Pomiar wysokiej rozdzielczości zachowania wywołanego zapachem u larw Drosophila

Cześć, nazywam się Matt Lui. Jestem stażystą podoktorskim w laboratorium Leslie Sal na Uniwersytecie Rockefellera. Dzisiaj chciałabym opowiedzieć wam o eksperymentach, które przeprowadziliśmy, aby zbadać chemotaksję larw.

Problem, który nas interesuje, jest dość prosty. W rzeczywistości jest to reprezentowane tutaj w tej konfiguracji. Właśnie przeniosłem grupę larw Josepha na tę powierzchnię agros.

To środowisko jest dość wrogie i są bliscy śmierci głodowej. W jakiś sposób te zwierzęta będą musiały znaleźć drogę do najbliższego źródła pożywienia, a oto zapach emitujący banany, który przyciągnie larwy. To środowisko nie jest idealne do badania zachowania chemotaksji, więc pierwszą poprawą będzie zastąpienie banana substancją chemiczną.

Ta substancja chemiczna to octan izo i jest to jeden ze smaków dominujących w bananach. Jest to więc nasz sztuczny smak i używając go, mamy znacznie lepszą kontrolę nad bodźcem węchowym. Kolejnym ulepszeniem jest użycie zamkniętego środowiska i próba zapobieżenia w taki sposób fluktuacji w drugiej dystrybucji.

Oto test, którego używamy w laboratorium od dłuższego czasu. Jest to szalka Petriego z powierzchnią agarro na dole. Agarro jest idealny dla larw do ataków chemioterapii, ponieważ utrzymuje je nawilżone.

Po obu stronach talerza znajduje się druga nasadka wykonana z teflonu, a to, co teraz zrobimy, to wprowadzenie octanu isam z jednej strony i braku porządku po drugiej stronie. Gdy to zrobisz, należy zamknąć naczynie z benzyną, odczekać chwilę, aż zapach się rozproszy, a następnie otworzyć naczynie. Wprowadź tutaj zwierzę, a my pozwolimy mu się poruszać przez określony czas.

Test ten opiera się na założeniu, że wprowadzając teodor po jednej stronie naczynia, otrzymujemy gradient, który jest dość szybko ustalany i pozostanie stabilny przez okres testu. Główny problem polega na tym, że nikt nigdy nie wykazał, że gradient istnieje w płycie. Równie dobrze może się zdarzyć, że bardzo szybko po dodaniu teodoru masz jednorodny rozkład teodoru na płycie w taki sposób, że gradient byłby bardzo płytki lub może się zdarzyć, że potrzeba kilku minut, aby ustalić gradient

Będzie to oczywiście zależało głównie od prężności pary używanego teodoru. Druga kwestia związana jest z tym, co jest określane ilościowo podczas eksperymentu. Wyobraźmy sobie, że zwierzę zaczyna od tego miejsca, X i po trzech minutach znajduje się na tej tabliczce końcowej, czerwonym X. Teraz są dwa możliwe podejścia.

Jedną z rzeczy, które możesz zrobić, to zarejestrować ostateczną pozycję zwierzęcia dopiero po określonym czasie, trzech lub pięciu minutach. Wtedy jedyną informacją, którą możesz uchwycić, jest pozycja startu i uważamy, że ważne jest, aby mieć dobrą rozdzielczość dotyczącą zachowania zwierzęcia w czasie. Na przykład, zwierzę mogło z trudem przemieścić się z pozycji początkowej do końcowej, takiej jak tutaj, lub mogło równie dobrze odwiedzać region otaczający teodor przez znaczną część czasu i zwrócić go przed końcem próby.

Wniosek, jaki wyciągnęlibyśmy z tych dwóch sytuacji, jest bardzo różny. W jednym przypadku zwierzę mogło nie zareagować na bodziec, podczas gdy w drugim przypadku z pewnością zareagowało. Dwa ulepszenia, które staramy się osiągnąć, to po pierwsze, kontrolowanie kształtu i stabilności drugiego nachylenia na arenie.

