Name: Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę pomiaru obrotu białek w komórkach senesencyjnych przy użyciu etykietowania metabolicznego SILAC i spektrometrii mas. Technika ta umożliwia badanie homeostazy białkowej w kontekście starzenia i stresu komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) i Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). N.B. był wspierany przez Longevity Impetus Grants oraz Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com.

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

pSILAC to potężna technika, która umożliwia globalną kwantyfikację tempa obrotu białek w wielu warunkach komórkowych. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje zastosowanie pSILAC do porównywania globalnych okresów półtrwania białek między komórkami starszymi i spoczynkowymi, w tym instrukcje dotyczące przygotowania komórek starczych i spoczynkowych, znakowania i zbierania SILAC, a ostatecznie analizy przy użyciu spektrometrii mas DDA. Dodatkowo opisano dwuetapowy test do walidacji fenotypu starzenia przy użyciu analizy SA-βGal i RT-qPCR panelu mRNA kodujących białka związane ze starzeniem się. Oprócz walidacji starzenia się za pomocą dwóch opisanych podejść, trzecią walidację starzenia można przeprowadzić po analizie spektrometrii mas, szukając zmian w znanych markerach starzenia się między komórkami starczymi i spokojnymi na poziomie proteomicznym. Białka związane ze starzeniem się, które mają być podwyższone, obejmują między innymi p16, p21 i BCL2, opisane gdzie indziej44,45. W opisanym powyżej protokole promieniowanie jonizujące zostało wykorzystane do indukcji starzenia się i głodu surowicy dla komórek w stanie spoczynku. W przypadku indukcji starzenia dostępnych jest wiele opcji i istnieje między nimi znaczna niejednorodność 41,42,46. Obecnie nie ma metody starzenia, która byłaby uważana za "najbardziej fizjologiczną", więc wybór induktora starczego opiera się w dużej mierze na kontekście eksperymentu. Jednak eksperymenty mające na celu stwierdzenie ogólnego zjawiska starzenia się zaleca się stosowanie co najmniej dwóch różnych induktorów starzenia. Omówienie zakresu paradygmatów starzenia wykracza poza zakres tego artykułu, ale niektóre powszechne metody wywoływania starzenia się obejmują wyzwalanie uszkodzeń DNA (IR, doksorubicyna, wyczerpanie replikacyjne), ekspresję białek onkogennych (HRAS, BRAF) i zakłócanie funkcji mitochondriów2.
Oprócz wyboru induktora starzenia, równie ważną kwestią jest wybór komórek kontrolnych. Starzejące się komórki są z definicji pod wpływem nieokreślonego zatrzymania wzrostu, dlatego często wybiera się porównanie z innymi komórkami zatrzymanymi wzrostu. W przypadku pSILAC komórki zatrzymane w cyklu komórkowym są na ogół preferowane, ponieważ nie replikują się, a zatem są łatwiejsze do wykorzystania do obliczeń okresu półtrwania białka47. Ponieważ jednak hodowane komórki często zachowują niektóre dzielące się komórki, ważne jest, aby metody stosowane do wywoływania zatrzymania cyklu komórkowego dawały jak najbardziej jednorodną odpowiedź, aby zminimalizować błąd komórek, które wciąż się rozmnażają. Obliczenie szybkości degradacji białek dla komórek cyklicznych przy użyciu pSILAC wymaga dodatkowych obliczeń w celu skompensowania szybkości, z jaką białko jest rozcieńczane do komórek potomnych27. Jednak samo spoczynkowe zatrzymanie wzrostu nie jest pozbawione komplikacji. Istnieją dwie ogólne metody zatrzymania cyklu komórkowego: deprywacja surowicy i hamowanie kontaktu48. Nie wszystkie komórki można uspokoić poprzez hamowanie kontaktowe, chociaż wykazano, że niektóre fibroblasty wykazują stan spoczynku po kilku dniach hodowli49. W tej metodzie wykorzystano deprywację surowicy, ponieważ jest ona częściej stosowana do porównań komórek starczych, chociaż wymaga, aby komórka starcza była podobnie pozbawiona surowicy w celu uzyskania dokładnych porównań. Surowica aktywuje kompleks mTOR, a zatem deprywacja surowicy ma kilka dalszych skutków dla komórki, oprócz zatrzymania cyklu komórkowego50. W szczególności wykazano, że komórki starcze wykazują obniżony SASP po deprywacji surowicy lub zahamowaniu mTOR51,52.
