Name: Iniekcje doszklistkowe do oka owcy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: Poznaj protokół iniekcji doszklistkowych do oka owcy jako modelu ludzkiego oka. Ta metoda dostarcza terapię genową do siatkówki w leczeniu zwyrodnienia siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dr. Steve'owi Heapowi (BVSc, CertVOphthal) za pomoc w ustanowieniu tego protokołu i wykonaniu zastrzyków opisanych przez Murraya i wsp.15. Autorzy potwierdzają również finansowanie ze strony CureKids New Zealand, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc oraz Batten Disease Support and Research Association.

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. zwierząt Uniwersytetu w Lincoln i są zgodne z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) USA dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w badaniach oraz nowozelandzką ustawą o dobrostanie zwierząt (Animal Welfare Act z 1999 r.). Owce rasy Borderdale zdiagnozowano przy urodzeniu14 i utrzymywano na farmach badawczych Uniwersytetu w Lincoln. Trzy 3-miesięczne homozygotyczne (CLN5-/-) owce otrzymały pojedynczy wtrysk dopasychowy (IVT) do lewego oka, podczas gdy nieleczone prawe oko służyło jako kontrola wewnętrzna. Dane z elektroretinografii i badania patomorfologiczne porównano z historycznymi danymi kontrolnymi dla osobników zdrowych i chorych. Wektor wirusowy użyty w tej badaniu był samouzupełniającym wirusem adeno-zależnym serotypu 9, zawierającym promotor kurzej beta-aktyny (CBh) oraz zoptymalizowany kodon owczego CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt). Wektor wirusowy został dostarczony przez University of North Carolina Vector Core, NC, USA.
1. Przed operacją
<ol>
	<li>Zautoklawuj zestaw chirurgiczny (Rysunek 1).</li>
	<li>Poddaj owce 24-godzinnemu postowi przed operacją.</li>
	<li>Zapisz masę żywą zwierząt przed operacją.</li>
</ol>
<img alt="Zestaw chirurgiczny z zaciskiem hemostatycznym, pęsetą i uchwytem do drutu na niebieskiej sterylerce do procedur medycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zestaw do chirurgii witreoretinalnej. Instrumenty wymagane do zabiegu IVT obejmują (1) rozwierak do utrzymania otwartych powiek oraz (2) pęsetę z zakrzywionymi końcami do uchwycenia spojówki bulbarnej i rotacji gałki ocznej. (3) Zestaw zawiera również prosty zacisk hemostatyczny jako alternatywny instrument do chwytania spojówki bulbarnej i stabilizacji oka w sytuacji, gdy cofnie się ono do oczodołu. Zestaw ten jest autoklawowany przed zabiegiem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Procedura chirurgiczna
<ol>
	<li>Unieruchom zwierzę i za pomocą elektronicznej maszynki do strygła usuń wełnę z jednej strony szyi nad żyłą szyjną.</li>
	<li>Zatamuj żyłę szyjną, wywierając nacisk u podstawy bruzdy szyjnej, i zlokalizuj wyniesienie żyły.</li>
	<li>Pobierz odpowiednią ilość diazepamu (0,3 mg/kg) i ketaminy (7,5 mg/kg) do sterylnej strzykawki i załóż sterylną igłę 20 G. Wprowadź igłę do żyły szyjnej i delikatnie odciągnij tłok, aby upewnić się, że krew dostaje się do piasty i igła znajduje się wewnątrz żyły. Po potwierdzeniu podaj leki dożylnie (do żyły szyjnej).</li>
	<li>Bezpośrednio po indukcji ułóż zwierzę na plecach, wyprostuj szyję i odciągnij język w górę i do przodu, używając laryngoskopu do wizualizacji krtani. Wykonaj intubację dotchawiczą, delikatnie wprowadzając rurkę endotrachealną (rozmiar 6,0-9,0 w zależności od wielkości owcy) między struny głosowe podczas wydechu zwierzęcia. Natychmiast napompuj mankiet rurki i zabezpiecz ją wiązaniem wokół dolnej szczęki. Potwierdź przepływ powietrza przez rurkę.</li>
	<li>Przenieś owcę na stół operacyjny i ułóż ją w pozycji bocznej.</li>
	<li>Niezwłocznie podłącz rurkę endotrachealną do przewodów aparatu do znieczulania w celu podawania isofluranu w 100% tlenie. Rozpocznij od stężenia 3%-4% isofluranu, a następnie zmniejsz je do 2%-3% w celu podtrzymania znieczulenia. Obserwuj spontaniczną wentylację owcy.</li>
	<li>Przez cały czas trwania procedury monitoruj częstotliwość akcji serca (tętno), częstotliwość oddechów, saturację tlenową, poziom końcowego CO2 oraz temperaturę ciała mierzoną w odbycie. Wartości fizjologiczne tych parametrów dla znieczulonych owiec (zmienne, traktowane jako wytyczne) znajdują się w Tabeli 1.</li>