Po drugie, śledź zachowanie zwierzęcia w czasie rzeczywistym i przechowuj wszystkie te informacje. W kolejnej sekwencji Sylwia przedstawi Ci, w jaki sposób przygotowujemy rozcieńczenie zamówienia. Nazywam się S ti.

Jestem asystentem naukowym w laboratorium VAs i pracuję nad materiałem lui. Dzisiaj pokażę Wam jak przygotować materiały do systemu komór, których używamy do śledzenia zwierząt. Podstawowym problemem związanym z naszym systemem komór jest to, że używamy zapachu w rozproszonym powietrzu.

Oznacza to, że na przykład, jeśli używane przez nas płyty agros nie są płaskie, mogą wystąpić wahania i stężenie między eksperymentami, co wprowadzi hałas do systemu. Więc pokażę Ci i dam Ci drobne wskazówki, jak spróbować zredukować hałas w systemie. Tak więc materiałem do przygotowania rozcieńczalnika zapachowego jest szklany słoik, najlepiej przyciemnione szkło, jeśli używasz lekkich reaktywnych zapachów z porcją zapachu, który Cię interesuje.

Szklane pipety do przygotowania tej podwielokrotności oraz odpowiedni mechaniczny przyrząd do pipetowania. Następnie końcówki pipet oleju parafinowego, standardowy pipet i małe fiolki do rozcieńczania. Ponownie, muszą to być szkło i najlepiej przyciemnione, a następnie waga, aby dokonać dokładnych pomiarów i zredukować szum między eksperymentami.

Ponieważ zapachy są bardzo lotne, a niektóre z nich są toksyczne, odbywa się to w kapturze. Pierwszym krokiem do naprawy rozcieńczenia zapachu jest podanie porcji zapachu, który zamierzasz rozcieńczać. Aby przygotować dokładne rozcieńczenia i zminimalizować różnice między eksperymentami, konieczne jest zważenie wszystkiego.

Zacznij więc od etykietowania, aby uzyskać jednomolowe stężenie maślanu etylu. Najpierw przygotowujesz olej parafinowy. Olej parafinowy jest bardzo lepki, dlatego ważne jest, aby starać się zanurzać końcówkę pipety w jak najmniejszym stopniu w oleju parafinowym, tylko na tyle, aby móc zassać olej parafinowy bez generowania pęcherzyków.

Następnie dobrze jest zetrzeć nadmiar olejku paren z boku butelki. Po raz kolejny, ponieważ olej paren jest lepki, bardzo ważne jest, aby powoli wypuszczać go do fiolki. Po odpipetowaniu oleju para do butelki nie wyrzucaj od razu końcówki, ponieważ na dnie końcówki zbierze się więcej.

Dobrze jest przygotować arkusz obliczeń przed rozpoczęciem rozcieńczania, w którym już odmierzyłeś objętość olejku paren, który zamierzasz dodać, a także wagę, a następnie zrobić to samo dla zapachu z wagą. W ten sposób możesz sprawdzić na wadze, którą posiadasz, cały olej parafinowy, którego potrzebujesz, a także cały zapach. W razie potrzeby wlej więcej oleju paren i odmierz ponownie, aż uzyskasz odpowiednią wagę.

Gdy masz już odpowiednią masę oleju paren, wszystko, co musisz zrobić, to dodać środek zapachowy zgodnie z tymi samymi zasadami. W porządku. Tutaj pokażę, jak przygotować larwy do śledzenia.

Zwykle używamy larw, które mają sześć dni. Robimy to, ponieważ są na tyle duże, że można je łatwo wychwycić za pomocą naszego oprogramowania, a także są nadal bardzo aktywne, aby stwierdzić, czy twoje larwy są zbyt stare, aby użyć ich do śledzenia, musisz tylko sprawdzić, czy po ścianach nie wspinają się larwy. Jeśli po ścianie wspinają się larwy, oznacza to, że są za stare i nie będą szczególnie aktywne.

Pierwszym krokiem w przygotowaniu larw jest zanurzenie ich w 15% sacharozy. Powodem, dla którego używamy 15% sacharozy, jest to, że larwy będą Boydem w tym roztworze, a pokarm zamiast tego albo częściowo się w nim rozpuszczy, albo opadnie na dno. Wlewasz tyle sacharozy, żeby znalazła się około, wiem, trochę mniej niż cal od górnej części twojej butelki lub fiolki.

