mieszając na bujaku platformy laboratoryjnej (400 obr./min).</li>
		<li>Przemyć 2 x 5 min 1 ml dH2O, delikatnie mieszając na bujaku platformy laboratoryjnej (400 obr./min).</li>
		<li>Przepuszczać przez 1 ml lodowatego acetonu przez 20 minut w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przemyć 2 x 5 min 1 ml dH2O, delikatnie mieszając na bujaku platformy laboratoryjnej (400 obr./min).</li>
		<li>Umyć 2 x 5 min 1 ml PTw, delikatnie mieszając na bujaku platformy laboratoryjnej (400 obr./min).</li>
		<li>Inkubować larwy w 1 ml buforu blokującego przez 3 godziny w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając na kołysce platformy laboratoryjnej (400 obr./min).</li>
		<li>Umieścić larwy na płytkach studzienkowych podzielonych na grupy w następujący sposób: 10 larw w 50 μl objętości/studzienka na płytce 96-dołkowej lub 20 larw w 100 μl objętości/studzienki na płytce 48-dołkowej.</li>
		<li>Odrzucić bufor blokujący, inkubować larwy z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (np. króliczą anty-ludzką rozszczepioną kaspazą-3, 1:250) rozcieńczonym w buforze inkubacyjnym przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności i delikatnie kołysać na płytce wytrząsającej (400 obr./min). Zobacz krok 7.2.11, aby zapoznać się z zalecanymi woluminami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3:
	<ol>
		<li>Przemyj larwy kolejno 3 x 1 h 1 ml PBS-TS (10% surowicy koziej, 1% Triton X-100 w PBS), a następnie 2 x 10 minut 1 ml PBS-T (1% Triton X-100 w PBS) i 2 x 1 h 1 ml PBS-TS. W każdym praniu delikatnie wytrząsaj płytki zawierające larwy na płytce wytrząsającej (400 obr./min).</li>
		<li>Inkubować larwy z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikiem fluorescencyjnym (np. kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG [H+L] z adsorbcją, Alexa Fluor 647, 1:500) i 100 μg/ml Hoechst 33258 rozcieńczonych w buforze inkubacyjnym w ciemności przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając na płytce wytrząsającej (400 obr./min). Patrz krok 7.2.11, aby zapoznać się z zalecanymi objętościami drugorzędowego roztworu przeciwciała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 4:
	<ol>
		<li>Myć 3 x 1 h 1 ml PBS-TS i 2 x 1 h 1 ml PTw, delikatnie mieszając na płycie wytrząsającej (400 obr./min).</li>
		<li>Stwórz okrągłą warstwę ze szkliwa (grubość ~0,5-1 mm) na szkiełkach mikroskopowych. Pozwól szkliwu wyschnąć i umieść larwy na środku okrągłej warstwy, odsłaniając bok ksenoprzeszczepu.</li>
		<li>Wysuszyć nadmiar roztworu i zamontować szklane szkiełko nakrywkowe za pomocą rozpuszczalnego w wodzie, niefluorescencyjnego podłoża montażowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Obrazowanie
<ol>
	<li>Rejestruj obrazy pod mikroskopią konfokalną za pomocą obiektywu 40x. Użyj następujących parametrów akwizycji: rozdzielczość 1024 x 512 pikseli z odstępem Z 5 μm.</li>
</ol>
9. Analiza apoptozy przez ImageJ
<ol>
	<li>Załaduj oprogramowanie ImageJ (Fiji Is Just) (https://imagej.net/Fiji/Downloads) i otwórz obraz pliku Z-stack (kliknij Plik | Otwórz). W wyskakującym okienku wybierz opcję Widok stosu/Hyperstack i kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Nałóż na siebie różne kanały, wybierając opcję Obraz | Kolor | Zrób kompozyt.</li>
	<li>Przeciągnij pasek Z u dołu obrazu, aby przeglądać obraz stosu Z i zidentyfikować obszar ksenoprzeszczepu (komórki, które są dodatnie pod względem śledzenia komórek fluorescencyjnych. Patrz krok 4.5) w przestrzeni perywitelnej danio pręgowanego.</li>
	<li>Wybierz narzędzie Punkt i policz liczbę apoptotycznych komórek ludzkich (dodatnich do fluorescencyjnych komórek śledzących i rozszczepionej kaspazy-3), jak pokazano na dodatkowym filmie S1.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia Punkt, zmień licznik i policz całkowitą liczbę jąder komórek ludzkich (jąder komórek CM-DiI dodatnich).</li>
</ol>

