Name: Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Poznaj metodę SCoPE2 do proteomiki jednokomórkowej z wykorzystaniem spektrometrii mas i izobarycznych znaczników tandemowych. Ta technika umożliwia ilościowe oznaczanie tysięcy białek z pojedynczych komórek ssaków bez użycia przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować nagrodzie Fall 2021 NSF I-Corps Program (strona Northeastern University), która sfinansowała tę publikację.

<ol><li>Symmons, O., Raj, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27259209/">What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism.</a> Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).</li>
<li>Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33351222/">Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics.</a> The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).</li>
<li>Levy, E., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30072488/">Single cell protein analysis for systems biology.</a> Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).</li>
<li>Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+analyses+of+cancer+cells%3A+toward+elucidating+the+molecular+mechanisms+of+clonal+evolution+and+drug+resistance+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition.</a> Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22(2021).</li>
<li>Shaffer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+cell+variability+and+drug-induced+reprogramming+as+a+mode+of+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance.</a> Nature. 555 (7695), 274(2018).</li>
<li>Pan, D., Jia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single-cell+multi-omics+in+dissecting+cancer+cell+plasticity+and+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024(2021).</li>
<li>Segerstolpe, Å, et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27667667/">Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).</li>
<li>Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+single-cell+analysis+provides+new+insights+into+heterogeneity+and+plasticity+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).</li>
<li>Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+single+cell+rna+sequencing+into+the+immunology+of+type+1+diabetes-+cell+phenotypes+and+antigen+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity.</a> Frontiers in Immunology. 12, 751701(2021).</li>
<li>Baron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+map+of+the+human+and+mouse+pancreas+reveals+inter-+and+intra-cell+population+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure.</a> Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).</li>
<li>Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28481885/">Post-transcriptional regulation across human tissues.</a> PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535(2017).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpicking+the+proteome+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unpicking the proteome in single cells.</a> Science. 367 (6477), 512-513 (2020).</li>
<li>Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29945450/">Transformative opportunities for single-cell proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34986167/">Learning from natural variation across the proteomes of single cells.</a> PLoS Biology. , (2021).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+single+cell+proteomics+forward+with+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Driving single cell proteomics forward with innovation.</a> Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).</li>
<li>Specht, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+and+transcriptomic+analysis+of+macrophage+heterogeneity+using+SCoPE2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2.</a> Genome Biology. 22 (1), 50(2021).</li>
<li>Petelski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-cell+proteomics+using+SCoPE2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8683604/">Scaling up single-cell proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179(2022).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+single-cell+proteomics+workflow+identifies%3E+1000+protein+groups+per+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell.</a> Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).</li>
<li>Lombard-Banek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+subcellular+mass+spectrometry+enables+proteo-metabolomic+single-cell+systems+biology+in+a+chordate+embryo+developing+to+a+normally+behaving+tadpole+%28X.+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis).</a> Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).</li>
<li>Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+accuracy+and+depth+of+protein+quantification+in+experiments+using+isobaric+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biology. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1">Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics.</a> BioRxiv. , at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1.abstract (2018).</li>
<li>Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+resolving+proteomes+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Towards resolving proteomes in single cells.</a> Nature Methods. 18 (8), 856(2021).</li>
<li>Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-MS%3A+Data-driven+optimization+of+mass+spectrometry+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods.</a> Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).</li>
<li>Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DART-ID+increases+single-cell+proteome+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">DART-ID increases single-cell proteome coverage.</a> PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082(2019).</li>
<li>Cheung, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+carrier+proteome+limit+for+single-cell+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics.</a> Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v4.article-info">Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v1.abstract (2021).</li>
<li>Vanderaa, C., Gatto, L. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14789450.2021.1988571">Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Jednym z kluczy do skutecznego przygotowania i analizy pojedynczych komórek za pomocą SCoPE2 jest przygotowanie nośnika i kanałów referencyjnych. Sugerowany rozmiar nośnika to od 100 do 200 komórek; Jednak liczba komórek potrzebnych do konkretnego eksperymentu z pojedynczą komórką może być określona na podstawie zasad omówionych w innym miejscu21. Dla sugerowanego rozmiaru potrzeba co najmniej ~11 275 komórek na płytkę 384-dołkową, co pozwala na 200-komórkowy nośnik i 5-komórkowe odniesienie w każdym zestawie. Korzystne może być wyizolowanie większej liczby komórek, jeśli pożądane populacje komórek nie są czynnikiem ograniczającym, po prostu posiadanie dodatkowego materiału w przypadku błędów (jak to zrobiono w tym protokole, izolując 22 000 komórek zamiast 11 275 komórek). Ilość nośnika i odniesienie potrzebne do określenia liczby pożądanych płytek powinna być przygotowana w jednej partii, aby zminimalizować wszelkie różnice między partiami, które mogą powodować różnice w identyfikacji peptydów lub oznaczaniu ilościowym między partiami.
