Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

SCoPE2 może oznaczać ilościowo tysiące białek z tysięcy pojedynczych komórek ssaków bez przeciwciał. Protokół ten może pomóc w odkryciu heterogeniczności proteomu, która w przeciwnym razie byłaby niewidoczna w analizach masowych. Proteomika pojedynczych komórek, wykorzystująca podejście SCoPE2, została zaprojektowana tak, aby była dostępna dla badaczy dysponujących szeregiem zasobów, od pipety po robotykę zajmującą się obsługą cieczy.

SCoPE2 ma szerokie zastosowanie w wielu obszarach badawczych, w tym w raku i immunologii, dostarczając informacji na temat różnic w obfitości białek między pojedynczymi komórkami z tej samej populacji. Aby rozpocząć, rozpocznij procedurę lizy komórek, umieszczając 384-dołkową płytkę z posortowanymi pojedynczymi komórkami w termocyklerze, podgrzewając ją przez 10 minut w temperaturze 90 stopni Celsjusza, a następnie schładzając w temperaturze 12 stopni Celsjusza. Krótko zakręć talerzem w wirówce stołowej w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza.

Sonikować płytkę przez pięć minut w łaźni wodnej w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza. Następnie umieść go na lodzie. Aby przystąpić do trawienia trypsyny, przygotuj 100 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i dodaj 0,2 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 384-dołkowej za pomocą płynnego uchwytu.

Uszczelnij płytkę, wiruj przez pięć sekund i wiruj w stołowej wirówce do płytek w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza. Podgrzewaj płytkę 384-dołkową przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy temperaturze pokrywki ustawionej na 52 stopnie Celsjusza. Aby ustawić tandemową reakcję znakowania masowego, wyjmij 85-milimolowe zapasy tandemowych znaczników masy z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przed ich otwarciem podgrzej probówki do temperatury pokojowej i rozcieńcz etykiety do 22 milimoli w bezwodnym acetonitrylu. Korzystając z tej strategii etykietowania, dodaj 0,5 mikrolitra rozcieńczonych znaczników masy tandemowej do każdego dołka płytki 384-dołkowej, używając robota dozującego ciecz lub pipety ręcznej. Uszczelnij płytkę, wiruj przez pięć sekund i wiruj w stołowej wirówce do płytek w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza.

Pozwól, aby reakcja etykietowania przebiegała w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza przez godzinę. W celu wygaszenia tandemowej reakcji znakowania masy, dodać 0,2 mikrolitra 0,5% hydroksyloaminy, rozcieńczonej w wodzie klasy HPLC, do każdej studzienki płytki 384-dołkowej za pomocą płynu. Uszczelnij płytkę, wiruj przez pięć sekund i odwiruj w stołowej wirówce do talerzy, a następnie utrzymuj płytkę w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Przygotowanie analizy LC-MS rozpoczyna się od usunięcia połączonego nośnika lub materiału odniesienia z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dla każdego zestawu należy odpipetować jeden mikrolitr nośnika i materiału referencyjnego do pierwszego dołka, który będzie częścią jednego zestawu. Odpipetować całą objętość od pierwszego dołka do kolejnego dołka.

Kontynuuj pipetowanie całej objętości z jednego dołka do drugiego, aż wszystkie studzienki wchodzące w skład jednego zestawu zostaną połączone w ostatnim dołku. Do każdego zestawu dodaj pięć mikrolitrów 50% acetonitrylu rozcieńczonego w wodzie klasy HPLC, aby uzyskać pierwszą studzienkę z pojedynczą komórką, która zostanie włączona do każdego zestawu. Odpipetować całą objętość od pierwszego dołka do kolejnego dołka.

Kontynuuj pipetowanie całej objętości z jednej komórki do drugiej, aż wszystkie studzienki wchodzące w skład jednego zestawu zostaną połączone w ostatnim dołku. Teraz przenieś każdy zestaw do szklanych wkładów do automatycznego podajnika próbek. Wysuszyć próbki po połączeniu wszystkich zestawów i umieszczeniu ich w szklanych wkładkach.

Przed analizą LC-MS-MS dodaj 1,2 mikrolitra 0,1% kwasu mrówkowego do każdego zestawu, aby ponownie zawiesić znakowane peptydy. Umieść wkładki automatycznego podajnika próbek w szklanych fiolkach z automatycznym podajnikiem próbek i zamknij każdą próbkę nakrętką. Wirować każdą fiolkę przez pięć sekund, aby upewnić się, że ponowne zawieszenie zostało zakończone, a następnie odwirować w wirówce do fiolki w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza.

Upewnij się, że każda próbka znajduje się na dnie wkładki, a nie jest rozpryskiwana po bokach. Umieść fiolki w tacce automatycznego podajnika próbek i dla każdego zestawu wstrzyknij jedną mikrolitrową próbkę do analizy LC-MS-MS. Wydajność trawienia i etykietowania pojedynczych komórek może nie być bezpośrednio badana, jak w przypadku nośnika, ale oprogramowanie DO-MS zapewnia wykresy, które szacują wydajność trawienia i etykietowania.

Na słabe trawienie wskazuje wysoki stosunek intensywności nieprawidłowo rozszczepionych peptydów do ich całkowicie rozszczepionych odpowiedników. Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę w zestawach, jest odsetek brakujących danych w medianie intensywności jonów reporterowych w każdym kanale znakowania masy tandemowej. Gdy pojedyncze komórki są pomyślnie przygotowane, brakujące dane na komórkę i kontrola pozytywna są znacznie niższe niż w przypadku próbek kontroli ujemnej.

Ostrożne obchodzenie się z cieczą podczas przygotowywania próbki LC-MS-MS ma kluczowe znaczenie dla maksymalnego odzysku peptydów. Małe próbki o wielkości od około 100 pikogramów do 100 nanogramów na studzienkę można przygotować do analizy proteomicznej przy użyciu nośnika izobarycznego. SCoPE2 sprawia, że pomiary proteomiki pojedynczych komórek są dostępne dla naukowców na całym świecie, przy użyciu wyłącznie powszechnie stosowanych odczynników i dostępnego na rynku sprzętu.

Jest podatny na ręczne przetwarzanie lub automatyzację o wysokiej przepustowości dzięki zrobotyzowanej obsłudze cieczy.