<ol><li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li>
<li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2022%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li>
<li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li>
<li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer-A+disease+in+need%3A+Optimizing+and+integrating+supportive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li>
<li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+Treatment+hurdles%2C+tumor+microenvironment+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastrointestinal+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li>
<li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+vs.+organoids%3A+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output%2C+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923(2020).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+models%3A+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178(2021).</li>
<li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131(2021).</li>
<li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677(2020).</li>
<li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551(2021).</li>
<li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229(2017).</li>
<li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment%3A+interplay+in+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077(2021).</li>
<li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+patient-derived+xenografts%3A+the+best+laid+plans+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li>
<li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+%28CAFs%29+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li>
<li>Strähle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Modele in vivo w badaniach nad rakiem dostarczają nieocenionych narzędzi do zrozumienia biologii nowotworów i przewidywania odpowiedzi na leczenie nowotworów. Obecnie dostępne są różne modele in vivo , na przykład zwierzęta modyfikowane genetycznie (myszy transgeniczne i myszy z nokautem) lub ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów z ludzkich komórek pierwotnych. Pomimo wielu optymalnych funkcji, każda z nich ma różne ograniczenia. W szczególności wyżej wymienionym modelom brakuje niezawodnego sposobu ...

Jednym z problemów klinicznych badań nad rakiem jest to, że rak nie jest pojedynczą chorobą, ale wieloma różnymi chorobami, które mogą ewoluować w czasie, wymagając specyficznego leczenia w zależności od charakterystyki samego guza i pacjenta1. W związku z tym wyzwaniem jest przejście w kierunku zorientowanych na pacjenta badań nad rakiem, w celu zidentyfikowania nowych spersonalizowanych strategii wczesnego przewidywania wyników leczenia raka2. Jest to szczególnie istotne w przypadku gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC), ponieważ jest on uważany za trudny do leczenia nowotwór, z 5-letnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym 11%3.
Późna diagnoza, szybki postęp i brak skutecznych terapii pozostają najpilniejszymi problemami klinicznymi PDAC. Głównym wyzwaniem jest zatem modelowanie pacjenta i identyfikacja biomarkerów, które można zastosować w klinice, aby wybrać najskuteczniejszą terapię zgodną z medycyną spersonalizowaną4,5,6. Z biegiem czasu zaproponowano nowe podejścia do modelowania chorób nowotworowych: organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów myszy (mPDX) pochodzą ze źródła ludzkiej tkanki nowotworowej. Zostały one wykorzystane do odtworzenia choroby w celu zbadania odpowiedzi i oporności na leczenie, a także nawrotu choroby7,8,9.
Podobnie, wzrosło zainteresowanie modelami ksenoprzeszczepów (zPDX) opartych na danio pręgowanym, dzięki ich unikalnym i obiecującym cechom10, reprezentujące szybkie i tanie narzędzie do badań nad rakiem11,12. Modele zPDX wymagają jedynie małego rozmiaru próbki guza, co umożliwia przeprowadzenie wysokoprzepustowych badań przesiewowych chemioterapii13. Najczęstszą techniką stosowaną w modelach zPDX jest całkowite trawienie próbki i implantacja pierwotnych populacji komórek, co częściowo odtwarza guz, ale ma wady w postaci braku mikrośrodowiska guza i przesłuchu między złośliwymi i zdrowymi komórkami14.
Ta praca pokazuje, jak zPDX mogą być używane jako model przedkliniczny do identyfikacji profilu wrażliwości na chemoterapię u pacjentów z rakiem trzustki. Cenna strategia ułatwia proces ksenoprzeszczepu, ponieważ nie ma potrzeby ekspansji komórek, co pozwala na przyspieszenie badań przesiewowych w kierunku chemioterapii. Mocną stroną modelu jest to, że wszystkie składniki mikrośrodowiska są zachowane tak, jak w tkance nowotworowej pacjenta, ponieważ, jak dobrze wiadomo, zachowanie guza zależy od ich wzajemnego oddziaływania15,16. Jest to bardzo korzystne w porównaniu z alternatywnymi metodami w literaturze, ponieważ możliwe jest zachowanie heterogeniczności guza i przyczynienie się do poprawy przewidywalności wyniku leczenia i nawrotu w sposób specyficzny dla pacjenta, umożliwiając w ten sposób wykorzystanie modelu zPDX w badaniach klinicznych. Niniejszy manuskrypt opisuje etapy związane z tworzeniem modelu zPDX, począwszy od resekcji guza pacjenta i leczenia go, aby przeanalizować odpowiedź na chemioterapię.