Następnie bierzesz szpatułkę. Możesz już zobaczyć, jak larwy unoszą się w górę i delikatnie wkopujesz się w jedzenie, aby usunąć wszelkie zwierzęta, które kopią w jedzenie, obracasz je trochę, aby oddzielić je od jedzenia, a następnie po prostu siadasz na kilka minut. Gdy pokarm i larwy odpowiednio się oddzielą, weź wstępnie oznakowaną szalkę Petriego i wlej je do części sygnalizatora dźwiękowego.

Trzymaj górną część szalki Petriego, ponieważ napełnisz ją wodą i użyj jej jako pojemnika na śledzone larwy, abyś mógł oddzielić, które z nich śledziłeś, a które nie. Teraz, gdy wlałeś larwy na szalkę Petriego, musisz poczekać 30 minut, aż przystosują się do sacharozy i osiągną stan głodu. Oznacza to, że będą zachowywać się lepiej w konfiguracji śledzenia w ciągu 30 minut, do których larwy się przystosowują.

Sacharoza to dobry moment na przygotowanie płytek do śledzenia. Są to więc wierzchołki płytek 96-dołkowych. Możesz je kupić osobno i jest to rozwiązanie 3%aros, które zostało już podgrzane.

Używamy 3%, ponieważ zapobiega to kopaniu larw, ale jest też na tyle gęsty, że mogą po nim chodzić i pozostać nawilżonym na każdym blacie talerza. Chcesz pipetować 25 mililitrów agros. Ważne jest, aby starać się unikać tworzenia dużych pęcherzyków w żelu.

Ważne jest również, aby umieścić płytki na płaskiej powierzchni, w przeciwnym razie możesz wzbudzić żele, które znajdują się na zboczu i mogą wpływać na zachowanie larw. Po zastygnięciu aros układamy wierzchołki w stosy i zawijamy je w folię soran, aby nie wysychały. Powinno to utrzymać je w dobrym stanie do śledzenia przez kilka dni.

W tej sekwencji przedstawię Wam nasz test behawioralny, który różni się nieco od testu na miskę z benzyną, o którym mówiłem wcześniej. To, czego będziesz potrzebować, to przewody z płytek 96-dołkowych, a także te zawierające warstwę agro. Testy składają się z trzech pokrywek, które są ułożone w stos.

Pierwsza warga nie zawiera niczego, jest pusta i służy jedynie do odizolowania systemu od powierzchni, na której leży. Druga warstwa zawiera nawierzchnię Diego agro. Tutaj zwierzęta zostaną umieszczone na powierzchni, a teraz, jak pokażę ci dalej, wprowadzamy teodor na talerzu.

Ważne jest, aby używać świeżej i nowej pokrywki za każdym razem, gdy ładujesz tenodór. Ma to na celu zapobieżenie jakiemukolwiek zakażeniu z jednego eksperymentu do drugiego. Potrzebne będzie również inne rozcieńczenie.

Zwykle nie używamy barwnika do ładowania teodoru, ale tutaj skorzystam z niego dla ilustracji. Jest to wysokie stężenie teodoru. Chociaż ten jest bardzo rozcieńczony, moim celem będzie stworzenie gradientu wzdłuż linii.

Powiedzmy tę linijkę, a chcemy, aby koncentracja rosła od lewej do prawej. Aby to osiągnąć, użyję kilku kropel porządku umieszczonych w pierścieniu kondensacyjnym o rosnącym stężeniu. Zaczynam od najwyższego stężenia, które zostanie umieszczone na końcu.

Ważne jest, aby rozproszyć go w pierścieniu. Teraz przystępuję do następnego stężenia, które rozcieńcza się dwukrotnie w porównaniu z pierwszym i umieszczam je w tym pierścieniu. Więc nie nie, mam sześć kropel.

Pierwsza z nich zawiera koncentrację, powiedzmy, jeden. Drugi o stężeniu 0,5, dwa razy mniejszym niż pierwszy. Trzecim jest koncentracja, 0,25 i tak dalej.