	<li>Połóż dużą, sterylną, kwadratową chustę na wózku operacyjnym, a następnie ułóż na niej sterylne instrumenty.</li>
	<li>Załóż sterylną, otwórzchustę chirurgiczną nad okiem, w które będzie wykonywany zastrzyk.</li>
	<li>Aseptycznie zdezynfekuj oko, używając sterylnej strzykawki 20 mL do przemycia oka 1-5% roztworem powidon-jodu.</li>
	<li>Do oka zakropl 1-2 krople 0,5% W/V roztworu okulistycznego Alcaine jako znieczulenia miejscowego.</li>
	<li>Załóż rozwierak do powiek Nopa Barraquer-Colibri (10 mm), aby utrzymać oko w pozycji otwartej.</li>
	<li>Chwyć pęcherzykowo-spojówkową część spojówki po stronie grzbietowo-bocznej oka za pomocą pęsety i obróć gałkę oczną w kierunku brzuszno-przyśrodkowym.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Świadomy</td>
			<td>Zanawione (pod wpływem znieczulenia)</td>
			<td>Zalecany krytyczny punkt interwencji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Częstość akcji serca (uderzeń/min)</td>
			<td>50-80 (spoczynek) do 280 (aktywność)</td>
			<td>50-80</td>
			<td>&lt;50, &gt;100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Częstość oddechów (oddechów/min)</td>
			<td>15-40 (spoczynek) do 350 (przegrzanie)</td>
			<td> 10-30</td>
			<td>&lt;8, &gt;40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturacja tlenem (mm Hg)</td>
			<td>95-100</td>
			<td>98-100</td>
			<td>&lt;90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO końcowodobowe2 (mm Hg)</td>
			<td>35-45</td>
			<td>35-45</td>
			<td>&gt;55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura ciała (˚C)</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>&lt;36, &gt;40</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wartości fizjologiczne parametrów monitorowanych u znieczulonych owiec.
3. Przygotowanie wirusa
<ol>
	<li>Przechowywać alikwoty wektora AAV w temperaturze −80 ˚C do momentu użycia.</li>
	<li>W dniu operacji rozmrozić na lodzie wymaganą liczbę fiolek do podania drogą IVT.</li>
	<li>Bezpośrednio przed podaniem wymieszać alikwot wektora wirusowego w wortexie, a następnie odwirować przy 400 × g przez 10 s w celu zebrania zawartości.</li>
	<li>Rozcieńczyć każdą alikwotę wektora wirusowego w sterylnym, filtrowanym 1x roztworze soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do pożądanej dawki w końcowej objętości 100 µL. Rozcieńczenia wektora przygotować w sterylnej probówce do mikrocentryfugi o objętości 1,5 mL z niskim wiązaniem białek, używając sterylnych końcówek z filtrem. Wszystkie materiały eksploatacyjne, które miały kontakt z wektorem wirusowym, należy utylizować w roztworze dezynfekującym (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: W oryginalnej publikacji15 dawka czynnika terapeutycznego (AAV9.CLN5) wynosiła 1,9 x 1010 genomów wirusowych. Zalecane dawkowanie będzie zależeć od podawanego czynnika terapeutycznego; dlatego w przedstawionym tutaj standardowym protokole nie podano konkretnej dawki.</li>
	<li>Nabrać pełne 100 µL preparatu wektora AAV do sterylnej strzykawki o objętości 1 mL z niską przestrzenią martwą, z na stałe przymocowaną igłą 28 G x 1/2 in, do natychmiastowego wstrzyknięcia. Należy upewnić się, że czas od przygotowania do wstrzyknięcia nie przekracza 2 min.</li>
</ol>
4. Podawanie wirusa
<ol>
	<li>Wprowadzić igłę około 7 mm za twardówkę po bocznej stronie oka, pod kątem skierowanym do tyłu, aby uniknąć uszkodzenia soczewki (Rycina 2 i Rycina 3). Podać jednorazowy wtrysk 100 µL w formie bolusa tak blisko siatkówki, jak to możliwe, nie naruszając jej powierzchni.</li>
	<li>Przepłukać oko około 10-15 mL roztworem powidoniodyny 1-5%, a następnie 10 mL soli fizjologicznej przed usunięciem wziernika i sterylnej draperii.</li>