Przed wyizolowaniem pojedynczych komórek do studzienek na płytce 384-dołkowej ważne jest, aby wziąć pod uwagę projekt układu płytki. W każdej płytce 384-dołkowej zaleca się przeprowadzenie zarówno kontroli pozytywnej, jak i negatywnej. Kontrole ujemne to studzienki, do których nie dodaje się żadnych komórek, ale są one poddawane tym samym odczynnikom i procedurom, co studzienki jednokomórkowe. Kontrole pozytywne to studzienki, do których dodaje się lizat komórkowy rozcieńczony do 2-5 komórek/μl zamiast pojedynczych komórek. Jest to szczególnie ważne do wdrożenia, gdy metody izolacji pojedynczych komórek nie są dobrze zwalidowane. Każda płytka 384-dołkowa powinna mieć idealnie losowy rozkład pojedynczych komórek i kontroli (np. nie mieć kontroli ujemnych lub pozytywnych tylko w jednym rzędzie). Każda płytka powinna mieć równy rozkład wszystkich interesujących populacji komórek, zamiast izolować jeden typ komórek na jednej płytce i drugi typ komórek na drugiej płytce. Pozwoli to uniknąć wiązania efektów wsadowych z typami komórek będących przedmiotem zainteresowania. Ponadto, jeśli do analizy potrzebna jest więcej niż jedna płytka 384-dołkowa, zaleca się wyizolowanie komórek podczas jednej sesji, zamiast rozkładania etapu izolacji na kilka dni, jeśli to możliwe.
Liza zarówno pojedynczych komórek, jak i nośnika/odniesienia odbywa się w wodzie w cyklu zamrażania-ogrzewania23. Przewiduje się, że większość proteaz została zdenaturowana na tym etapie. Trypsyna jest następnie dodawana natychmiast po etapie denaturacji w wysokim stężeniu, o wiele rzędów wielkości większym niż nawet najliczniejsze proteazy komórkowe. W wyniku masowego działania większość produktów aktywności proteazy będzie spowodowana trypsyną.
Redukcja/alkilowanie reszt cysteiny nie jest wykonywane w tym protokole przed trawieniem trypsyny. Peptydy zawierające cysteinę stanowią około 10% peptydów tryptycznych z ludzkiego proteomu. Obserwujemy mniej peptydów zawierających cysteinę przy użyciu podejścia bez redukcji/alkilowania. Na tych etapach stosuje się odczynniki, które są niezgodne z etykietowaniem przez TMT (NHS-ester chemistry) bezpośrednio po trawieniu.
W tej strategii etykietowania TMT nośnik i referencje są oznaczone odpowiednio 126 i 127N, podczas gdy studzienki jednokomórkowe i kontrolne są oznaczone 128C do 135N. Dwie etykiety po numerze referencyjnym, 127C i 128N, nie są używane ze względu na izotopowe zanieczyszczenie krzyżowe wynikające z kanału nośnego i referencyjnego, które są wyraźnie znacznie obfitsze w materiał peptydowy niż pojedyncze komórki. W sumie w zestawie znajduje się 12 kanałów TMT, które można wykorzystać do etykietowania pojedynczych komórek lub studzienek kontrolnych za pomocą TMTpro-16plex lub 14 kanałów TMT na zestaw za pomocą TMTpro-18plex.
Krytyczne kroki w protokole do wykonywania pomiarów proteomiki pojedynczej komórki przy użyciu tego protokołu obejmują przygotowanie nośnika, izolację pojedynczej komórki, lizę, trawienie, etykietowanie kodami kreskowymi i odpowiednie parametry spektrometrii mas. Kroki te zostały opisane w niniejszym dokumencie i zostały szczegółowo opisane w innych miejscach 17,21,25. Każdy krok ma odpowiadający mu wykres lub zestaw wykresów w DO-MS, które umożliwiają łatwą kontrolę jakości. Na przykład, w przypadku udanego stworzenia nośnika, wykresy przedstawiające liczbę zidentyfikowanych peptydów, skuteczność znakowania i procentowy wskaźnik nieczystości pozwalają zweryfikować jego pomyślne przygotowanie. Reprezentatywne raporty DO-MS są zawarte w niniejszej publikacji i można je zobaczyć pod adresem http://scope2.slavovlab.net/ dla oryginalnych danych16. Te raporty DO-MS pozwalają ocenić optymalizację metody w kierunkach, które nie zostały jeszcze zbadane przez autorów, takich jak dłuższe gradienty LC, różne enzymy trawienne lub alternatywne chemiczne kody kreskowe.