Mamy więc szereg geometryczny wzdłuż linii. Następny krok polega na odwróceniu tej pokrywy na powierzchni AAL, a teraz dzięki napięciu powierzchniowemu wszystkie kropelki pozostają zawieszone na górze pokrywy. Opracowujemy technikę opartą na spektroskopii w podczerwieni do pomiaru całego stężenia w płytce.

Stosując tę technikę, byliśmy w stanie pokazać, że jeśli masz tutaj geometryczną serię wzdłuż linii dezodorantu, otrzymasz stężenie teodoru wzdłuż długości, które rośnie wykładniczo, jak pokazano tutaj, i wzdłuż szerokości płytki. Mamy profil, który osiągnął szczyt tuż pod linią nawaniania. Oto jak wygląda rzeczywista geometria gradientu.

Jeśli weźmiesz pod uwagę stężenie teodoru w powietrzu, dobrą rzeczą jest to, że udało nam się wykazać, że gradient o geometrii jest stabilny przez co najmniej 15 minut. Po wprowadzeniu górnej pokrywy czekamy 30 sekund, aby umożliwić ustalenie gradientu. Następnie wprowadzamy zwierzę na arenę.

Zwierzę wprowadza się pod drugą linię końcową między pozycją trzecią a czwartą, za pomocą małej szpilki przenosimy larwy z roztworu sacharozy na powierzchnię agro. Przenoszenie odbywa się poprzez łowienie larwy wokół główki paznokcia. Szybko otwieramy pokrywkę, larwa osadza się na powierzchni agarro.

Następnie zamykamy pokrywę. Ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym pokrywa pozostaje otwarta. Następnie rejestrujesz ruch zwierzęcia przez trzy lub pięć minut.

Wykonywane jest właściwe nagranie. Dzięki tej konfiguracji śledzenia mamy kamerę, która jest podłączona do komputera. Oprogramowanie do śledzenia obrazu, którego używamy, to Aton vision firmy Nordis do zbierania informacji o ruchu zwierząt i przechowywania ich w postaci pliku cyfrowego.

Teraz zaczynamy eksperyment behawioralny. Mamy pokrywkę z warstwą aro. Mamy rozcieńczenia.

Diego utknął na pierwszej pokrywie. Przed załadowaniem teodoru ważne jest, aby zawirować każdą fiolkę. Używamy naszego rozcieńczenia, z którego najmniejszy znajduje się po lewej stronie, a najwyższy po prawej.

Wszystkie sześć kropel zostanie załadowanych na płytkę w tym samym czasie. Aby uniknąć utraty zapachu, używamy tutaj wielokanałowego pipetera sześciozanurzeniowego, 10 mikrolitrów zapachu jest pobierane z każdej próbki rozcieńczenia, a odgłos jest ładowany w tym samym czasie. Po załadowaniu pokrywa jest teraz odwrócona na powierzchni agros.

Gradient został utworzony na płycie w ciągu ostatnich 30 sekund, jak pokazałem wcześniej. Teraz przedstawię zwierzę na powierzchni Diego. Jak tylko zwierzę zostanie przedstawione, zaczynam nagrywanie.

Zwierzę jest tutaj, a jego ruch jest teraz śledzony. Jak widać, zwierzę podąża za linią nawaniacza i zmierza w kierunku najwyższego punktu stężenia gradientu. Pamiętaj, że stężenie wzrasta od lewej do prawej w kształcie wykładniczym.

Jak widać, kierunek ruchu jest stale korygowany. Jeśli chodzi o bodziec, zwierzę osiągnęło teraz najwyższy punkt koncentracji gradientu i usuwamy go z płytki. Zwierzę jest wyrzucane na inną tabliczkę, aby upewnić się, że nie śledzimy tego samego osobnika dwa razy bezpośrednio.

Po wprowadzeniu nowej larwy i rozpoczęciu nowego nagrania, oto zasady, których przestrzegamy podczas śledzenia. Przerywamy śledzenie, gdy tylko zwierzę osiągnie najwyższy rząd koncentracji na talerzu, który odpowiada temu, temu tutaj. Ponadto, jeśli zwierzę uderzy w ścianę, śledzenie zostanie przerwane, ponieważ chcemy uniknąć jakichkolwiek zakłóceń.