	<li>Odwrócić owcę i w razie potrzeby powtórzyć procedurę w drugim oku.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procedury chirurgicznej z dyssekcją gałki ocznej, z wyróżnieniem ustawienia i pozycjonowania mięśni oka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Rotacja brzuszno-przyśrodkowa gałki ocznej. (A) Chwyć spojówkę bulwiową za pomocą pęsety bezzębnej i (B) wykonaj rotację brzuszno-przyśrodkową (tj. w dół i w stronę pyska), aby odsłonić grzbietowo-boczną powierzchnię oka w celu wykonania iniekcji. Skróty: V = brzuszna, D = grzbietowa, M = przyśrodkowa, L = boczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procedura chirurgiczna z użyciem rozdzielaczy i strzykawki w środowisku sterylnym, przedstawiająca konfigurację operacyjną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Miejsce i głębokość iniekcji. Igła jest wprowadzana w grzbietowo-boczną część gałki ocznej, a cała długość trzonu igły (0.5 in/12.7 mm) zostaje wprowadzona do oka. Należy zwrócić uwagę na kąt nachylenia igły w stronę tylnej części oka, aby uniknąć uszkodzenia soczewki i wstrzyknąć preparat jak najbliżej siatkówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Po zakończeniu procedury przerwać znieczulenie inhalacyjne izofluranem, przemyć linię 100% tlenem, odłączyć wąż od rurki endotrachealnej i przenieść owcę do pomieszczenia wybudzeniowego.</li>
	<li>Ułożyć owcę w pozycji brzusznej, z nogami podwiniętymi pod ciało, i monitorować do czasu pełnego wybudzenia. Upewnić się, że w jamie ustnej zwierzęcia nie ma żadnych przeszkód.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu odruchu połykania częściowo spuścić powietrze z mankietu rurki endotrachealnej i delikatnie usunąć rurkę z pyska.</li>
	<li>Podać domięśniowo niesteroidowy lek przeciwzapalny w mięsień dwugłowy uda kończyny tylnej, antybiotyki podskórnie w okolicy szyi lub za łopatką oraz 0,5% krople do oczu z chloramfenikolem na powierzchnię gałki ocznej.</li>
	<li>Zapewnić wodę i pokarm (granulaty lucerny i sieczkę), gdy owca będzie w stanie samodzielnie stać.</li>
	<li>Podać 0,5% krople do oczu z chloramfenikolem 2-3 razy dziennie przez 7 dni po operacji.</li>
	<li>Trzymać owcę w pomieszczeniu przez noc, a następnie zwrócić ją na wybieg zewnętrzny około 24 h po operacji.</li>
	<li>Codziennie przez 3 tygodnie mierzyć temperaturę rektalną. Monitorować wszelkie zmiany tętna lub częstości oddechów, spożycie pokarmu, zachowanie neurologiczne, temperaturę ciała, masę ciała, postawę, stan oczu oraz kliniczne objawy złego stanu zdrowia. W przypadku wystąpienia jakichkolwiek oznak zdarzeń niepożądanych zastosować odpowiednie leczenie weterynaryjne.</li>
</ol>
6. Ocena skuteczności in vivo
<ol>
	<li>Jeśli celem wstrzyknięcia do ciała szklistego (IVT) jest zachowanie wzroku, należy monitorować skuteczność in vivo za pomocą takich metod jak testy labiryntowe lub elektroretinografia (ERG) w celu oceny funkcji komórek siatkówki lub optyczna koherentna tomografia (OCT) w celu oceny struktury siatkówki. 
	UWAGA: Miary skuteczności te zostały dobrze opisane po zastosowaniu terapii genowej IVT11,15,16.</li>
</ol>
7. Analiza tkanek pośmiertnych
<ol>
	<li>Przeprowadzić eutanazję owiec zatwierdzoną metodą w odpowiednim punkcie końcowym po operacji wstrzyknięcia domacicowego. 
	UWAGA: Sugerowane metody eutanazji, takie jak dożylne podanie weterynaryjnych leków eutanatycznych lub użycie penetrującego pistoletu ogłuszającego w kręgosłup szyjny z następującą szybką eksangwinacją, zostały szczegółowo opisane w innych źródłach15,16.</li>
	<li>Pobrać gałki oczne owiec, używając chirurgicznych zakrzywionych nożyc ostrych i tępych. Przeciąć kąciki boczny i przyśrodkowy, aby powiększyć otwór oczodołu, a następnie systematycznie przeciąć fałdy spojówki, tkankę łączną, mięśnie i nerw wzrokowy, aby uwolnić gałkę oczną z oczodołu.</li>
	<li>Utrwalić nienaruszone, enukleowane gałki oczne poprzez imersję w 10% formalinie przez 2 h, a następnie przeprowadzić postfixację w roztworze Bouina przez 4 h, wykonując małe (0,5 cm) nacięcie w twardówce, aby zapewnić odpowiednią perfuzję. Alternatywnie, utrwalić gałki oczne poprzez imersję w roztworze Davidsona przez 48 h.</li>
	<li>Przetworzyć fragmenty tkanki oka poprzez rutynowe zatopienie w parafinie i wycinanie seryjnych skrawków o grubości 3-5 µm. 
	UWAGA: Procedury barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) oraz analizy immunohistochemicznej zostały opisane wcześniej15,16.</li>
	<li>Ocenić skuteczność w tkance pośmiertnej za pomocą takich miar jak całkowita grubość siatkówki, grubość warstw siatkówki, liczba rzędów komórek w zewnętrznej warstwie jądrowej oraz barwienie immunohistochemiczne w kierunku typów komórek siatkówki, glei siatkówkowej lub białek zainteresowania. 
	UWAGA: Protokoły dla tych analiz znajdują się w poprzednich publikacjach15,16.</li>
</ol>