Obecnie szeregowa analiza peptydów za pomocą algorytmów akwizycji zależnej od danych ogranicza liczbę peptydów, które można analizować w serii LC o rozsądnej długości. Wynika to częściowo z dłuższych czasów napełniania wymaganych do pomyślnego pozyskania wystarczającej ilości jonów do wiarygodnej kwantyfikacji pojedynczej komórki21. Nieodłącznym ograniczeniem w stosowaniu nośnika jest brak bezpośredniej oceny efektywności trawienia i znakowania pojedynczych komórek. Obecnie jednym z rozwiązań tego ograniczenia jest przeprowadzanie kontroli jakości na większej próbce przetwarzanej wraz z pojedynczymi komórkami.
Zaproponowaliśmy szereg możliwości ulepszenia proteomiki jednokomórkowej, takich jak budowa spektrometrów masowych z wieloma analizatorami. Obecna metoda pozwala na ilościowe oznaczanie tysięcy białek z pojedynczych komórek ssaków z prędkością około 100 komórek dziennie za pomocą dostępnych na rynku odczynników i sprzętu. SCoPE2, druga generacja podejścia SCoPE-MS, znacznie poprawiła swoją poprzedniczkę pod względem liczby komórek możliwych do przeanalizowania w jednostce czasu, liczby białek możliwych do przeanalizowania w jednostce czasu, czasu potrzebnego na przygotowanie próbki, dostępności odczynników i sprzętu oraz całkowitego kosztu przygotowania i analizy na pojedynczą komórkę. Białka związane z błoną są dostępne za pomocą lizy zamrażalniczo-cieplnej i trawienia proteazy, jak pokazano w porównaniu z lizą mocznika23. Metoda identyfikuje wiele białek z górnej jednej trzeciej proteomu w odniesieniu do liczebności16. Jeśli zmodyfikowany proteoform znajduje się w górnej jednej trzeciej proteomu, a zmodyfikowany peptyd jest podatny na analizę spektrometrii mas (dobrze jonizuje, ma różnicę masy w stosunku do niezmodyfikowanego peptydu), będzie bardziej podatny na ten protokół. Metoda ta może być z powodzeniem stosowana w systemach biologicznych, w których występuje znacząca heterogeniczność między komórkami, na przykład w różnicowaniu, starzeniu się lub odpowiedziach immunologicznych (tj. Fagocytoza).

Analiza pojedynczych komórek jest powszechnie stosowana do badania poziomu heterogeniczności w systemach biologicznych, które w innym przypadku byłyby niedostrzegalne przy pomiarach masowych1,2,3. Taka różnorodność komórkowa może mieć funkcjonalne konsekwencje, które mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia integralnych procesów biologicznych, od oporności terapeutycznej komórek nowotworowych4,5,6 do heterogeniczności międzykomórkowej w cukrzycy7,8,9,10. Wiele badań koncentrowało się na pomiarze kwasów nukleinowych w pojedynczych komórkach, poprzez pomiar poziomów genetycznych lub transkryptomicznych i umożliwiło klasyfikację typów i stanów komórek. Taki postęp w przestrzeni kwasów nukleinowych nie może jednak wypełnić luki w wiedzy na temat regulacji potranskrypcyjnej11, co powoduje potrzebę podobnie wysokoprzepustowych pomiarów białek w pojedynczych komórkach12,13,14,15.
Opracowaliśmy SCoPE216,17, aby sprostać zapotrzebowaniu na rygorystyczną i solidną proteomikę jednokomórkową systemów ssaków. Jest to metoda multipleksowana, pozwalająca na zwiększenie przepustowości poprzez równoległe etykietowanie i analizowanie wielu komórek18, w przeciwieństwie do mthodów bez etykiet, które analizują jedną komórkę naraz19,20. Metodologia przygotowania próbki, podejście oparte na spektrometrii mas i kolejne etapy analizy danych pozwalają na dokładne określenie ilościowe setek do tysięcy białek na pojedynczą komórkę. Metoda ta umożliwia analizę spektrometrii mas pojedynczych komórek za pomocą nośnika izobarycznego21, małej próbki zbiorczej komórek (zwykle 25-200), która jest biologicznie podobna do populacji pojedynczej komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Ten materiał nośny jest multipleksowany w zestawie z kanałem referencyjnym z tego samego materiału i pojedynczymi komórkami za pomocą tandemowych znaczników masy (etykiety TMT). Kanał nośny zmniejsza utratę próbki na powierzchni i zapewnia fragmenty szkieletu jonowego w celu pomyślnej identyfikacji peptydów. Kanał referencyjny, który jest przygotowywany luzem, a następnie rozcieńczany do 5-10 odpowiedników komórek dla każdego zestawu pojedynczych komórek, pomaga kontrolować zmienność techniczną analizy. W szczególności odniesienie pozwala na normalizację zmienności spowodowanej efektami związanymi z LC-MS/MS, takimi jak pobieranie próbek jonów i wydajność jonizacji. Zwykle kanały odniesienia i nośne są wykonane z tej samej populacji komórek.