Kolejną ważną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę w pSILAC, jest liczba punktów czasowych do przetestowania. Protokół ten zbierał komórki w jednym punkcie czasowym (3 dni lekkiego lub ciężkiego znakowania), co znacznie upraszcza wynikową analizę. Wybór punktu czasowego powinien być oparty na celu eksperymentu. W przypadku analizy globalnej oczekuje się, że 3 dni przechwycą większość białek, chociaż okresy półtrwania dla białek krótkożyciowych, które całkowicie obracają się w ciągu 3 dni (cały sygnał świetlny zostaje utracony) nie mogą być zmierzone w tym punkcie czasowym. I odwrotnie, długożyciowe białka z bardzo małym obrotem w ciągu 3 dni są również trudne do ilościowego określenia i często wydają się mieć bardzo długie okresy półtrwania (w ciągu tygodni), które zazwyczaj są tylko konsekwencją bardzo małej akumulacji ciężkiego sygnału. Ze względu na nieliniową zależność w stosunku ciężkich i lekkich sygnałów peptydowych w stosunku do procentu nowo zsyntetyzowanego białka w krótszych i dłuższych punktach czasowych, ilościowe określanie okresów półtrwania można poprawić, dodając dodatkowe punkty czasowe znakowania. W przypadku względnych porównań między dwoma stanami komórek, tak jak w tym protokole, przybliżony okres półtrwania może być wystarczający, ale można użyć dodatkowych punktów czasowych w celu poprawy dokładności ilościowej.
Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić nieukierunkowaną analizę obrotu białek opartą na DDA. Jednak obliczenia obrotu białkami można ogólnie zastosować do dowolnego schematu pozyskiwania, który jest w stanie wyprowadzić względną obfitość ciężkich i lekkich par peptydów. Na przykład metody oparte na MS2, takie jak akwizycja niezależna od danych (DIA/SWATH), mogą być również z powodzeniem stosowane do obliczania wskaźników obrotu53. Ponadto oprzyrządowanie i potoki oprogramowania inne niż opisane w tym protokole mogą być używane do przeprowadzania analizy DDA, identyfikacji białek i kwantyfikacji białek. W przypadku korzystania z platform oprogramowania do kwantyfikacji białek, takich jak Skyline, do wyodrębniania obszarów pików peptydowych, zaleca się ręczne sprawdzenie wyekstrahowanych chromatogramów jonowych w przestrzeni roboczej dokumentu, zidentyfikowanie pików, które zostały błędnie zintegrowane, oraz pików nieilościowych i odpowiednie dobranie dokumentu. Obszerna kolekcja samouczków jest dostępna online dla Skyline (skyline.ms).
pSILAC stanowi jedną z najbardziej idealnych metod globalnej kwantyfikacji okresów półtrwania białek w hodowanych komórkach ze względu na lepszą multipleksację (pokrycie proteomem) i przepustowość. Podczas gdy pSILAC nie zapewnia bezpośrednich szybkości syntezy lub degradacji, ponieważ zmiana sygnału lekkiego i ciężkiego jest spowodowana konfluencją czynników, pSILAC jest bardzo przydatny do porównań między warunkami i różnymi typami komórek. Metody niskoprzepustowe często dzielą się na dwa typy: 1) traktowanie komórek cykloheksymidem w celu zablokowania syntezy białek i zbioru w odstępach czasu po dodaniu w celu monitorowania rozpadu lub 2) traktowanie komórek inhibitorem rozpadu białka i zbieranie w odstępach czasu po dodaniu w celu monitorowania akumulacji białka, wnioskując w ten sposób o tempie rozpadu białka. Ograniczeniem obu metod jest to, że takie zabiegi nieuchronnie spowodują znaczne zmiany w fizjologii komórki. W przeciwieństwie do tego, pSILAC nie wymaga znaczącej interwencji i teoretycznie nie ma wykrywalnego wpływu na fizjologię komórki, ponieważ aminokwasy izotopowe różnią się tylko jednym neutronem od swoich nieizotopowych odpowiedników. Tak więc opisana tutaj metoda dla pSILAC stanowi prosty protokół globalnego pomiaru najbardziej fizjologicznych okresów półtrwania białek w komórkach niedzielących się.
Zmiany w obrocie białek mają ścisły związek ze starzeniem się, chorobami związanymi z wiekiem, neurodegeneracją i długowiecznością54,55. Protokół ten opisuje metodę badania tych zależności za pomocą znakowania stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowli komórkowej w celu pomiaru szybkości obrotu białek w komórkach starzejących się. Istnieje jednak wiele analogicznych metod przeprowadzania badań w kontekście starzenia się i neurodegeneracji in vivo na całych organizmach, takich jak myszy. Rzeczywiście, badania te podkreśliły znaczenie pomiaru wskaźników obrotu białkami w kontekście chorób związanych z wiekiem 56,57,58,59.
W tym badaniu białka rybosomalne i białka znajdujące się w retikulum endoplazmatycznym wyróżniały się jako dwie kategorie białek o odpowiednio skróconym i wydłużonym okresie półtrwania w komórkach starczych. Chociaż do wyciągnięcia ostatecznych wniosków wymagana jest dalsza analiza poziomów w stanie ustalonym, wyniki te sugerują, że komórki starcze mogą w unikalny sposób regulować translację poprzez skrócenie okresu półtrwania białek rybosomalnych. Idąc dalej, zastosowanie metod znakowania stabilnymi izotopami do badania związku między starzeniem się komórek a neurodegeneracją in vivo w modelach mysich będzie obiecującym rozszerzeniem podejścia do znakowania izotopów opisanego w tym protokole.