<ol><li>Himawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+retinal+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to retinal photoreceptors.</a> Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).</li>
<li>Murray, S. J., Mitchell, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+therapies+for+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%3A+More+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye.</a> Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).</li>
<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).</li>
<li>Grzybowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((update+on+intravitreal+injections%3A+Euretina+expert+consensus+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations.</a> Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).</li>
<li>Pavlou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+AAV+capsids+for+intravitreal+gene+therapy+of+photoreceptor+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392(2021).</li>
<li>Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+mutation+spectrum+and+clinical+correlations+of+over+360+mutations+in+eight+genes+that+underlie+the+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).</li>
<li>Wibbeler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerliponase+alfa+for+the+treatment+of+atypical+phenotypes+of+CLN2+disease%3A+A+retrospective+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series.</a> Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+intraventricular+cerliponase+alfa+for+CLN2+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).</li>
<li>Mitchell, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+in+vivo+monitoring+of+the+CNS+demonstrates+the+efficacy+of+gene+therapy+in+a+sheep+model+of+CLN5+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease.</a> Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).</li>
<li>Murray, S. J., Mitchell, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+retinal+degeneration+in+ovine+models+of+CLN5+and+CLN6+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Scientific Reports. 12 (1), 3670(2022).</li>
<li>Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinography+data+from+ovine+models+of+CLN5+and+CLN6+neuronal+ceroid+lipofuscinoses%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses.</a> Data in Brief. 37, 107188(2021).</li>
<li>Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+and+allometric+prediction+of+vitreous+volume%2C+and+retina+and+lens+weights+in+G%C3%B6ttingen+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs.</a> Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).</li>
<li>Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+ganglion+cells+and+photoreceptors+in+the+sheep+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).</li>
<li>Frugier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+large+animal+model+of+CLN5+neuronal+ceroid+lipofuscinosis+in+Borderdale+sheep+is+caused+by+a+nucleotide+substitution+at+a+consensus+splice+site+%28c.571%2B1G%3EA%29+leading+to+excision+of+exon+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3.</a> Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).</li>
<li>Murray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+gene+therapy+protects+against+retinal+dysfunction+and+degeneration+in+sheep+with+CLN5+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease.</a> Experimental Eye Research. 207, 108600(2021).</li>
<li>Ross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+retinal+transduction+by+AAV2-7m8+following+intravitreal+injection+in+a+sheep+model+of+CNGA3+achromatopsia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia.</a> Gene Therapy. , (2021).</li>
<li>Boyd, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor-targeted+gene+delivery+using+intravitreally+administered+AAV+vectors+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs.</a> Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-directed+evolution+of+a+new+adeno-associated+virus+for+therapeutic+outer+retinal+gene+delivery+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous.</a> Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).</li>
<li>Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+visual+performance+with+intravitreal+administration+of+9-cis-retinal+in+Rpe65-mutant+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs.</a> Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).</li>
<li>Ross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+photoreceptor+transduction+efficacy+of+capsid-modified+adeno-associated+viral+vectors+following+intravitreal+and+subretinal+delivery+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).</li>
<li>Kotterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+neutralization+poses+a+barrier+to+intravitreal+adeno-associated+viral+vector+gene+delivery+to+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates.</a> Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).</li>
<li>Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immune+responses+to+AAV+gene+therapy+in+the+ocular+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment.</a> Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).</li>
<li>Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subconjunctival+hemorrhage+after+intravitreal+injection+of+anti-vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).</li>
<li>Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+needle+forces+and+acute+pressure+changes+during+intravitreal+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).</li>
<li>Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+pressure+and+injection+forces+during+intravitreal+injection+into+enucleated+porcine+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).</li>
<li>Ross, M., Ofri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+retinal+gene+therapy%3A+Evolving+from+subretinal+to+intravitreal+vector+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery.</a> Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).</li>
<li>Henein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+of+intravitreal+injections+into+liquid+vitreous+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes.</a> Pharmaceutics. 11 (8), 371(2019).</li>
<li>Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+intraocular+pressure+variation+during+automatic+intravitreal+injections%3A+An+ex-vivo+experimental+study+using+porcine+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes.</a> PloS One. 16 (8), 0256344(2021).</li>
<li>Willekens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreally+injected+fluid+dispersion%3A+Importance+of+injection+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).</li>
<li>Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+models+to+study+drug+delivery+barriers+in+the+posterior+segment+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).</li>
<li>Kiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Considerations+for+Ocular+Gene+Therapy.+Adeno-associated+virus+vectors+offer+a+safe+and+effective+tool+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Retinal+Physician%22%5BJournal%5D)">Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery.</a> Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+targeting+the+inner+retina+rescues+the+retinal+phenotype+in+a+mouse+model+of+CLN3+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+brain-directed+gene+therapy+rescues+a+mouse+model+of+neurodegenerative+CLN6+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease.</a> Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zastrzyki doszklistkowe są jednym z najczęstszych zabiegów chirurgicznych w okulistyce człowieka i okazały się skuteczne w dostarczaniu terapii genowych za pośrednictwem AAV do siatkówki owiec. Wcześniej wykazaliśmy skuteczność AAV9. Terapia genowa CLN5 podawana doszklistkowo w celu osłabienia dysfunkcji i zwyrodnienia siatkówki u owiec z CLN5 NCL15. Oczekuje się, że przełożenie tej drogi podawania na pacjentów z NCL u ludzi również okaże się korzystne.
Protokół wstrzyk...