Ten protokół przygotowania próbki jest metodą drugiej generacji, opartą na SCoPE-MS22 poprzez wiele synergicznych ulepszeń. Ulepszenia obejmują metodę lizy komórek, która pozwala uniknąć oczyszczania próbki, co jest częstym etapem preparatów proteomicznych SM. Wykorzystuje mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)23, która jest metodą lizy zamrażalniczo-cieplnej. Metoda ta umożliwiła lizę pojedynczych komórek w mniejszych objętościach i na płytkach wielodołkowych, a nie w fiolkach, co umożliwiło większą przepustowość i automatyzację za pomocą termocyklerów. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta obniżyła koszt pojedynczej komórki i zwiększyła dokładność ilościową w porównaniu z SCoPE-MS16,24.
Ten protokół opisuje, jak przygotować pojedyncze komórki do analizy proteomicznej, w tym jak przygotować nośnik i kanały referencyjne za pomocą etykiet izobarycznych TMTpro 18-plex. Komórki ssaków, które są w zawiesinie pojedynczej komórki i które można wyizolować na 384-dołkowych płytkach, prawdopodobnie podlegają temu protokołowi. Dołączono również reprezentatywne wyniki udanych zestawów pojedynczych komórek, wyświetlające kilka wykresów kontroli jakości wygenerowanych przez aplikację R Shiny, DO-MS25. Inne opublikowane narzędzia programowe26,27 oraz eksperymentalne wytyczne17,21 poprawiły przyjęcie tego protokołu. Mamy nadzieję, że ten wizualny przewodnik pomoże naukowcom w przeprowadzaniu eksperymentów proteomicznych na pojedynczych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Płytka 384-dołkowa, standardowa płytka PCR</td> W razie potrzeby należy użyć płytki polipropylenowej <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1384</td>.<td> W przypadku zastąpienia, przed przygotowaniem SCoPE2 należy ocenić poziom potencjalnego zanieczyszczenia polimerem z innych płytek.</td></tr><tr><td>Acetonitryl (do przygotowania), Optima LC-MS/MS klasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td>Ten acetonitryl jest używany do wszelkich, a mianowicie 50% acetonitrylu, który jest używany do przechodzenia przez studzienki po przejściu przez nośnik i odniesienie podczas łączenia zestawów SCoPE2. Uwaga: Acetonitryl jest cieczą łatwopalną. Może podrażniać skórę, oczy, drogi oddechowe i ośrodkowy układ nerwowy. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Uchwyt pod wyciągiem chemicznym.</td></tr><tr><td>Acetonitryl (do przygotowania TMT), bezwodny, 99,8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-100ML</td><td>Ten acetonitryl służy do ponownego zawieszania etykiet TMT w stężeniu producenta. Uwaga: Acetonitryl jest cieczą łatwopalną. Może podrażniać skórę, oczy, drogi oddechowe i ośrodkowy układ nerwowy. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Uchwyt pod wyciągiem chemicznym.</td></tr><tr><td>Samoprzylepne folie do płytek PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler nakrętki gwintowane do fiolek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C5000-51B</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do fiolek z autosamplerem (tj. myFuge 5)</td><td>MTC Bio</td><td>C2595</td><td>Ten model nie posiada żadnej regulacji prędkości. Jest po prostu używany do zbierania płynu na dnie fiolek z automatycznym samplerem.</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki z gwintem z przezroczystego szkła, 9 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60180-509</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, przebijający, klasa LC-MS/MS Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>85178</td><td>Uwaga: Kwas mrówkowy jest cieczą łatwopalną. Może spowodować poważne uszkodzenie oczu lub oparzenia skóry. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Trzymaj w dobrze wentylowanym miejscu.</td></tr><tr><td>Szklane wkłady do automatycznego podajnika próbek, 9 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4010-630</td><td></td></tr><tr><td>Hydroksyloamina (HA), 50% wag./obj</td>. <td>Sigma Aldrich</td><td>467804-50ML</td><td>Uwaga: Hydroksyloamina może powodować podrażnienie skóry. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej.</td></tr><tr><td>Chipy mikroprzepływowe Mantis, chipy 3PFE o małej objętości</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVPR2</td><td>Te chipy są przeznaczone do użytku z manipulatorem cieczy Mantis microfluidics do dozowania roztworów organicznych. Mogą one być używane do dozowania etykiet TMT.