Starzenie się zostało po raz pierwszy zidentyfikowane jako stan nieokreślonego zatrzymania wzrostu, wykazywany przez hodowane komórki pierwotne po osiągnięciu wyczerpania replikacyjnego1. Od tego czasu wykazano, że starzenie się może wystąpić w odpowiedzi na liczne uszkodzenia komórkowe, w tym między innymi stresy genotoksyczne, mitochondrialne i onkogenne2. Podczas gdy starzenie się pełni kilka fizjologicznie ważnych ról, takich jak tłumienie guza i gojenie się ran, akumulacja komórek starczych podczas starzenia się wiąże się z wieloma szkodliwymi skutkami dla zdrowia3, w tym kilka schorzeń neurodegeneracyjnych4,5,6. Starzenie się komórek występuje w wielu typach komórek mózgowych, w tym w neuronach7,8,9,10, astrocytes11, microglia12 i prekursory oligodendrocytów13, i przyczynia się do neurodegeneracji i dysfunkcji poznawczych. Wykazano, że oligomery beta amyloidu, jedna z cech charakterystycznych choroby Alzheimera14, przyspieszają starzenie się neuronów13,15,16. Zwiększona częstość występowania komórek starczych jest również związana z chorobą Parkinsona17, zwłaszcza wynikającą ze stresorów środowiskowych11,18. Co ważne, selektywna eliminacja komórek starczych w modelach przedklinicznych wydłuża życie i łagodzi wiele chorób związanych z wiekiem3,5,12 i poprawia deficyty poznawcze8,11,12,13. Komórki starcze stały się zatem obiecującymi celami terapeutycznymi w leczeniu wielu schorzeń związanych z wiekiem.
Wiele szkodliwych skutków komórek starczych jest spowodowanych przez fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem się (SASP), złożoną mieszaninę bioaktywnych cząsteczek wydzielanych przez komórki starcze, które mogą powodować miejscowe zapalenie, angiogenezę, zniszczenie macierzy zewnątrzkomórkowej i rozprzestrzenianie się starzenia w otaczających tkankach19,20,21. SASP stanowi również interesujące biologiczne zjawisko starzenia się, ponieważ wymaga znacznego wysiłku transkrypcyjnego i translacyjnego podczas stanu zatrzymania cyklu komórkowego. W rzeczywistości wykazano, że komórki starcze wykazują zmniejszenie biogenezy rybosomów22,23,24, co powinno zmniejszyć syntezę białek. Zamiast tego starzejące się komórki silnie translują niektóre białka, w szczególności czynniki SASP, i wpływają na metabolizm otaczających tkanek25. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób starzejące się komórki poddawane trwałemu zatrzymaniu cyklu komórkowego nadal utrzymują homeostazę białek, a jednocześnie silnie eksprymują czynniki SASP i inne wybrane białka.
Ta metoda opisuje, jak używać spektrometrii mas i znakowania izotopów stabilnych impulsowo przez aminokwasy w hodowli komórkowej (pSILAC) do globalnego pomiaru okresów półtrwania białek w komórkach starczych w skali całego proteomu. W tradycyjnym SILAC hodowane komórki są całkowicie znakowane metabolicznie ciężkimi i lekkimi nieradioaktywnymi izotopami aminokwasów w celu dalszej analizy obfitości białek. Metoda ta została wcześniej zastosowana do kompleksowej i ilościowej oceny zmian liczebności w SASP hodowanych fibroblastów26. W pSILAC komórki są podobnie znakowane metabolicznie impulsem ciężkiego izotopu, który następuje po wstępnym znakowaniu lekkim izotopem, a następnie zbierane w jednym lub więcej odstępach czasu. Tempo włączania ciężkiego izotopu w odniesieniu do wcześniej istniejącego lekkiego izotopu jest następnie wykorzystywane do obliczenia względnych szybkości wymiany białek. Ogólnie rzecz biorąc, izotopy argininy i lizyny są używane, ponieważ trypsyna rozszczepia te pozostałości; W związku z tym wszystkie peptydy ze standardowego trawienia będą potencjalnie zawierać ciężką etykietę. Pary peptydów, które różnią się tylko obecnością lub brakiem ciężkiej lizyny lub argininy, są chemicznie identyczne i można je różnicować i oznaczać ilościowo za pomocą spektrometru mas. Po analizie spektrometrii mas peptydy można zidentyfikować jako nowo zsyntetyzowane lub istniejące wcześniej na podstawie obecności lub braku znacznika izotopowego w wynikowej identyfikacji peptydów. Tempo obrotu białkami można następnie określić, dopasowując stosunek ciężkich (13 C-15N) do lekkich (12 C-14N) peptydów dla danego białka do modeli kinetycznych dla wykładniczego wzrostu lub rozpadu27,28. pSILAC został wykorzystany w kilku porównaniach wskaźników obrotu białkami29,30,31,32 i jest obecnie najbardziej wszechstronną i wysokoprzepustową metodą pomiaru okresów półtrwania białek.
Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie komórek starczych równolegle z podobnie zatrzymanymi komórkami w stanie spoczynku w hodowli, a następnie znakowanie metaboliczne za pomocą pSILAC. Komórki są następnie zbierane, homogenizowane w lizaty i przetwarzane w celu akwizycji i analizy spektrometrii mas. Dane uzyskane ze spektrometrii mas są następnie wykorzystywane do określenia okresów półtrwania białka przy użyciu uproszczonej metody ilościowej wykorzystującej pojedynczy punkt czasowy i obliczenia okresu półtrwania wykonywane w arkuszu kalkulacyjnym. Korzystając z tego podejścia, szacunki okresów półtrwania białek można mierzyć w sposób kompleksowy i ilościowy, który jest bardziej autentyczny dla niezakłóconych warunków komórkowych niż protokoły wykorzystujące blokery syntezy lub obrotu białek.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl (klasa LC-MS)</td><td>Grainger</td><td>AH015</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Millipore-Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Zestaw</td><td></td> testowy BCA ThermoFisher 15240062 <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreotol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>12430112</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma</td><td>27001</td><td></td></tr><tr><td>Gammacel 40 Exactor</td><td>Najlepszy Theratronics</td><td></td><td>Namiennik cezowy do komórek</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td>Światłoczułe</td></tr><tr><td>pierwotne fibroblasty płuc IMR-90 ATCC</td><td></td><td>CCL-186</td><td></td></tr><tr><td>iRT Kit (indeksowany czas retencji)</td><td>Biognosys</td><td>Ki-3002-2</td><td>Indeksowane standardy peptydowe czasu retencji</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>ThermoFisher</td><td>423835000</td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>Matrix Science</td><td>Mascot Daemon 2.8</td><td>Proteomiczne oprogramowanie do przeszukiwania baz danych</td></tr><tr><td>Maxima Odwrotna transkrypcja (200 U/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nano LC System</td><td>ThermoFisher</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Ekstrakcja do fazy stałej Cartirdges</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Spektrometr masowy</td><td>ThermoFisher</td><td>Q Exactive HF Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>327110025</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce SILAC Zestaw do oznaczania ilościowego białek (trypsyna) -DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A33972</td><td></td></tr><tr><td>System do PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Losowy podkład</td> <td>heksamerowyThermoFisher</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia starzenia i beta-galaktozydazy</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td>, <td>Uniwersytet Waszyngtoński,</td><td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td><td>Darmowe i otwarte oprogramowanie proteomiczne typu qantiative. Dostępne w www.skyline.ms</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Sonicator</td><td>Branson</td><td>CPX-952-516R</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik trizolowy</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>Określany w tekście jako fenol; niebezpieczny</td></tr><tr><td>TRYPle Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (stopień sekwencjonowania)</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnaza (2U/ uL)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Woda (klasa LC-MS)</td><td>Grainger</td><td>AH365</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Coraz więcej dowodów wykazało, że nagromadzenie komórek starczych w ośrodkowym układzie nerwowym przyczynia się do zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroby Alzheimera i Parkinsona. Starzenie się komórek to stan trwałego zatrzymania cyklu komórkowego, który zwykle występuje w odpowiedzi na narażenie na stresy subletalne. Jednak, podobnie jak inne niedzielące się komórki, komórki starcze pozostają aktywne metabolicznie i wykonują wiele funkcji, które wymagają unikalnych wymagań transkrypcyjnych i translacyjnych oraz rozległych zmian w wewnątrzkomórkowych i wydzielanych proteomach. Zrozumienie, w jaki sposób tempo syntezy i rozpadu białek zmienia się podczas starzenia, może rzucić światło na mechanizmy leżące u podstaw starzenia się komórek i znaleźć potencjalne możliwości terapeutyczne w chorobach zaostrzanych przez komórki starcze. W artykule opisano metodę oceny okresów półtrwania białek w skali proteomu w komórkach niedzielących się przy użyciu pulsacyjnego znakowania stabilnych izotopów przez aminokwasy w hodowli komórkowej (pSILAC) w połączeniu ze spektrometrią mas. pSILAC polega na metabolicznym znakowaniu komórek stabilnymi ciężkimi wersjami aminokwasów zawierającymi ciężkie izotopy. W połączeniu z nowoczesnymi metodami spektrometrii mas, pSILAC umożliwia pomiar obrotu setek lub tysięcy białek w złożonych mieszaninach. Po znakowaniu metabolicznym można określić dynamikę obrotu białek na podstawie względnego wzbogacenia ciężkich izotopów w peptydy wykryte za pomocą spektrometrii mas. W tym protokole opisano przebieg pracy generowania starzejących się kultur fibroblastów i podobnie zatrzymanych fibroblastów w stanie spoczynku, a także uproszczony, jednopunktowy przebieg czasowy znakowania pSILAC, który maksymalizuje pokrycie przewidywanych szybkości obrotu białek. Ponadto przedstawiono proces analizy danych ze spektrometrii mas pSILAC i przyjaznego dla użytkownika obliczania szybkości degradacji białek za pomocą arkuszy kalkulacyjnych. Zastosowanie tego protokołu można rozszerzyć poza komórki starcze na wszelkie niedzielące się hodowane komórki, takie jak neurony.