<table><tbody><tr><td>5-fluorouracyl</td><td>Teva Pharma AG</td><td>SMP 1532755</td><td></td></tr><tr><td>48 płytka wielodołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>83 3923</td><td></td></tr><tr><td>96 płytka wielodołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza w proszku&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwjądrowe, klon 235-1</td><td>Merck</td><td>MAB1281&nbsp;</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Siatka akwariowa QN6</td><td>Penn-plax</td><td>0-30172-23006-6</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34567</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CM-DiI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C7001</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Głęboki Czerwony&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175) (5A1E) Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>9661S</td><td>1:250 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)&nbsp;</td><td>Odczynniki PanReac AppliChem ITW</td><td>A3672,0250</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy -&nbsp; Kapilary szklane Lederfolin</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 3,5"</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Średnica zewnętrzna = 1,14 mm. Średnica wewnętrzna = 0,53 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiolki szklane&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>WHEAW224581</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-Królik&nbsp; IgG&nbsp; (H+L) Przeciwciało drugorzędowe z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21244&nbsp; &nbsp;</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Irinotecan</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do zamrażarek niskotemperaturowych</td><td>VWR International</td><td>479-1220</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik</td> <td>mikropłytekSCILOGEX</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Oxaliplatin</td><td>Teva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3902500</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83 3901</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta Pasteura</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Mount</td><td>Tebu-bio</td><td>18606-5</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Merck</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 średni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela nr 10 Sterylna stal nierdzewna</td><td></td> Rękojeść skalpela <td>VWR International</td> SWAN3001 <td></td></tr><tr><td>#3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td>Merck E10521</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do mikropipet</td><td>Przyrząd migawkowy</td><td>P-30&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Rak jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie, a częstość występowania wielu rodzajów raka wciąż rośnie. Poczyniono znaczne postępy w zakresie badań przesiewowych, profilaktyki i leczenia; Nadal jednak brakuje modeli przedklinicznych, które przewidują profil wrażliwości na chemoterapię u pacjentów z rakiem. Aby wypełnić tę lukę, opracowano i poddano walidacji model ksenoprzeszczepu in vivo pobrany od pacjenta. Model oparto na zarodkach danio pręgowanego (Danio rerio) po 2 dniach od zapłodnienia, które wykorzystano jako biorców ksenoprzeszczepów fragmentów tkanki nowotworowej pobranych z próbki chirurgicznej pacjenta. 
Warto również zauważyć, że próbki bioptyczne nie były trawione ani dezagregowane, w celu utrzymania mikrośrodowiska guza, co jest kluczowe z punktu widzenia analizy zachowania guza i odpowiedzi na terapię. Protokół szczegółowo opisuje metodę ustanawiania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (zPDX) pochodzących od zerospora z pierwotnej chirurgicznej resekcji guza litego. Po przebadaniu przez anatomopatologa próbka jest preparowana za pomocą ostrza skalpela. Tkanka martwicza, naczynia lub tkanka tłuszczowa są usuwane, a następnie krojone na kawałki o wymiarach 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm. 
Kawałki są następnie znakowane fluorescencyjnie i ksenoprzeszczepiane do przestrzeni periwitelinowej embrionów danio pręgowanego. Duża liczba zarodków może być przetwarzana przy niskich kosztach, co umożliwia wysokoprzepustowe analizy in vivo wrażliwości na chemoterapię zPDX na wiele leków przeciwnowotworowych. Obrazy konfokalne są rutynowo pozyskiwane w celu wykrycia i ilościowego określenia poziomów apoptozy wywołanych chemioterapią w porównaniu z grupą kontrolną. Procedura ksenoprzeszczepu ma znaczną przewagę czasową, ponieważ można ją wykonać w ciągu jednego dnia, co zapewnia rozsądne okno czasowe na przeprowadzenie terapeutycznych badań przesiewowych przed badaniami klinicznymi.

Niniejszy protokół opisuje podejście eksperymentalne do tworzenia zPDX z pierwotnego gruczolakoraka trzustki u ludzi. Próbka guza została pobrana, posiekana i zabarwiona barwnikiem fluorescencyjnym, zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu. Następnie zPDX zostały pomyślnie utworzone poprzez implantację fragmentu guza do przestrzeni periwitelline embrionów rybek zebrafish w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf), zgodnie z opisem w sekcji 5 protokołu. Jak opisano w sekcji 6 protokołu, zPDX zostały poddane dalszemu przesiewowi w celu ...