</td></tr><tr><td>Chipy mikroprzepływowe Mantis, chipy silikonowe o małej objętości</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVS12</td><td>Te chipy są przeznaczone do użytku z manipulatorem cieczy Mantis microfluidics do dozowania roztworów wodnych. Nie można ich używać do dozowania etykiet TMT.</td></tr><tr><td>Maniska mikroprzepływowa obsługa cieczy</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Liquid handler może być zastąpiony przez Mantis. Ważne jest jednak, aby sprawdzić, czy system jest kompatybilny ze 100% acetonitrylem (jak w przypadku etykiet TMT) oraz czy system nie wprowadza do próbek zanieczyszczeń polimerowych lub innego rodzaju zanieczyszczeń.</td></tr><tr><td>Adapter płytki Mantis PCR z szerokimi stożkowymi kołkami do automatycznej obsługi płytek</td><td>Formulatrix</td><td>232400</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina peptydów</td><td>MassPREP Wody</td><td>186002337</td><td>Mieszanina dziewięciu peptydów nietryptycznych</td></tr><tr><td>Wirówka do probówek PCR (tj. 16-miejscowa mikrowirówka do probówek 0,2 ml)</td><td>USA Scientific</td><td>2621-0016</td><td>Ten model nie posiada żadnej kontroli prędkości. Służy po prostu do zbierania płynu na dnie rurek.</td></tr><tr><td>Probówki do PCR: TempAssure 0,2 ml PCR 8-probówkowe paski</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td>W przypadku podstawienia, przed przygotowaniem SCoPE2 należy ocenić poziom potencjalnego zanieczyszczenia polimerem z innych płytek.</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10x, pH 7,4, bez RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka płytkowa (tj. mikrowirówka PlateFuge)</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Model C2000</td><td>Ten model nie posiada żadnej regulacji prędkości. Służy po prostu do zbierania cieczy na dnie studni.</td></tr><tr><td>Termocykler (tj. C1000 Touch z modułem 384-dołkowym)</td>Zestaw odczynników <td>Biorad</td><td>1851138</td><td></td></tr><tr><td>TMTpro 16plex Label, 1 x 5 mg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A44520</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan trietyloamonu (TEAB), 1 M, pH 8,5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408100ML</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometria mas ze złotem trypsynowym</td><td>klasy Promega</td><td>V5280</td><td>Jest to trypsyna o bardzo wysokiej czystości. Inne odczynniki trypsyny mogą różnić się poziomem czystości. Poziom czystości jest ważny dla osiągnięcia pozytywnych wyników SCoPE2. Uwaga: Trypsyna może powodować podrażnienie skóry, dróg oddechowych i oczu. Pamiętaj, aby nosić środki ochrony osobistej. Uchwyt pod wyciągiem chemicznym.</td></tr><tr><td>Vortex (Analogowy mieszalnik wirowy)</td><td>VWR</td><td>Model 58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli wodnej (tj. myjka ultradźwiękowa 2,8 l z cyfrowym timerem)</td><td>VWR</td><td>97043964</td><td></td></tr><tr><td>Woda, Optima LC-MS/MS klasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td>Wszystkie roztwory, które muszą być rozcieńczone lub przygotowane, zaleca się sporządzanie z wodą o spektrometrii mas. Wszelkie rozcieńczenia i/lub mieszanki wzorcowe powinny być świeże. Zanieczyszczenie wynikające z wody o niższej jakości może negatywnie wpływać na wykrywanie peptydów i jakość danych z pojedynczych komórek.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier

Analiza proteomiczna pojedynczej komórki wymaga czułych, ilościowo dokładnych, szeroko dostępnych i solidnych metod. Aby sprostać tym wymaganiom, opracowano protokół Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) jako metodę drugiej generacji do ilościowego oznaczania setek do tysięcy białek z ograniczonych próbek, aż do poziomu pojedynczej komórki. Eksperymenty z wykorzystaniem tej metody pozwoliły na ilościowe określenie ponad 3000 białek w 1500 pojedynczych komórkach ssaków (500-1000 białek na komórkę) w ciągu 10 dni od czasu użycia spektrometru masowego. SCoPE2 wykorzystuje cykl zamrażania i ogrzewania do lizy komórek, eliminując potrzebę czyszczenia pojedynczych komórek, a w konsekwencji zmniejszając straty próbki, jednocześnie przyspieszając przygotowanie próbki i upraszczając jej automatyzację. Dodatkowo w metodzie wykorzystuje się nośnik izobaryczny, który wspomaga identyfikację białek i zmniejsza straty próbki.