Niniejszy protokół opisuje metodę globalnego porównywania okresów półtrwania białek w komórkach senescentnych oraz niedzielących się, spoczynkowych komórkach kontrolnych z wykorzystaniem techniki pSILAC i minimalnej liczby punktów czasowych. Protokół szczegółowo opisuje generowanie kultur komórek senescentnych i spoczynkowych, znakowanie metaboliczne komórek stabilnymi izotopami argininy i lizyny przez 3 dni, ilościowe oznaczanie względnej zawartości ciężkich i lekkich izotopów peptydów za pomocą spektrometrii mas oraz prosty i dostępny sposób obliczania okresów półtrwania białek przy użyciu formuł w arkuszu kalkulacyjnym (Rysunek 1). Metoda ta jest wysoce elastyczna i może zostać dostosowana do wielu typów komórek oraz różnych warunków.
W ramach generowania komórek senescencyjnych dla niniejszego protokołu zastosowano dwie metody walidacji starzenia: wizualizację komórek wykazujących aktywność SA-βGal za pomocą mikroskopii oraz analizę poziomu markerów senescencyjnych określonego za pomocą RT-qPCR. Pomiar markerów senescencyjnych powinien wykazać wyraźne różnice między komórkami w stanie spoczynku (quiescent) a komórkami senescencyjnymi, aby porównanie tych dwóch populacji komórek mogło zostać uznane za wiarygodne. W testie aktywności SA-βGal komórki senescencyjne powinny być niebieskie, podczas gdy kontrolne komórki w stanie spoczynku nie wykazują zabarwienia lub jest ono bardzo słabe (Rycina 2A). Analizę tę można przeprowadzić ilościowo, obliczając odsetek pozytywnych, zabarwionych na niebiesko komórek w stosunku do całkowitej liczby komórek, a następnie porównując procentowy wskaźnik pozytywnych wyników między kontrolnymi komórkami w stanie spoczynku a komórkami senescencyjnymi. Ważne jest, aby protokół ten był wykonywany w tym samym czasie dla porównania obu stanów komórkowych; aktywność SA-βGal zależy od pH roztworu barwiącego, w związku z czym wyniki mogą znacznie różnić się między poszczególnymi analizami i powinny być traktowane jako pomiar jakościowy.
Analiza RT-qPCR markerów starzenia wykaże wysokie poziomy mRNA kodujących czynniki SASP (IL6, CXCL8, IL1B) oraz inhibitory cyklu komórkowego (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) w większości modeli starzenia. Chociaż można spodziewać się pewnych różnic w zależności od typu komórek, warunków hodowli i induktora starzenia41,42, większość komórek starzejących się wykazuje poziomy mRNA IL6, CXCL8 oraz CDKN1A/p21 ponad pięciokrotnie wyższe w porównaniu z komórkami kontrolnymi w stanie spoczynku; przeciwnie, poziomy mRNA LMNB1 i PCNA, kodujących markery proliferacji, powinny być niskie lub nieobecne w komórkach starzejących się w porównaniu z komórkami w stanie spoczynku (Rycina 2B). Podsumowując, istotny odsetek pozytywnych wyników testu SA-βGal oraz oczekiwana ekspresja panelu markerów mRNA związanych ze starzeniem są wystarczające, aby potwierdzić indukcję starzenia w eksperymencie.
Przygotowanie próbek białek do analizy spektrometrią mas składa się z trawienia w roztworze (2 dni) oraz ekstrakcji w fazie stałej (4-6 h). W celu przeprowadzenia niecelowanej analizy proteomicznej, uzyskane peptydy poddaje się analizie LC-MS/MS z wykorzystaniem akwizycji zależnej od danych (DDA). W instrumentach Orbitrap metodę DDA można zdefiniować w edytorze metod oprogramowania instrumentu do spektrometrii mas. Ustawienia spektrometru masy zastosowane w tej badaniu przedstawiono na Rysunku 3A. Ustawienia chromatografii cieczowej mogą być również określane w edytorze metod. W niniejszym badaniu zastosowano 90-minutowy gradient liniowy z rosnącym udziałem fazy organicznej (acetonitrylu) (Rysunek 3B). Po pomyślnej akwizycji całkowity prąd jonowy (TIC) powinien wykazywać intensywny sygnał podczas etapu gradientu liniowego metody (Rysunek 3C). Niniejszy protokół opisuje przykładową procedurę na instrumencie Orbitrap, jednak obliczenia okresów półtrwania białek można przeprowadzić na danych uzyskanych z dowolnego spektrometru masy pracującego w trybie DDA, który jest dostępny w kilku typach instrumentów (np. Orbitraps i instrumenty czasu przelotu) oraz u różnych dostawców. Ustawienia akwizycji będą specyficzne dla typu i konfiguracji użytego instrumentu, dlatego zaleca się korzystanie z ustawień sugerowanych przez pracownię spektrometrii mas. Metoda ta jest również kompatybilna z metodami nie-DDA (SRM, PRM, DIA), pod warunkiem, że z surowych plików danych można wyodrębnić ilościowe pola powierzchni pików chromatograficznych dla pików ciężkich i lekkich i wprowadzić je do formuł w arkuszu kalkulacyjnym.
Surowe pliki ze spektrometrii mas zostają przeszukane przy użyciu jednego z wielu dostępnych narzędzi do przeszukiwania baz danych proteomicznych w celu identyfikacji peptydów i białek. W niniejszym badaniu wykorzystano na przykład wyszukiwarkę Mascot43. Aby uzyskać pola powierzchni pików chromatograficznych do ilościowego oznaczenia peptydów ciężkich i lekkich, wyniki wyszukiwania w bazie danych są importowane do oprogramowania proteomicznego umożliwiającego wyznaczenie pól powierzchni pików chromatograficznych, takiego jak Skyline39,40. Analiza ekstrahowanych chromatogramów jonowych peptydów (Rysunek 4) pozwoli określić względną proporcję sygnałów peptydów ciężkich i lekkich. Niższa proporcja sygnału peptydów ciężkich w stosunku do sygnału peptydów lekkich w komórkach senescentnych wskazuje na wolniejszą szybkość obrotu białek (Rysunek 4A), natomiast wyższy sygnał peptydów ciężkich w stosunku do lekkich wskazuje na szybszą szybkość obrotu białek (Rysunek 4B). Próbki nieznakowane powinny wykazywać niewielki lub brak sygnału peptydów ciężkich. Każdy widoczny sygnał peptydów ciężkich w próbkach nieznakowanych jest uznawany za szum tła i zostanie odjęty podczas końcowych obliczeń. Ilościowe oznaczenia pól powierzchni pików chromatograficznych dla peptydów lekkich i ciężkich dla wszystkich warunków traktowania i znakowania muszą zostać wyeksportowane do późniejszego obliczenia szybkości obrotu białek i analizy statystycznej.
Dzięki zastosowaniu analizy z pojedynczego punktu czasowego wyznaczanie okresów półtrwania białek jest proste i może być wygodnie przeprowadzane w arkuszach kalkulacyjnych. W Tabeli 3 obliczono okresy półtrwania dla 695 białek zidentyfikowanych w analizie spektrometrii mas. Na podstawie zawartości ciężkich i lekkich izotopów na poziomie białek dla każdego białka w próbkach (dane wejściowe dla arkusza 1) Raw Data), w arkuszu zatytułowanym 2) Ratio H | H + L automatycznie obliczany jest procent izotopu ciężkiego (określany jako stosunek, R). Na tym etapie wartość R z próbek znakowanych ciężko jest normalizowana poprzez odjęcie wartości R z próbek nieznakowanych, w celu uzyskania końcowego R dla powtórzeń w stanie spoczynku oraz w stanie starzenia. Ponieważ próbki nieznakowane nie powinny zawierać egzogennie dodanego izotopu ciężkiego, są one wykorzystywane do wyeliminowania sygnału tła. Na podstawie R, wartość kdeg (szybkość wymiany) jest obliczana zgodnie z następującym wzorem:
<img alt="Równowaga statyczna, równanie szybkości rozkładu \( k_{deg} = \frac{-\ln(1-R)}{t} \), przedstawienie wzoru." src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">
Okres półtrwania (H, w dniach) jest wyznaczany dla każdego białka w kontroli spoczynkowej oraz w trzech powtórzeniach dla komórek senescencyjnych (arkusz zatytułowany 3) Half-Life (days)) przy użyciu następującego wzoru:
<img alt="Wzór na okres połowicznego rozpadu, równanie H = ln(2)/k_deg, stosowane w badaniach kinetyki chemicznej." src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2">
Okresy półtrwania są następnie uśredniane dla trzech powtórzeń komórek w stanie spoczynku oraz komórek senescencyjnych, aby wyznaczyć średni okres półtrwania dla każdego białka w obu grupach, a także wartość p. Obliczone okresy półtrwania są następnie filtrowane pod kątem wartości ujemnych, co zdarza się, gdy sygnał ciężki z komórek znakowanych lekko (tło) jest większy niż sygnał ciężki z komórek znakowanych ciężko. W wyniku tego filtrowania, z 841 zidentyfikowanych białek, 707 białek z poprawnymi okresami półtrwania zostało uwzględnionych w zaprezentowanych tutaj wynikach.
Okres półtrwania raportuje się następnie jako stosunek log2 komórek starzejących się do komórek kontrolnych w stanie spoczynku (log2FC) i przedstawia na wykresie wulkanicznym (Rycina 5). Na przykład, analizując 5) Arkusz analizy (Analysis sheet), można zauważyć, że białko receptora trombiny układu krzepnięcia II (F2R) ma okres półtrwania w komórkach w stanie spoczynku wynoszący 0,51 dnia (kolumna B) oraz okres półtrwania w komórkach starzejących się wynoszący 1,07 dnia (kolumna C), co daje log2FC na poziomie ~1,06 (kolumna D) przy wartości p wynoszącej 0,001.
<img alt="Schemat generowania komórek senescentnych, znakowania SILAC, walidacji RT-qPCR, spektrometrii mas oraz obliczania okresu półtrwania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procedury pSILAC dla komórek senescentnych i komórek kontrolnych w stanie spoczynku. Ludzkie fibroblasty IMR-90 zostały wykorzystane do przygotowania kultur komórkowych w stanie spoczynku (niska zawartość surowicy) lub senescentnych (IR) w celu porównania okresów półtrwania białek. Następnie komórki znakowano przez 3 dni w pożywkach SILAC Light lub SILAC Heavy z izotopową argininą i lizyną. Z komórek wyekstrahowano lizaty, które następnie poddano trawieniu, odsoleniu i analizie za pomocą spektrometrii mas. Piki izotopowe peptydów ciężkich i lekkich odpowiadają odpowiednio peptydom nowo zsyntetyzowanym oraz istniejącym wcześniej. Okresy półtrwania obliczono przy użyciu równania dla rozpadu wykładniczego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia starzenia się komórek i wykres słupkowy ekspresji mRNA, przedstawiający starzenie w porównaniu do stanu spoczynku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Walidacja fenotypów starzenia za pomocą analiz SA-βGal i RT-qPCR. (A) Komórki starzejące się i spoczywające zostają przesiane w momencie zbioru do płytki 6-dołkowej i poddane barwieniu na SA-βGal przy użyciu zestawu do barwienia SA-βGal. Niebieski kolor w obrębie ciała komórki wskazuje na starzenie. Obrazy wykonano w jasnym polu w kolorze przy powiększeniu 10x, marker rozmiaru zaznaczono na czerwono. (B) Analiza RT-qPCR porównująca komórki starzejące się (czerwone) i komórki w cyklu (szare) z niezależnego eksperymentu. Wzrost poziomów mRNA CDKN1A/p21, CXCL8 oraz IL6 świadczy o starzeniu, podobnie jak spadek poziomu mRNA LMNB1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ eksperymentu spektrometrii mas z pełną metodą MS/dd-MS²; obejmuje gradient czasu i dane spektralne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne metody skanowania dla akwizycji zależnej od danych (DDA) i gradient chromatografii cieczowej dla kultur pSILAC na spektrometrze mas Q-Exactive HF orbitrap. (A) Zalecane ustawienia przyrządu w oprogramowaniu dla analizy zależnej od danych lizatów całokomórkowych z eksperymentu pSILAC. (B) Przykład ustawień metody gradientu przepływu w chromatografii cieczowej. Peptydy są eluowane w ciągu 90-minutowego gradientu liniowego od 5% do 35% buforu B (0,2% kwasu mrówkowego i 99,8% acetonitrylu), a następnie następuje 10-minutowe płukanie 80% buforem B oraz 25-minutowa równoważenie 5% buforem B. (C) Reprezentatywny całkowity chromatogram jonowy (TIC) z akwizycji spektrometrii mas peptydów fibroblastów IMR-90 uzyskany przy określonych ustawieniach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza spektrometrią mas; kwantyfikacja peptydów; wykresy słupkowe, porównanie białek, widma jonowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne chromatogramy wyekstrahowanych jonów peptydów o zmienionym obrocie podczas starzenia. (A) Powierzchnie pików chromatograficznych peptydu FQMTQEVVCDECPNVK++ z białka DnaJ homolog subfamily B member 11 (DNAJB11) w komórkach starzejących się i niestarzejących się. Po 3 dniach SILAC komórki starzejące się wbudowują mniej ciężkiego izotopu w ten peptyd w porównaniu z komórkami spoczynkowymi (niestarzejącymi się), co objawia się zmniejszeniem powierzchni piku peptydu zawierającego ciężki izotop (kolor niebieski) w stosunku do peptydu lekkiego (kolor czerwony), co wskazuje na zmniejszony obrót tego peptydu w komórkach starzejących się. (B) Powierzchnie pików chromatograficznych peptydu VQAQVIQETIVPK++ z białka Splicing Factor 3a Subunit 1 (SF3A1) w komórkach starzejących się i niestarzejących się. Po 3 dniach SILAC komórki starzejące się wbudowują większą proporcję ciężkiego izotopu w ten peptyd w porównaniu z komórkami spoczynkowymi (niestarzejącymi się), co objawia się zwiększeniem powierzchni piku peptydu zawierającego ciężki izotop (kolor niebieski) w stosunku do peptydu lekkiego (kolor czerwony), co wskazuje na zwiększony obrót tego peptydu w komórkach starzejących się. Warunki nieoznakowane (Dzień 0) nie wykazują wbudowania ciężkiego izotopu dla obu peptydów, zgodnie z oczekiwaniami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza czasu półtrwania białek; wykres rozrzutu, tabela danych; przedstawiające zmiany log2 i wartości p." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Porównanie czasów półtrwania białek w komórkach senescentnych i spoczywających wyznaczonych na podstawie znakowania pSILAC. (A) Wykres wulkaniczny przedstawiający stosunek log2 komórek senescentnych / kontrolnych (spoczywających) dla każdego z 695 zidentyfikowanych białek; w tym doświadczeniu pożywki do znakowania lekkiego (Light) i ciężkiego (Heavy) nie zawierały glukozy ani czerwieni fenolowej. (B) Tabele przedstawiające 10 białek z największym wzrostem lub spadkiem czasu półtrwania w komórkach spoczywających w porównaniu z komórkami senescentnymi (odpowiednio po lewej i prawej stronie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Pożywki i bufory użyte w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Startery RT-qPCR użyte w niniejszym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Arkusz analizy SILAC do obliczania okresów półtrwania białek, krotności zmian i testów t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