Pierwsze pytanie, na które się odpowiedzieliśmy, brzmiało: "Całkiem możliwe". Chcieliśmy się dowiedzieć, czy zwierzę jest w stanie wyczuć zapach teodoru w określonym stężeniu. Aby dokonać takiego testu, zazwyczaj robimy to, że mamy jedno źródło zapachu zamiast kilku.

Pozwala to na jeden stopień swobody w zmianie stężenia w kropli końcowej zapachu. Tak więc, na przykład, mamy kropelkę o wysokim stężeniu, a tutaj mamy kroplę o niskim stężeniu. To, co zazwyczaj robimy, to wprowadzamy zwierzę na powierzchnię Diego tuż pod kroplę Theodora i sprawdzamy, czy zwierzę jest w stanie wykryć jego obecność i pozostać w jego sąsiedztwie.

Teraz chciałbym zrobić bardziej zaawansowany użytek z naszego testu. Wyobraź sobie, że masz jedną kroplę porządku i rejestrujesz kilka trajektorii, które są tutaj nałożone na siebie, a masz ich trzy. Masz jedną osobę, która generuje ten zielony tor.

Mamy ten pomarańczowy ślad, który jest mniej wyśrodkowany, a następnie mamy tę różową trajektorię, która reprezentuje zwierzę najwyraźniej krążące wokół źródła. Uważamy, że na początek można uzyskać wiele informacji na temat szczegółów trajektorii. Z tego powodu importujemy trajektorię jako serię opętania do matlaba, a analizę przeprowadzamy po analizie za pomocą matlaba.

Oto odległość do źródła prawdopodobnie w funkcji czasu. Dla trzech trajektorii, które były wyświetlane wcześniej, masz zieloną trajektorię, która pozostaje bardzo blisko źródła. Masz pomarańczową trajektorię, która wyświetla znacznie więcej szumów.

A potem mamy tę fioletową trajektorię, która co ciekawe pokazała, że zwierzę opuściło źródło, aby pozostać w pewnej odległości, co prawdopodobnie odpowiadało stężeniu, które było optymalne. Tutaj widzisz ilustrację przedstawiającą 10 trajektorii, zwierząt, które nie są w stanie wyczuć zapachu. Są to mutanty lub trzy mutanty B, które nie są ellerami.

I jak widać, wszystkie te trajektorie pokazują, że zwierzęta nie wykryły źródła zapachu i po prostu je opuściły. Teraz, w kontraście gwiazd, zarejestrowaliśmy tutaj 10 kolejnych trajektorii dla białych zwierząt klepanych. Zwierzęta te są oczywiście w stanie wyczuć zapach i jak widać, wszystkie one gromadzą się tuż pod źródłem dezodorantu.

20 trajektorii, które właśnie zostały zaprezentowane, zostało w rzeczywistości uzyskanych bez znajomości tożsamości zwierząt. Świadczy to o skuteczności i wiarygodności naszego testu. Określając, czy niektóre mutanty są w stanie wyczuć tutaj za pomocą gradientu wykładniczego, generujemy kilka śladów i chcemy mieć poczucie, jak dobrze zwierzęta są w stanie podążać za bodźcem na drugim końcu.

Pokażę wam teraz 15 trajektorii zarejestrowanych oddzielnie i jak widzicie, zwierzęta wykonują świetną robotę w podążaniu za bodźcem pod drugą linią końcową. Teraz chcielibyśmy przejść do prostej kontroli. Bardzo możliwe, że zwierzęta w gradiencie wykładniczym podążały za linią, ponieważ był jakiś bodziec niezależnie od jego stężenia, po prostu zwierzęta poszły prosto.

Tak więc, aby pokazać, że oni faktycznie obliczają stężenie lub coś związanego z koncentracją i używają tego do kierowania swoim ruchem, mamy teraz tę geometrię, która jest bliska dachowi. Larwa jest tutaj wprowadzana jak zwykle i spodziewamy się, że będą poruszać się wzdłuż linii, a następnie wykryją, że stężenie spada po tym punkcie i powrócą do niego. Przeprowadziliśmy więc test na pięciu zwierzętach.