Ten protokół wideo zawiera szczegółowe wskazówki, które umożliwiają przyjęcie zautomatyzowanej analizy białek jednokomórkowych przy użyciu tylko sprzętu i odczynników, które są powszechnie dostępne. Pokazujemy krytyczne etapy procedury przygotowania pojedynczych komórek do analizy proteomicznej, od pobrania przez wstrzyknięcie do analizy metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS). Dodatkowo widzowie są prowadzeni przez zasady projektowania eksperymentalnego z nośnikiem izobarycznym, kontrolę jakości zarówno dla nośnika izobarycznego, jak i preparatów jednokomórkowych oraz reprezentatywne wyniki wraz z omówieniem ograniczeń tego podejścia.

Pozytywne wyniki protokołu wymagają weryfikacji prawidłowego wykonania szeregu kluczowych etapów; obejmują one przygotowanie nośnika, izolację pojedynczych komórek, lizę, trawienie, znakowanie kodami kreskowymi oraz optymalizację parametrów MS. Wykresy DO-MS umożliwiają łatwą ocenę stopnia ukończenia każdego krytycznego kroku protokołu. Prawidłowo przygotowany nośnik, który zazwyczaj odpowiada ilości od 25 do 200 komórek (na zestaw), jest dobrze strawiony i dobrze znakowany. Wykresy z DO-MS pozwalają na ilościowe określenie intensywności próbki (w celu oszacowania ilości), wydajności trawienia (idealnie &lt;25% błędnych cięć) oraz wydajności znakowania (musi być &gt;99%). Co najważniejsze, próbki nośnika, które nie zostały całkowicie znakowane, mogą doprowadzić do reakcji krzyżowej z kodami kreskowymi przeznaczonymi dla pojedynczych komórek i wprowadzić fałszywy sygnał do ilościowego oznaczania peptydów pojedynczych komórek.
Studzienki kontrolne ujemne zawierają wszystkie odczynniki eksperymentalne, ale nie zawierają komórki. Pozwala to nie tylko na ocenę szumu tła, ale także na określenie wydajności izolacji komórek poprzez zapewnienie reprezentatywnego sygnału z pustej studzienki. Raport DO-MS oferuje wykresy pozwalające ocenić zmierzony sygnał ze studzienki kontrolnej obok studzienek z pojedynczymi komórkami, aby określić sukces izolacji komórek oraz poziom szumu tła. Dodatkowo jakość ilościowania można ocenić za pomocą potoku SCoPE2 (dostępnego na GitHubie: github.com/SlavovLab/SCoPE2) lub pakietu SCP Bioconductor29.
Wydajności trawienia i znakowania pojedynczych komórek nie można ocenić bezpośrednio, tak jak w przypadku nośnika, jednak metoda DO-MS ponownie dostarcza wykresów umożliwiających oszacowanie wydajności tych procesów. Poprzez dołączenie kontroli składającej się ze 100-200 komórek równolegle z przygotowaniem pojedynczych komórek (tzn. z zastosowaniem wszystkich tych samych dodatków odczynników), można ocenić wydajność trawienia i znakowania dla tej kontroli i przyjąć, że jest ona taka sama dla przygotowanych równolegle pojedynczych komórek. Słabe trawienie będzie objawiać się wysokim stosunkiem intensywności peptydów nieprawidłowo rozszczepionych do ich całkowicie rozszczepionych odpowiedników (Rysunek 1).
Kolejnym czynnikiem do rozważenia w zestawach jest frakcja brakujących danych oraz mediana intensywności jonów reporterowych w każdym kanale TMT (Rysunek 2). W przypadku pomyślnie przygotowanych pojedynczych komórek ilość brakujących danych na komórkę i kontrolę pozytywną jest znacznie niższa niż w próbkach kontrolnych negatywnych. Podobnie mediana intensywności prekursorów jest znacznie wyższa w pojedynczych komórkach i kontrolach pozytywnych niż w kontrolach negatywnych. Optymalizacja parametrów MS została szeroko omówiona w innych publikacjach21, a optymalne parametry można wyznaczyć przy użyciu takich narzędzi jak DO-MS lub SCP Companion25,27.
<img alt="Wykresy słupkowe efektywności znakowania i trawienia; porównania N-końca, pozycji K oraz % błędnego cięcia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Kontrola jakości przygotowania nośnika. Wykresy DO-MS przedstawiające (A) efektywność znakowania prawidłowo przygotowanego nośnika w miejscach znakowania TMT: aminy pierwszejnejnej w łańcuchu bocznym lizyny oraz N-końca peptydowego, i (B) efektywność trawienia w pozostałościach aminokwasowych cięcia trypsynowego. Skrót: TMT = tandem mass tag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza TMT pojedynczych komórek: A) frakcja brakujących danych, B) intensywność log10; wykres mapy ciepła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Kontrola jakości preparatyki pojedynczych komórek. Wykresy DO-MS przedstawiające (A) frakcję brakujących danych w pojedynczych komórkach (C5-10), kontrolach (C13,16), nośniku (C1) i referencji (C2) oraz (B) intensywność pojedynczych komórek i kontroli. Znaczniki 127C, 128N, 131C, 132N, 133N oraz 133C, odpowiadające C3, C4, C11, C12 i C15, nie są użyte w tym konkretnym zestawie. Kontrola pozytywna składa się z materiału komórkowego przetworzonego do peptydów w masie, a następnie rozcieńczonego do poziomu 2-5 komórek/μL przed znakowaniem. Kontrola negatywna składa się z studzienki poddanej wszystkim etapom preparatyki stosowanym dla pojedynczych komórek, jednak bez dodania pojedynczej komórki. Skrót: TMT = tandem mass tag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

W tym protokole opisujemy, jak przygotować komórki ssaków do analizy proteomicznej pojedynczej komórki za pomocą spektrometrii mas przy użyciu dostępnych na rynku odczynników i sprzętu, z opcjami zarówno ręcznego, jak i automatycznego pipetowania.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Single-cell proteomics analysis requires sensitive, quantitatively accurate, widely accessible, and robust methods. To meet these requirements, the ...

SCoPE2 może oznaczać ilościowo tysiące białek z tysięcy pojedynczych komórek ssaków bez przeciwciał. Protokół ten może pomóc w odkryciu heterogeniczności proteomu, która w przeciwnym razie byłaby niewidoczna w analizach masowych. Proteomika pojedynczych komórek, wykorzystująca podejście SCoPE2, została zaprojektowana tak, aby była dostępna dla badaczy dysponujących szeregiem zasobów, od pipety po robotykę zajmującą się obsługą cieczy.SCoPE2 ma szerokie zastosowanie w wielu obszarach badawczych, w tym w raku i immunologii, dostarczając informacji na temat różnic w obfitości białek między pojedynczymi komórkami z tej samej populacji. Aby rozpocząć, rozpocznij procedurę lizy komórek, umieszczając 384-dołkową płytkę z posortowanymi pojedynczymi komórkami w termocyklerze, podgrzewając ją przez 10 minut w temperaturze 90 stopni Celsjusza, a następnie schładzając w temperaturze 12 stopni Celsjusza. Krótko zakręć talerzem w wirówce stołowej w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza.Sonikować płytkę przez pięć minut w łaźni wodnej w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza. Następnie umieść go na lodzie. Aby przystąpić do trawienia trypsyny, przygotuj 100 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i dodaj 0,2 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 384-dołkowej za pomocą płynnego uchwytu.Uszczelnij płytkę, wiruj przez pięć sekund i wiruj w stołowej wirówce do płytek w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza. Podgrzewaj płytkę 384-dołkową przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy temperaturze pokrywki ustawionej na 52 stopnie Celsjusza. Aby ustawić tandemową reakcję znakowania masowego, wyjmij 85-milimolowe zapasy tandemowych znaczników masy z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Przed ich otwarciem podgrzej probówki do temperatury pokojowej i rozcieńcz etykiety do 22 milimoli w bezwodnym acetonitrylu. Korzystając z tej strategii etykietowania, dodaj 0,5 mikrolitra rozcieńczonych znaczników masy tandemowej do każdego dołka płytki 384-dołkowej, używając robota dozującego ciecz lub pipety ręcznej. Uszczelnij płytkę, wiruj przez pięć sekund i wiruj w stołowej wirówce do płytek w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza.Pozwól, aby reakcja etykietowania przebiegała w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza przez godzinę. W celu wygaszenia tandemowej reakcji znakowania masy, dodać 0,2 mikrolitra 0,5% hydroksyloaminy, rozcieńczonej w wodzie klasy HPLC, do każdej studzienki