Kilka metod może być użytych do dostarczania środków terapeutycznych do siatkówki, w tym doszklistkowe (IVT), podsiatkówkowe, naczyniówkowe, okołogałkowe lub miejscowe. Każda droga podania obejmuje pokonywanie barier, takich jak bariera krew-siatkówka lub wewnętrzna i zewnętrzna błona ograniczająca, i ma różne wskaźniki skuteczności w zależności od podawanego leku i konkretnego celu siatkówki1,2.
Dostarczanie leków IVT polega na wstrzyknięciu do ciała szklistego oka, galaretowatej substancji, która zajmuje tylną komorę oka. Podstawową funkcją ciała szklistego jest utrzymanie kształtu gałki ocznej i utrzymanie tkanek oka, takich jak soczewka i siatkówka, na miejscu. Ciało szkliste składa się głównie z wody, z niewielkimi ilościami kolagenu, kwasu hialuronowego i innych białek niekolagenowych3. Wstrzyknięcie IVT jest prostą i powszechną procedurą stosowaną rutynowo w leczeniu szerokiego zakresu schorzeń oczu, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, cukrzycowego obrzęku plamki, retinopatii cukrzycowej, niedrożności żył siatkówki i kilku dziedzicznych dystrofii siatkówki4,5.
Neuronalne lipofuscynozy ceroidowe (NCL; Choroba Battena) to grupa śmiertelnych lizosomalnych chorób spichrzeniowych, które powodują poważne zwyrodnienie mózgu i siatkówki. Obecnie znanych jest 13 wariantów NCL wynikających z mutacji w różnych genach (CLN1-8, CLN10-14), które dotykają głównie dzieci, ale mają różny wiek zachorowania i nasilenie choroby6. NCL mają wspólne postępujące objawy, w tym pogorszenie funkcji poznawczych i motorycznych, drgawki i utratę wzroku. Nie ma lekarstwa na NCL; jednak ukierunkowana na mózg enzymatyczna terapia zastępcza jest obecnie w badaniach klinicznych nad chorobą CLN27,8, a terapia genowa za pośrednictwem AAV okazała się bardzo obiecująca w badaniach przedklinicznych, a badanie kliniczne terapii genowej CLN5 ma się rozpocząć w 2022 roku9,10.
Wiele innych gatunków rozwija naturalnie występujące formy NCL, w tym koty, psy, owce i krowy. W Nowej Zelandii prowadzone są obecnie aktywne badania nad dwoma owczymi modelami NCL: modelem choroby CLN5 u owiec rasy Borderdale i modelem choroby CLN6 u owiec z South Hampshire. Owce dotknięte chorobą wykazują wiele klinicznych i patologicznych cech choroby ludzkiej, w tym zanik siatkówki i utratę wzroku10,11. Chociaż ukierunkowana na mózg terapia genowa CLN5 u owiec z chorobą CLN5 może zapobiec lub zatrzymać atrofię mózgu i pogorszenie stanu klinicznego, leczone owce nadal tracą wzrok9. Uwypukliło to potrzebę leczenia siatkówki w celu zachowania wzroku i utrzymania lepszej jakości życia, co doprowadziło do ustanowienia protokołu terapii genowej oka u owiec.
Oko owcy reprezentuje dobry model ludzkiego oka ze względu na podobieństwo w wymiarach gałki oka, objętości ciała szklistego i budowie siatkówki10,12,13. W tym artykule szczegółowo opisano protokół chirurgiczny dostarczania do lekarza dożylnie małej objętości (≤100 μl) terapeutycznego wektora wirusowego do oka owcy.