Modele przedkliniczne mają na celu poszerzenie wiedzy na temat biologii nowotworów i przewidywanie skuteczności leczenia. W artykule opisano wytwarzanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (zPDX) na podstawie danio pręgowanego z fragmentami tkanki nowotworowej. ZPDX leczono chemioterapią, której efekt terapeutyczny oceniano pod kątem apoptozy komórek przeszczepionej tkanki.

Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Ksenoprzeszczep danio pręgowanego od pacjenta jest potężnym modelem przedklinicznym do przewidywania profilu chemowrażliwości pacjenta z rakiem in vivo. Protokół opisuje generowanie modelu począwszy od próbki chirurgicznej pacjenta. Poprzez ksenografację małego fragmentu tkanki, a nie izolowanie komórek w zarodkach danio pręgowanego, możliwe jest utrzymanie mikrośrodowiska guza, które jest kluczowym krokiem dla progresji guza i odpowiedzi na chemioterapię.Dużą zaletą modelu jest jego potencjał do przewidywania rokowania pacjenta w klinicznie istotnych ramach czasowych wynoszących zaledwie jeden tydzień, działając jako narzędzie medycyny spersonalizowanej. Przetwarzanie próbki należy rozpocząć od przemycia całej tkanki nowotworowej pobranej od pacjenta pięcioma mililitrami świeżej pożywki nowotworowej. Odpipetuj go 10 razy w górę i w dół za pomocą plastikowej pipety Pasteura.Ostrożnie zassać i wyrzucić środek myjący przed trzykrotnym powtórzeniem prania. Zanurz próbkę w jednym do dwóch mililitrów świeżej pożywki nowotworowej. Pokrój próbkę guza na jedno- lub dwumilimetrowe kawałki sześcienne za pomocą ostrza skalpela, a następnie umieść je w sterylnej pięciomililitrowej plastikowej

establishment-zebrafish-patient-derived-xenografts-from-pancreatic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę tworzenia modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z danio pręgowanego. W protokole próbki oceniamy skuteczność leków Gemcytabina i Navitoclax na modelu ksenoprzeszczepu guza trzustki.

Ksenoprzeszczep danio pręgowanego od pacjenta (zPDX): model raka

Ten film opisuje test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego w celu oceny powstawania nowotworów in vivo i zbadania efektu środków terapeutycznych.

Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego: metoda oceny skuteczności przeciwnowotworowej leków na rakotwórczość u danio pręgowanego in vivo

Ten film opisuje metodę przeszczepu komórek nowotworowych z modelu dawcy czerniaka do biorcy z obniżoną odpornością, zebry Casper. Pomaga uwidocznić wszczepienie i proliferację guza u ryb biorcy.

Test przeszczepu podskórnego: metoda przeszczepiania komórek czerniaka od dawcy do biorcy modelu danio pręgowanego

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Ten protokół opisuje procedury optymalizacyjne w opartym na wirusie, dwufluorescencyjnie znakowanym modelem ksenoprzeszczepu guza, wykorzystującym larwy danio pręgowanego jako gospodarzy. Ten heterogeniczny model ksenoprzeszczepu naśladuje skład tkankowy mikrośrodowiska raka trzustki in vivo i służy jako bardziej precyzyjne narzędzie do oceny reakcji leków w spersonalizowanych modelach zPDX (ksenoprzeszczep pobrany od pacjentów z danio pręgowanego).

Heterogeniczny model ksenoprzeszczepu raka trzustki uzyskany od pacjenta z wykorzystaniem larw danio pręgowanego jako gospodarzy do porównawczej oceny leków

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące generowania i rozwiązywania problemów z ludzkimi ksenoprzeszczepami ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) z linii komórkowych i świeżego materiału pacjenta w przejściowo immunosupresyjnych zarodkach danio pręgowanego, wraz z wytycznymi dotyczącymi oceny odpowiedzi na lek za pomocą cytometrii przepływowej. Rurociąg eksperymentalny może być również dostosowany do guzów litych.

Szybkie przewidywanie odpowiedzi na leki in vivo przy użyciu przeszczepów komórek białaczkowych w zarodkach danio pręgowanego

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Poznaj model zPDX z przeszczepami tkanek nowotworowych pacjentów do Danio rerio w celu oceny wrażliwości na chemioterapię. Metoda zachowuje mikrośrodowisko guza i pozwala przewidywać odpowiedź pacjenta w ciągu tygodnia.

Opracowanie ksenoprzeszczepów raka trzustki od pacjentów danio pręgowanego do testów wrażliwości na chemoterapię

Przeglądaj więcej filmów