To, w jaki sposób komórki utrzymują homeostazę białek, nie jest dobrze poznane w kontekście stresu komórkowego i starzenia się. W tym protokole zapewniamy prosty i dokładny sposób obliczania obrotu białek, które są kluczowym elementem homeostazy białek w żywych komórkach. Pulse SILAC daje eksperymentatorowi możliwość pomiaru obrotu białek dla poszczególnych białek i całego proteomu w sposób wysokoprzepustowy, który jest również bardziej autentyczny dla systemów biologicznych niż inne metody.Zasady tej metody można zastosować do każdego systemu, który można znakować metabolicznie, w tym do całych organizmów. Ta metoda może również prowadzić do wglądu w starzenie się komórek, starzenie się i choroby neurodegeneracyjne. Analiza spektrometrii mas jest bardzo wrażliwa na niektóre zanieczyszczenia chemiczne, takie jak detergenty.Podczas tej procedury należy używać odczynników klasy LC-MS, aby zapewnić gromadzenie danych wysokiej jakości. Aby rozpocząć znakowanie metaboliczne komórek, zastąp pożywkę dla trzech płytek z komórek starzejących się i spoczynkowych 30 mililitrami pożywki SILAC Light. Oddzielnie wymień pożywkę na trzy płytki starzejące się i trzy płytki spoczynkowe na 30 mililitrów SILAC Heavy.Hoduj komórki przez trzy dni bez zmiany podłoża. Aby oderwać komórki od płytek hodowlanych, dodaj pięć mililitrów wstępnie podgrzanego odczynnika trypsyny do każdej płytki i inkubuj płytki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Później ponownie zawieś odłączone komórki w pięciu mililitrach tego samego podłoża, które są używane do hodowli, do całkowitej objętości 10 mililitrów.Następnie przenieś komórki do lodu i odwiruj komórki w temperaturze 300 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Po dwukrotnym umyciu osadu, ponownie odwirować komórki i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 150 mikrolitrach świeżo przygotowanego ośmiomolowego buforu do lizy mocznika i 50-milimolowego wodorowęglanu amonu. Wymieszać zawartość probówki, pipetując w górę i w dół.Porcję 50 mikrogramów próbki białka umieszcza się w nowej probówce i doprowadza próbki do równej objętości za pomocą buforu do lizy. Następnie dodać ditiotreitol do końcowego stężenia 20 milimoli do probówki i inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut z wytrząsaniem. Pozostawić próbkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie dodać jodoacetamid do końcowego stężenia 40 milimoli i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.Następnie rozcieńczyć próbkę do poziomu poniżej jednego molowego mocznika za pomocą 50-milimolowego buforu wodorowęglanu amonu. Dodać jeden mikrogram trypsyny na 50 mikrogramów białka wyjściowego lub w stosunku 1:50 trypsyna do białka do próbki. Inkubuj próbkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając w celu strawienia białek do peptydów.Następnego dnia dodaj kwas mrówkowy do 1% objętości próbki, aby wygasić trawienie białka. W celu oczyszczenia próbki należy umieścić wkład ekstrakcyjny do fazy stałej na kolektorze próżniowym, używając jednego wkładu ekstrakcyjnego na każdą próbkę, zgodnie z wytycznymi producenta. Po ekstrakcji należy wyjąć próbki peptydów z kolektora próżniowego i całkowicie wysuszyć je w koncentratorze próżniowym.Suszenie trwa około trzech godzin. W przypadku spektrometrii mas lub analizy MS ponownie zawiesić próbkę peptydu w stężeniu 400 nanogramów na mikrolitr w 0,2% buforze kwasu mrówkowego. Aby rozpuścić peptydy, mieszaj próbkę przez pięć minut.Następnie sonikuj przez pięć minut w sonikatorze w łaźni wodnej. Następnie odwirować próbkę w celu osadzenia nierozpuszczalnych materiałów i przenieść supernatanty peptydowe do fiolek ze stwardnieniem rozsianym. Prześlij próbki do analizy proteomicznej przy użyciu tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej lub LC-MS-MS.Należy użyć ustawień zalecanych do analizy nieukierunkowanej przez urządzenie do spektrometrii mas. Załaduj próbki do kolumny analitycznej o natężeniu przepływu 400 nanolitrów na minutę, aby wymyć peptydy w ciągu 90-minutowego gradientu liniowego przy użyciu mieszaniny rozpuszczalników organicznych i nieorganicznych, z rozpuszczalnikiem organicznym w zakresie od 5 do 35%Uzyskaj dane spektrometrii mas w trybie zależnym od danych, z ciągłym cyklem skanów pomiarowych MS1, a następnie 20 zależnych od danych skanów MS2 z fragmentacją HCD. Określ ilościowo obszary pików peptydów dla ciężkich i lekkich peptydów w narzędziu programowym Proteome Quantitation.Następnie wyeksportuj obszary pików ciężkiego i lekkiego peptydu. W celu obliczenia okresów półtrwania białka otwórz skoroszyt analizy SILAC do pierwszego arkusza o nazwie Raw Data i wklej identyfikatory UniProt , nazwy genów, obszary ciężkich i lekkich pików do wskazanych kolumn. Następnie otwórz czwarty arkusz o nazwie Analiza i usuń wiersze, w których kolumny G i H wskazują, że próbka jest poza zakresem, i zachowaj wiersze, które mieszczą się w tym zakresie.Fenotypy starcze zwalidowano za pomocą związanej ze starzeniem się aktywności beta-galaktozydazy i analizy RT-qPCR. Jeśli chodzi o aktywność beta-galaktozydazy, komórki starcze wydawały się niebieskie, podczas gdy komórki kontrolne w stanie spoczynku nie miały koloru lub miały go minimalnie. W analizie RT-qPCR komórki starcze wykazywały wyższe mRNA interleukiny-6, CXCL8 i CDKN1A-P21 w porównaniu z komórkami w stanie spoczynku.I odwrotnie, poziom kodowania laminy B1 dla markera proliferacji był niski lub nie był go wcale w komórkach starczych. Wyekstrahowane chromatogramy jonowe peptydów ujawniły względną proporcję sygnałów ciężkich i lekkich peptydów. Niższy odsetek sygnałów ciężkich peptydów w stosunku do lekkich komórek starzejących się wskazywał na wolniejsze tempo obrotu białek, a wyższy sygnał ciężkiego peptydu w stosunku do światła wskazywał na szybsze tempo obrotu białek.Nieznakowane próbki wykazywały niewielki lub żaden sygnał ciężkiego peptydu. Obliczono okresy półtrwania dla 695 białek zidentyfikowanych na podstawie analizy spektrometrii mas. Okres półtrwania jest podawany jako logarytmiczny stosunek dwóch komórek starzejących się do spoczynkowych i wykreślany na wykresie wulkanu.Po obliczeniu szybkości wymiany białek w starzejących się komórkach, dalsza analiza może ujawnić potencjalne szlaki biologiczne, które są regulowane przez mechanizmy proteostazy. Pulse SILAC utorował naukowcom drogę do badania dynamiki białek z niespotykaną dotąd szczegółowością i przepustowością, umożliwiając nam badanie zmian w homeostazie białek w wielu pojedynczych białkach.