<table><tbody><tr><td>Bezpieczna strzykawka o pojemności 1 ml z igłą 0,5 cala przymocowaną na stałe Fisher</td><td>Scientific, Auckland, Nowa Zelandia</td><td>05-561-28</td><td>Bezpieczna strzykawka Covidien Monoject Tuberculin lub podobna</td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówki 1,5 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4323</td><td>Probówki autoklawowe do sterylizacji przed użyciem</td></tr><tr><td>Maszyna do znieczulenia z ławką gazową i monitorem&nbsp;</td><td>Hyvet Anesthesia, Christchurch, Nowa Zelandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowe krople do oczu&nbsp;</td><td>Teva Pharma Ltd, Auckland, Nowa Zelandia</td><td></td><td>Nazwa handlowa: Chlorafast (0,5% chloramfenikol)</td></tr><tr><td>BrightMount plus anti-fade medium montażowe</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>ab103748</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime; ,dichlorowodorek 6-diamidino-2-fenyloindolu)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Diazepam środek uspokajający</td><td>Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td></td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Rurki dotchawicze</td><td>Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, Wielka Brytania</td><td></td><td>Standard, mankietowe. Rozmiary 7, 7,5 lub 8 w zależności od wielkości owiec</td></tr><tr><td>Wziernik do oczu</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td>KP151/14</td><td>Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)</td></tr> <tr><td>Serweta chirurgiczna z okienkiem</td><td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, Nowa Zelandia</td><td>DI583</td><td>Lub podobne&nbsp;</td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące</td><td>Interlab, Auckland, Nowa Zelandia</td><td></td><td>10, 200 i 1,000 &mikro; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu (37%)</td><td>Fisher Scientific, Auckland, Nowa Zelandia</td><td>AJA809-2.5PL</td><td>Uzupełnij do 10% w wodzie destylowanej z 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Kozioł anty-królik Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen Carlsbad, CA, USA&</td><td>nbsp; A-11012</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:500</td></tr><tr><td>Izofluran znieczulający</td><td>Attane, Bayer Animal Health, Auckland, Nowa Zelandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl środek znieczulający/przeciwbólowy</td><td>PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, Nowa Zelandia</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Laryngoskop (weterynaryjny)</td><td>KaWe Medical, Dania</td><td></td><td>Ostrze Miller C, rozmiar 2</td></tr><tr><td>Igły&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td>302025</td><td>Igły podskórne BD lub podobne</td></tr><tr><td>Niesteroidowe przeciwzapalne</td><td>Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, Nowa Zelandia</td><td>49402/008</td><td>Nazwa handlowa: Metacam 20 (20 mg/ml meloksykamu)</td></tr><tr><td>Kleszcze niezębate</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td>AB864/16</td><td>Lub podobne&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemostat bezzębny</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td>AA150/12</td><td>Lub podobny&nbsp;</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nowa Zelandia</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Tlen (medyczny)</td><td>BOC Gas, Christchurch, Nowa Zelandia</td><td></td><td>Butla D2, kod gazu 180</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nowa Zelandia</td><td>10010023</td><td>Sterylny, przefiltrowany</td></tr><tr><td>roztwór powidonu i jodu</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td>005835</td><td>Nazwa handlowa: Betadine (10% jodu powidonu)</td></tr><tr><td>Królik anty-krowie białko fibrylarne fibrylarne (GFAP)</td><td>Dako, Glostrup, Dania</td><td>Z0334</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1:2,500</td></tr><tr><td>Samouzupełniający się serotyp 9 wirusa związanego z adenowirusem, zawierający promotor działania beta kurczaka (CBh) i zoptymalizowany pod kątem kodonów CLN5 owiec</td> University <td>of North Carolina Vector Core, NC, USA.</td><td>scAAV9/CBh-oCLN5opt</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu 0,9% roztwór dożylny</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td>AHB1322</td><td>Nazwa handlowa: Roztwór soli fizjologicznej&nbsp;</td></tr><tr><td>Antybiotyki podskórne</td><td>Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, Nowa Zelandia</td><td></td><td>Nazwa handlowa: Duplocillin LA (150 000 IU/ml penicyliny prokainowej i 115 000 IU/ml penicyliny benzatynowej 115 000 IU/mL penicyliny benzatynowej</td></tr> Ostre<tr><td>, zakrzywione nożyczki&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nowa Zelandia</td><td>SSSHBLC130</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Strzykawka Luer Lock</td><td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, Nowa Zelandia</td><td>SH159/SH160</td><td>Sterylne strzykawki; 10 ml do sporządzania leków indukcyjnych, 20 ml do sporządzania soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant Powder</td><td>EBOS Group Ltd, Christchurch, Nowa Zelandia 28461115</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