płytki 384-dołkowej za pomocą płynu. Uszczelnij płytkę, wiruj przez pięć sekund i odwiruj w stołowej wirówce do talerzy, a następnie utrzymuj płytkę w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza przez 30 minut.Przygotowanie analizy LC-MS rozpoczyna się od usunięcia połączonego nośnika lub materiału odniesienia z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Dla każdego zestawu należy odpipetować jeden mikrolitr nośnika i materiału referencyjnego do pierwszego dołka, który będzie częścią jednego zestawu. Odpipetować całą objętość od pierwszego dołka do kolejnego dołka.Kontynuuj pipetowanie całej objętości z jednego dołka do drugiego, aż wszystkie studzienki wchodzące w skład jednego zestawu zostaną połączone w ostatnim dołku. Do każdego zestawu dodaj pięć mikrolitrów 50% acetonitrylu rozcieńczonego w wodzie klasy HPLC, aby uzyskać pierwszą studzienkę z pojedynczą komórką, która zostanie włączona do każdego zestawu. Odpipetować całą objętość od pierwszego dołka do kolejnego dołka.Kontynuuj pipetowanie całej objętości z jednej komórki do drugiej, aż wszystkie studzienki wchodzące w skład jednego zestawu zostaną połączone w ostatnim dołku. Teraz przenieś każdy zestaw do szklanych wkładów do automatycznego podajnika próbek. Wysuszyć próbki po połączeniu wszystkich zestawów i umieszczeniu ich w szklanych wkładkach.Przed analizą LC-MS-MS dodaj 1,2 mikrolitra 0,1% kwasu mrówkowego do każdego zestawu, aby ponownie zawiesić znakowane peptydy. Umieść wkładki automatycznego podajnika próbek w szklanych fiolkach z automatycznym podajnikiem próbek i zamknij każdą próbkę nakrętką. Wirować każdą fiolkę przez pięć sekund, aby upewnić się, że ponowne zawieszenie zostało zakończone, a następnie odwirować w wirówce do fiolki w temperaturze od 18 do 22 stopni Celsjusza.Upewnij się, że każda próbka znajduje się na dnie wkładki, a nie jest rozpryskiwana po bokach. Umieść fiolki w tacce automatycznego podajnika próbek i dla każdego zestawu wstrzyknij jedną mikrolitrową próbkę do analizy LC-MS-MS. Wydajność trawienia i etykietowania pojedynczych komórek może nie być bezpośrednio badana, jak w przypadku nośnika, ale oprogramowanie DO-MS zapewnia wykresy, które szacują wydajność trawienia i etykietowania.Na słabe trawienie wskazuje wysoki stosunek intensywności nieprawidłowo rozszczepionych peptydów do ich całkowicie rozszczepionych odpowiedników. Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę w zestawach, jest odsetek brakujących danych w medianie intensywności jonów reporterowych w każdym kanale znakowania masy tandemowej. Gdy pojedyncze komórki są pomyślnie przygotowane, brakujące dane na komórkę i kontrola pozytywna są znacznie niższe niż w przypadku próbek kontroli ujemnej.Ostrożne obchodzenie się z cieczą podczas przygotowywania próbki LC-MS-MS ma kluczowe znaczenie dla maksymalnego odzysku peptydów. Małe próbki o wielkości od około 100 pikogramów do 100 nanogramów na studzienkę można przygotować do analizy proteomicznej przy użyciu nośnika izobarycznego. SCoPE2 sprawia, że pomiary proteomiki pojedynczych komórek są dostępne dla naukowców na całym świecie, przy użyciu wyłącznie powszechnie stosowanych odczynników i dostępnego na rynku sprzętu.Jest podatny na ręczne przetwarzanie lub automatyzację o wysokiej przepustowości dzięki zrobotyzowanej obsłudze cieczy.

single-cell-proteomics-preparation-for-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Tutaj opisujemy proces proteomiki do charakterystyki proteomu powierzchni komórki różnych typów komórek. Ten przepływ pracy obejmuje wzbogacanie białek na powierzchni komórki, późniejsze przygotowanie próbki, analizę przy użyciu platformy LC-MS/MS oraz przetwarzanie danych za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

Szczegółowy protokół jest dostarczony do czyszczenia i ponownego użycia probówek ultrawirówek z poliwęglanu do przeprowadzenia izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych odpowiednich do eksperymentów proteomicznych.

Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Poznaj metodę SCoPE2 do proteomiki jednokomórkowej z wykorzystaniem spektrometrii mas i izobarycznych znaczników tandemowych. Ta technika umożliwia ilościowe oznaczanie tysięcy białek z pojedynczych komórek ssaków bez użycia przeciwciał.

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie proteomiki jednokomórkowej do analizy spektrometrii mas z wykorzystaniem lizy cieplno-zamrażalniczej i nośnika izobarycznego

Przeglądaj więcej filmów