Zebraliśmy trajektorie, a teraz przedstawiamy je nałożone na ten slajd. I jak widać, zwierzęta startowały stąd, przemieszczały się wzdłuż linii, następnie eksplorowały region odpowiadający największej koncentracji i głównie tam zostają. Sugeruje to, że są w stanie obliczyć inne stężenie w czasie rzeczywistym przy użyciu testu z jednego źródła.

Udało nam się zadać głównie jedno ważne pytanie. Czy zapach zwierzęcia może wykryć zapach w określonym stężeniu za pomocą urządzenia z wielu źródeł? Mamy większą elastyczność w zmianie kształtu gradientu i określaniu, czy zwierzę jest w stanie wykorzystać te informacje.

Chciałbym zilustrować tę ideę, przeprowadzając prosty eksperyment. W gradientach, które ustawialiśmy do tej pory, mieliśmy wykładniczy kształt wzdłuż soczewki. Teraz pytanie brzmi, czy jeśli rzucimy wyzwanie alowi bardziej, zwiększając stężenie liniowo wzdłuż soczewki, czy nadal będą w stanie znaleźć drogę pod drugą linią końcową?

Ten wykres przedstawia dwa typy gradientu. Przetestowaliśmy gradient wykładniczy w kolorze fioletowym i gradient liniowy w kolorze zielonym. To jest gradient liniowy i zamierzam napisać różne stężenia octanu isam rozcieńczającego olej paren.

Jest to szereg arytmetyczny. Mamy gradient liniowy, który zostanie ustalony i jak widać, nachylenie jest dość płytkie w porównaniu z gradientem wykładniczym, gdzie koncentracja kończyn również wynosi 0,5, ale wzrasta do 0,03. Pytanie brzmi, czy navi są w stanie przeprowadzić ataki chemioterapeutyką, gdy mają do czynienia z tak płytkim nachyleniem?

Tutaj rzeczywiste stężenie octanu użytego w sześciu kroplach dla gradientu wykładniczego i dla gradientu liniowego. Jak widać, mimo że najwyższe stężenia są takie same w obu przypadkach dla gradientu liniowego, najniższe stężenie jest tutaj dość wysokie. Przeprowadzamy eksperyment z gradientem liniowym i reprezentujemy tutaj 15 trajektorii zwierząt typu dzikiego i uważamy, że jest dość jasne, że zwierzęta te były w stanie wykryć gradient liniowy i podążać za tym sygnałem wzdłuż linii dezodorantu.

Myślę więc, że nasz punkt widzenia jest jasny. Zanim zakończę, chciałbym pokrótce omówić przyszłe kierunki dla tej konfiguracji śledzenia. Chociaż ta konfiguracja śledzenia pozwala na robienie wielu interesujących rzeczy, na przykład obserwowanie złożonych zachowań larw w większym, dłuższym okresie czasu, ma pewne ograniczenia.

Na przykład jesteś ograniczony do rozmiaru swojego talerza, co ogranicza czas, przez jaki możesz śledzić, i złożone zachowania, na które możesz patrzeć. Byłoby więc miło, gdybyśmy mogli opracować system, w którym albo płyta jest większa, albo w ogóle nie jesteś ograniczony granicami płyty. Innym problemem jest to, że przy oprogramowaniu, które mamy w tej chwili, trudno jest śledzić więcej niż jedno zwierzę w tym samym czasie, więc nie jest możliwe obserwowanie zachowań populacji w czasie rzeczywistym.

Innym interesującym aspektem zachowania, którego nie możemy przetestować za pomocą tej konfiguracji, są rzeczywiste trójwymiarowe ruchy larw w przestrzeni. Śledząc zwierzęta, zobaczysz, że na przykład, gdy dotrą do kropelki zapachu, mogą podnieść głowę lub mogą poruszać głową, próbując wykryć zmiany w stężeniu. Możliwe, że nie jest to możliwe w naszej konkretnej konfiguracji w tej chwili, więc byłoby miło opracować coś, co pozwoliłoby nam to zrobić.