iniekcje doszklistkowe do oka owcy

Intravitreal Injections in the Ovine Eye

Istnieje kilka metod dostarczania środków terapeutycznych do siatkówki, w tym doszklistkowe (IVT), podsiatkówkowe, naczyniówkowe, okołogałkowe lub miejscowe. Podawanie leku IVT polega na wstrzyknięciu do ciała szklistego oka, galaretowatej substancji, która wypełnia tylną komorę oka i utrzymuje kształt gałki ocznej. Chociaż droga IVT jest mniej specyficznie ukierunkowana niż dostawa podsiatkówkowa, jest znacznie mniej inwazyjna i jest szeroko stosowana w warunkach klinicznych w przypadku wielu chorób oczu. 
Wcześniej wykazaliśmy skuteczność doszklistkowego dostarczania produktu terapii genowej za pośrednictwem wirusa adenowirusowego (AAV) (AAV9). CLN5) u owiec z naturalnie występującą postacią ceroidowej lipofuscynozy neuronalnej CLN5 (NCL). Owce dotknięte chorobą otrzymały terapię genową IVT w jednym oku, a drugie, nieleczone oko służyło jako kontrola wewnętrzna. Struktura i funkcja siatkówki utrzymywały się w leczonym oku do 15 miesięcy po leczeniu, podczas gdy nieleczone oko wykazywało postępującą pogarszającą się funkcję i ciężką atrofię podczas badania pośmiertnego. Na podstawie badań na owcach, produkt terapii genowej CLN5 został zatwierdzony jako kandydat na nowy lek eksperymentalny (IND) przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków we wrześniu 2021 r. W artykule szczegółowo opisano protokół chirurgiczny dostarczania terapeutycznego wektora wirusowego do oka owcy za pomocą IVT.

Skuteczność dostarczania wektora terapii genowej CLN5 drogą IVT w łagodzeniu dysfunkcji i degeneracji siatkówki u owiec z CLN5 NCL została wcześniej wykazana przez naszą grupę badawczą15. Owce objęte badaniem otrzymały pojedynczy wstrzyknięcie 100 µL CLN5 zapakowanego w wektor AAV serotypu 9 (AAV9) (AAV9.CLN5) drogą IVT do jednego oka, podczas gdy oko przeciwległe służyło jako nieleczona kontrola wewnętrzna. Wzrok oceniano co miesiąc od momentu wstrzyknięcia (3 miesiące) do końcowego stadium choro...

Wykonano iniekcje doszklistkowe w oku owcy w celu dostarczenia wirusowej terapii genowej do siatkówki.

Iniekcje doszklistkowe do oka owcy

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or ...

Iniekcje doszklistkowe mogą być stosowane do dostarczania środków terapeutycznych do siatkówki. Przedstawiono tutaj protokół iniekcji doszklistkowych do oka owcy, jako modelu oka ludzkiego. Iniekcje doszklistkowe są znacznie mniej inwazyjne niż inne iniekcje do oka.Iniekcje doszklistkowe mogą być z powodzeniem stosowane w celu dostarczenia produktu terapii genowej i leczenia zwyrodnienia siatkówki u owiec z naturalnie występującymi neuronalnymi lipofuscynozami ceroidowymi. Po znieczuleniu owcy rozpocznij aseptyczną dezynfekcję oka, które ma zostać wstrzyknięte, przepłukując je 1 do 5% roztworem jodu powidonu za pomocą 20-mililitrowej strzykawki. Następnie umieść sterylną, fenestrowaną zasłonę chirurgiczną na oku.Dopasuj wziernik do powiek, aby utrzymać oko otwarte. Chwyć kleszczami spojówkę opuszkową na grzbietowej bocznej stronie oka i obróć gałkę oczną brzuszno-przyśrodkowo. Włóż igłę około siedmiu milimetrów za twardówkę po bocznej stronie oka i pod kątem do tyłu, aby uniknąć soczewki.Podawać pojedyncze wstrzyknięcie 100 mikrolitrów w bolusie, jak najbliżej siatkówki, bez naruszania powierzchni siatkówki. Przepłukać oko około 10 do 15 mililitrami 1 do 5% roztworu jodu powidonu, a następnie 10 mililitrami soli fizjologicznej, przed usunięciem wziernika i serwetki. Analiza elektroretograficzna wykazała zachowaną funkcję siatkówki w leczonym oku, podczas gdy nieleczone oko pogorszyło się w podobny sposób jak u zwierząt dotkniętych CLN5.Histologia siatkówki była prawie znormalizowana w leczonym oku, a całkowita grubość siatkówki była porównywalna ze zdrowymi zwierzętami kontrolnymi w centralnej siatkówce. W przeciwieństwie do tego, grubość nieleczonej siatkówki była porównywalna ze zwierzętami dotkniętymi CLN5. Ekspresja kwaśnego białka fibrylarnego gleju lub GFAP, markera stresu siatkówkowego i astrogleju, była niższa w leczonych oczach niż w oczach nieleczonych, co wskazuje, że stan zapalny związany z chorobą został osłabiony po leczeniu.Dzięki ustanowieniu protokołu wstrzykiwań doszklistkowych do oka owcy, owce mogą być teraz wykorzystywane do testowania bezpieczeństwa i skuteczności wielu środków terapeutycznych podawanych doszklistkowo.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Iniekcja doszklistkowa jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad naukami o widzeniu w kontekście chorób oczu lub jako metoda bezpośredniego zastosowania miejscowego leczenia. W tym filmie zaprezentowano protokół iniekcji doszklistkowej z użyciem strzykawki o pojemności 1ml z szklaną pipetą. Przedstawiono praktyczne wskazówki dotyczące unikania masywnych krwawień oraz uszkodzeń soczewki.

Iniekcja doplastycznej w głąb ciała szklistego w celu ustanowienia modelu chorób oczu

Źródło: Park, S. W., et al. Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy nabłonek barwnikowy siatkówki. J. Vis. Exp. (2015)Film opisuje metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w modelu mysim. Szczegółowo opisano w nim procedurę, od znieczulenia i przygotowania oka po precyzyjne dostarczenie wektora lentiwirusowego, zapewniając integrację i ekspresję genów w RPE.

Podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu mysim

Króliki są powszechnie wykorzystywane do badania farmakokinetyki leków podawanych wewnątrzgałkowo. Opisano metodę prowadzenia badań farmakokinetycznych leków wewnątrzgałkowych z wykorzystaniem oczu królika.

Zastosowanie oczu królika w badaniach farmakokinetycznych leków dogałkowych

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Opisujemy tutaj metodę iniekcji doszklistkowej i późniejszej oceny ilościowej bakterii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Protokół ten można rozszerzyć o pomiar odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz ekspresji genów bakteryjnych i gospodarza.

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

W tym manuskrypcie, iniekcja podspojówkowa jest demonstrowana jako prawidłowa metoda dostarczania wektora do tkanek oka u myszy za pomocą systemu iniekcyjnego składającego się z pompy strzykawkowej do infuzji/pobrania i gazoszczelnej wyjmowanej strzykawki połączonej z igłami do mikroiniekcji. Ten system iniekcji można również dostosować do innych dróg podawania wewnątrzgałkowego.

Podspojówkowe podawanie wektorów wirusa związanych z adenowirusem w małych modelach zwierzęcych

Ten protokół opisuje technikę wstrzykiwania dokomorowego u szczurów za pomocą centralnego nacięcia rogówki i długiego tunelu do przedniej komory. Ta metoda iniekcji minimalizuje ryzyko wywołania niezamierzonego uszkodzenia tkanki, a tym samym poprawia precyzję i odtwarzalność.

Wstrzyknięcie dokomorowe u szczurów o niskim ryzyku wystąpienia działań niepożądanych

Ten protokół opisuje unikalną technikę wykorzystującą podejście przezspojówkowe do dostępu do nerwu wzrokowego szczura w celu wykonania zastrzyków.

Podejście przezspojówkowe do wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego szczura

To badanie przedstawia metodologię dostarczania leków do siatkówki i nerwów wzrokowych dorosłego szczura. Dodatkowo wprowadzono unikalną metodę pobierania tkanek w celu odgórnego pobrania en bloc nerwu wzrokowego i siatkówki u dorosłego szczura.

Terapeutyczne dostarczanie do oczu i zaawansowane pobieranie tkanek u dorosłych szczurów

Poznaj protokół iniekcji doszklistkowych do oka owcy jako modelu ludzkiego oka. Ta metoda dostarcza terapię genową do siatkówki w leczeniu zwyrodnienia siatkówki.

Iniekcje doszklistkowe do oka owcy

Przeglądaj więcej filmów