measurement-protein-turnover-rates-senescent-non-dividing-cultured

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film ilustruje test oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek raka starczego wywołanego terapią za pomocą podwójnych markerów starzenia. Wykrywanie i kwantyfikacja komórek starczych wymaga użycia substratu β-galaktozydazy. Substrat jest rozszczepiany przez aktywną lizosomalną β-galaktozydazę w komórkach starczych, wytwarzając produkt fluorescencyjny, który w połączeniu z granulkami autofluorescencyjnej lipofuscyny oznacza starcze komórki rakowe.

Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej

Czy starzenie się zapobiega lub sprzyja nowotworzenia, pozostaje kwestią sporną. Ponieważ leki chemoterapeutyczne mogą indukować starzenie się komórek rakowych, badanie starzenia się jest niezbędne do zaproponowania nowych terapii. Jednak standardowy i szeroko stosowany test β-galaktozydazy ma poważne wady. Proponujemy tutaj szybki i czuły test oparty na cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia starzenia.

Właściwa metoda ilościowego oznaczania starzejących się komórek rakowych

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Starzenie się komórek, nieodwracalny stan zatrzymania cyklu komórkowego, może być wywołane przez różne stresy komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokoły indukowania starzenia się komórek oraz metody oceny markerów starzenia.

Techniki indukcji i ilościowego oznaczania starzenia się komórek

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Opisujemy nasz protokół pomiaru rytmów biologicznych w katabolizmie białek poprzez autofagię i proteasom w wątrobie myszy.

Pomiar rytmów dobowych w strumieniu autofagicznym i proteasomalnym

Prezentowany tutaj jest protokół monitorowania degradacji białka huntingtyny połączonego z fotokonwertowalnym fluoroforem Dendra2.

Kwantyfikacja in vivo obrotu białek w starzejących się C. elegans przy użyciu fotokonwertowalnego Dendra2

Ten artykuł przedstawia protokół LysoTracker dla żywych komórek w celu zmierzenia remodelacji lizosomalnej podczas starzenia się w  fibroblastach ludzkich IMR-90.

Analiza lizosomalna z użyciem LysoTracker do ilościowej oceny starzenia komórkowego w fibroblastach ludzkich

Poznaj metodę pomiaru obrotu białek w komórkach senesencyjnych przy użyciu etykietowania metabolicznego SILAC i spektrometrii mas. Technika ta umożliwia badanie homeostazy białkowej w kontekście starzenia i stresu komórkowego.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów