Name: Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj metodę izolacji wirusów z komarów Aedes albopictus przy użyciu linii komórkowych C6/36 i BHK-21. Protokół umożliwia bezpieczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez komary bez konieczności eksperymentów na zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt Planu Nauki i Technologii z Wuhan (2018201261638501).

1. Pobieranie próbek i sortowanie komarów
<ol>
	<li>Złap dorosłe komary przez pułapki świetlne MXA-02 lub pułapki na komary na dwutlenek węgla w terenie.</li>
	<li>Zabij zebrane komary, zanurzając je w ciekłym azocie10,11. Przetransportuj je do laboratorium za pomocą systemu logistycznego łańcucha chłodniczego12. 
	UWAGA: Suchy lód był używany przede wszystkim w systemie logistycznym łańcucha chłodniczego.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Jeśli miejsca pobierania próbek znajdowały się w pobliżu laboratorium, wyślij bezpośrednio żywe komary w pułapkach sieciowych do laboratorium i poddaj je eutanazji poprzez zamrożenie w temperaturze ≤-20 °C przez 30 min4.</li>
	<li>Dokonaj identyfikacji morfologicznej zebranych komarów za pomocą podręcznika13 do klasyfikacji i identyfikacji komarów. 
	UWAGA: W razie potrzeby do klasyfikacji i identyfikacji komarów można użyć kodów kreskowych DNA14,15. </li>
	<li>Na podstawie dat i miejsc pobierania próbek przypisz je do różnych pul, a następnie przechowuj je w probówkach o pojemności 2-5 ml.</li>
	<li>Narysuj tabelę, w której zapisz każdą probówkę z gatunkami komarów, liczbą, kodem pobierania próbek, datą i miejscami.</li>
	<li>Wydrukuj etykiety z kodami pobierania próbek i przymocuj je do probówek.</li>
	<li>Probówki z próbkami komarów należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.</li>
</ol>
2. Zgrzytanie komarów
<ol>
	<li>Umieść 20-50 komarów w każdej sterylnej probówce o pojemności 2 ml z kulkami ceramicznymi o średnicy 3 mm z 1,5 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) zawierającej 2% roztworu penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B. 
	UWAGA: Trzymaj rurki na lodzie lub na ładnej tacy.</li>
	<li>Homogenizuj komary za pomocą niskotemperaturowego homogenizatora tkankowego, mieląc przez 30 s przy 70 Hz w 4 °C przez trzy cykle16.</li>
	<li>Odwirować mieszaniny w temperaturze 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatanty do nowych probówek.</li>
	<li>Ponownie odwirować supernatanty w temperaturze 15 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki komarów12,17. 
	UWAGA: W razie potrzeby supernatanty można przefiltrować za pomocą filtrów 0,22 μm.</li>
	<li>Porcjować supernatanty (P0) do probówek z zakrętką o pojemności 2 ml (200 μl na probówkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek i pożywka do konserwacji hodowli komórkowych
UWAGA: Linia komórkowa komara C6/36 (Aedes albopictus z niedoborem RNAi) i linia komórkowa kręgowców BHK-21 (nerka chomika) zostały użyte do amplifikacji i izolacji wirusa.
<ol>
	<li>Zaszczepić 1 × 106 komórek C6/36 w kolbie o średnicy 75cm2 z 10 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (P/S) w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 . </li>
	<li>Zaszczepić 1 × 106 komórek BHK-21 w kolbie o średnicy 75cm2 z 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% FBS i 1% P/S w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5%CO2. 
	UWAGA: Komórki były przepuszczane dwa lub trzy razy w tygodniu17,18.</li>
	<li>Wysiewać komórki hodowane w kolbie o średnicy 75cm2 (komórki C6/36 lub BHK-21) na płytki 24-dołkowe (C6/36 na basenik: 1,4 × 105; BHK-21 na studzienkę: 0,8 × 105).</li>
	<li>Umieścić 24-dołkowe płytki w temperaturze 28 °C lub 37 °C na noc.</li>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem i potwierdź, czy zbieganie komórek w każdym dołku wynosi 80%-90%.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do konserwacji hodowli komórkowych (500 ml). 
	UWAGA: W przypadku C6/36 pożywką była pożywka RPMI uzupełniona 2% FBS i 2% roztworem penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B. W przypadku BHK-21 pożywką była pożywka DMEM uzupełniona 2% FBS i 2% roztworem penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B.</li>
</ol>
4. Izolacja wirusa
UWAGA: Wszystkie kroki zostały przeprowadzone w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Wymagania dotyczące poziomu bezpieczeństwa laboratorium bezpieczeństwa biologicznego zostały określone na podstawie oceny ryzyka bezpieczeństwa biologicznego w oparciu o przepisy różnych krajów i regionów. Proces musi być przeprowadzony w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z 24-dołkowych płytek i dodać 100 μl pożywki do utrzymania hodowli komórkowej i 100 μl supernatantu homogenatu komarów (P0) do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 28 °C lub 37 °C przez 60 minut i delikatnie wstrząsać nimi co 15 minut, aby zapobiec wysuszeniu komórek.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie przepłukać każdą studzienkę 600 μl pożywki do konserwacji kultur komórkowych, aby całkowicie usunąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Dodać 800 μl pożywki do utrzymania hodowli komórkowych do każdej studzienki i przechowywać płytki w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 28 °C lub 37 °C przez 7 dni.</li>
	<li>Monitoruj stan komórek każdej studzienki pod mikroskopem daily15.</li>
	<li>Zebrać supernatanty komórek (supernatanty P1) 7dnia i przechowywać supernatanty w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.6 2x, aby uzyskać supernatanty P2 i P3. 
	UWAGA: W kroku 4.3 delikatne płukanie każdej studzienki 600 μl pożywki do konserwacji hodowli komórkowych było opcjonalne dla P2 i P3.</li>
	<li>W zależności od tego, która studzienka wykazuje efekt cytopatogenny (CPE) - komórki umierają, piknoza i odrywają się od powierzchni; fuzja z sąsiednimi komórkami w celu utworzenia syncytii; lub pojawienie się jądrowych lub cytoplazmatycznych ciał inkluzyjnych - dodaj 300-400 μl supernatantu tego CPE do każdej studzienki nowych 6-dołkowych płytek zawierających komórki (zbieganie komórek wynosiło 80%-90%), aby znacznie wzmocnić wirusy.</li>
	<li>Zebrać supernatanty i rozdzielić je na probówki do przechowywania z zakrętką o pojemności 2 ml (500 μl na probówkę). Przechowywać je w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Po trzech pokoleniach kolejnych pasażów w komórkach, próbki, które nie indukowały CPE, zostały odrzucone. W razie potrzeby można zwiększyć generacje kolejnych pasaży w komórkach.</li>
</ol>
5. Wykrywanie sekwencji wirusowych za pomocą RT-PCR
<ol>
	<li>Ekstrakcja całkowitego RNA z 200 μl supernatantu wirusa za pomocą mini zestawu wirusowego RNA16. 
	UWAGA: W tym przypadku zastosowano zautomatyzowany system ekstrakcji kwasów nukleinowych do ekstrakcji całkowitego RNA zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia.</li>
	<li>Przekształć RNA w cDNA zgodnie z instrukcjami zestawu RT-PCR za pomocą przyrządu do PCR.
	<ol>
		<li>Dodać 15 μl RNA zmieszanego z 1 μl losowych starterów do probówki PCR. Umieścić probówkę w temperaturze 70 °C na 5 minut, a następnie umieścić ją na lodzie na 5 minut.</li>
		<li>Dodać 5 μl 5x buforu i 25 μl mieszaniny (10 mM dNTP, 40 U/μL inhibitora RNazy i 200 U/μL M-MLV) do probówki i umieścić probówkę w temperaturze 42 °C na 60 min i 95 °C na 10 min.</li>
		<li>Przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj zestawu do PCR i uniwersalnych starterów (Tabela 1), aby wykryć wirusy metodą PCR.
	<ol>
		<li>W przypadku arbowirusów należy skonfigurować system reakcji PCR (łącznie 30 μL) z następującymi składnikami: 3 μL 10x buforu Taq, 3 μL dNTP (1mM), 1 μL startera przedniego (10 μm), 1 μL startera odwrotnego (10 μm), 0,3 μL Taq (10 U/μL), 19,7 μl ddH, 2O i 2 μl cDNA.</li>
		<li>W celu wykrycia flawiwirusów należy ustawić proces reakcji jako: etap 1: 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; etap 2: 72 °C przez 10 minut.</li>
		<li>W celu wykrycia alfawirusów należy skonfigurować proces reakcji jako: etap 1: 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 50 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; etap 2: 72 °C przez 10 minut.</li>
		<li>W celu wykrycia bunyawirusów należy skonfigurować proces reakcji jako: etap 1: 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 50 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; etap 2: 72 °C przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykryj produkty amplifikacji PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym i wyślij je do analizy sekwencjonowania. 
	UWAGA: Jeśli warunki na to pozwolą, supernatanty mogą zostać poddane analizie sekwencjonowania nowej generacji w celu identyfikacji nowych wirusów i uzyskania sekwencji całego genomu wirusa.</li>
</ol>

<ol><li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-associated+viruses+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342(2020).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+%282007-2017%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079(2019).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li>
<li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265(2021).</li>
<li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873(2019).</li>
<li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses%3A+evolution%2C+infection%2C+and+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li>
<li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li>
<li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30(2018).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+%28BAV%29+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555(2018).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640(2020).</li>
<li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhou%2C+M+%22Handbook+for+Classification+and+Identification+of+Main+Vectors%22">Handbook for Classification and Identification of Main Vectors</a>. , Suzhou University Press. (2019).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bold%3A+The+Barcode+of+Life+Data+System+%28www.barcodinglife.org%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Notes%22%5BJournal%5D)">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298(2022).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963(1963).</li>
<li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan%2C+PR+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Celem tej metody było zaoferowanie praktycznego sposobu izolowania wirusów związanych z komarami przy użyciu różnych linii komórkowych. Bardzo ważne jest, aby dodać antybiotyk-antybiotyk (penicylina-streptomycyna-amfoterycyna) do supernatantów homogenatów komarów, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami lub grzybami. Komary i supernatanty wirusowe uzyskane w terenie muszą być przechowywane w lodówce w temperaturze -80 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
Kolejnym ...

Komary to grupa ważnych patogennych wektorów stawonogów. W rodzinie Culicidae występuje około 3 500 gatunków komarów1,2. Rozwój technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości doprowadził do odkrycia wielu nowych, wirusopodobnych sekwencji u komarów z różnych części świata3. Ogólnie rzecz biorąc, te wirusy związane z komarami można podzielić na dwie główne grupy: MBV i MSV.
MBV to grupa różnorodnych wirusów, które są czynnikami wywołującymi wiele chorób ludzkich lub zwierzęcych, takich jak wirus żółtej febry (YFV), wirus dengi (DENV), wirus japońskiego zapalenia mózgu (JEV), wirus Zachodniego Nilu (WNV) i wirus gorączki doliny Rift (RVFV)4. Poważnie zagrażają zdrowiu publicznemu, powodując poważną zachorowalność i śmiertelność zarówno ludzi, jak i zwierząt na całym świecie. MBV w naturalny sposób podtrzymują cykl życiowy między różnymi gospodarzami poprzez przenoszenie z zakażonego komara na żywiciela naiwnego, a także z żywiciela zainfekowanego wirusem i na żerującego komara5. W związku z tym wirusy te mogą infekować zarówno linie komórkowe komarów, jak i linie komórkowe kręgowców w lab1.
MSV, które obejmują wirusa Yichang (YCN), Culex flavivirus (CxFV) i wirusa Chaoyang (CHAOV), są podgrupą wirusów specyficznych dla owadów1,6,7. W ostatnich latach nastąpił wzrost liczby odkrywanych nowych MSV, a niektóre z tych MSV mają wpływ na przenoszenie MBV. Na przykład CxFV, który może być uporczywą infekcją Culex pipiens, może hamować replikację WNV na wczesnym etapie8. Stwierdzono, że inny specyficzny dla owadów flawiwirus, wirus czynnika łączącego komórki (CFAV), hamuje rozprzestrzenianie się wirusa DENV i Zika (ZIKV) u komarów Aedes aegypti9. W związku z tym protokół ten jest użytecznym podejściem do izolowania wirusów związanych z komarami i może pomóc w dalszych badaniach nad dystrybucją patogenów związanych z komarami i zwalczaniem chorób przenoszonych przez komary.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr membranowy</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Folie polimerowe o określonych wskaźnikach porów. Do usuwania resztek komórkowych i bakterii.</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>CORNING</td><td>3524</td><td>Pojemniki na komórkę</td></tr><tr><td>Kolby 75 cm2</td><td>CORNING</td><td>430641</td><td>Pojemniki na</td></tr><tr><td>komórkę sterylna probówka 2 ml z kulkami</td><td></td><td></td><td></td>ceramicznymi 3 mm</tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Antybiotyk w pożywce zapobiegający zanieczyszczeniu bakteriami i grzybami</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany kwas nukleinowy system ekstrakcji</td><td>NanoMagBio</td><td>S-48</td><td></td></tr><tr><td>BHK-21 komórki</td><td>Narodowe Centrum Zasobów Wirusowych, Instytut Wirusologii</td><td></td><td></td>w Wuhan</tr><tr><td>Komórki C6 / 36</td><td>Narodowe Centrum Zasobów Wirusów, Instytut Wirusologii</td><td></td><td></td>w Wuhan</tr><tr><td>Maszyna odśrodkowa</td><td>Himac</td><td>CF16RN</td><td>Przyrząd do wirowania próbek komarów</td></tr><tr><td>CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s minimalna pożywka niezbędna (DMEM)</td><td>Pożywka Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>dla linii komórkowych kręgowców</td></tr><tr><td>Izolacja wirusa</td><td></td><td></td> jeziora Ebinur <td>Cu20-XJ</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca fety (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td> Zapewnij odżywianie komórek</td></tr><tr>Serwis<td>wysokoobrotowego niskotemperaturowego homogenizatora tkankowegobio</td><td></td><td>KZ-III-F</td><td>Przyrząd do mielenia</td></tr><tr><td>inkubator (28 & C)</td> <td>Instrument</td><td>Panasonic MCO-18AC</td><td>do</td></tr><tr><td>inkubatora kultur komórkowych (37 & deg; C)</td> <td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td>Przyrząd do hodowli komórek</td></tr><tr><td>w probówce</td><td></td><td></td><td></td>PCR</tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15410-122</td><td>Antybiotyk w pożywce zapobiegającej zanieczyszczeniu bakteriami</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka (-80 &deg; C)</td><td>sanyo</td><td>MDF-U54V</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute&nbsp; medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>podłoże do linii komórkowych mosiquto</td></tr><tr><td>Probówki do przechowywania z nakrętką (2 ml)</td><td>biofil</td><td>&nbsp; </td><td></td>FCT010005</tr><tr><td>sterylne tłuczki</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y004</td><td>Materiały eksploatacyjne&nbsp; do mielenia</td></tr><tr><td>TGrinder OSE-Y30 elektryczna maszynka do mielenia tkanek</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td>Przyrząd do mielenia</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>ZEISS</td><td>stemi508</td><td></td></tr><tr><td>pułapki świetlne MXA-02</td><td>Maxttrac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna</td> <td>pochłaniająca komaryNingbo Bangning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Axygen</td><td>TF</td><td></td></tr><tr><td>Mini zestaw QIAamp wirusowego RNA</td><td>QIAGEN</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dumont</td><td>0203-5-PO</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania, odkryto wiele nowych sekwencji wirusopodobnych u stawonogów, w tym u komarów. Dwie główne kategorie tych nowych wirusów związanych z komarami to "wirusy przenoszone przez komary (MBV)" i "wirusy specyficzne dla komarów (MSV)". Te nowe wirusy mogą być chorobotwórcze zarówno dla kręgowców, jak i komarów, lub mogą po prostu być w symbiozie z komarami. Wirusy bytowe są niezbędne do potwierdzenia cech biologicznych tych wirusów. W związku z tym opisano tutaj szczegółowy protokół izolacji i amplifikacji wirusa od komarów zebranych w terenie. W pierwszej kolejności próbki komarów przygotowano jako supernatanty homogenatów komarów. Po dwukrotnym odwirowaniu supernatanty zostały następnie zaszczepione do linii komórkowej komarów C6/36 lub linii komórkowej kręgowców BHK-21 w celu amplifikacji wirusa. Po 7 dniach supernatanty zebrano jako supernatanty P1 i przechowywano w temperaturze -80 °C. Następnie supernatanty P1 pasażowano jeszcze dwukrotnie w komórkach C6/36 lub BHK-21, podczas gdy stan komórek był sprawdzany codziennie. Kiedy odkryto efekt cytopatogenny (CPE) na komórki, te supernatanty zostały zebrane i wykorzystane do identyfikacji wirusów. Protokół ten służy jako podstawa dla przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym MBV i MSV.

Po inokulacji supernatantami homogenatów komarów (P0), w komórkach C6/36 zaobserwowano szerokie przestrzenie międzykomórkowe oraz złuszczanie komórek w 120 h (Rycina 1A) w porównaniu z nieinokulowanymi komórkami (kontrolnymi) w tym samym czasie (Rycina 1B). Po inkubacji komórek BHK-21 z supernatantami P3, w komórkach BHK-21 w 48 h zaobserwowano widoczny efekt cytopatyczny (CPE) (Rycina 1C) w przeciwieństwie do komórek kontrolnych (<...

Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.

Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Protokół ten jest użytecznym podejściem do izolowania wirusów związanych z komarami i może pomóc w dalszych badaniach nad dystrybucją patogenów związanych z komarami i zwalczaniem chorób przenoszonych przez komary. Stosowanie cienkich linii do izolacji wirusów w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 jest bezpieczniejsze i bardziej wydajne. W przeciwieństwie do innych procedur izolacji wirusa, takich jak cykliczne szczepienie czerwonym płynem, technika ta nie wymaga eksperymentów na zwierzętach ani oceny etycznej.Zanieczyszczenie z próbek i komórek pobranych podczas inkubacji może prowadzić do niepowodzenia eksperymentu. Dlatego konieczne jest dodanie 2% penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny do pożywki, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Zacznij od dodania trzymilimetrowych kulek ceramicznych, 1,5 mililitra pożywki RPMI uzupełnionej 2% roztworem penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B w dwumililitrowej sterylnej probówce umieszczonej na lodzie, a następnie przenieś do niej 50 komarów.Następnie homogenizuj komary za pomocą niskotemperaturowego homogenizatora tkankowego, mieląc przez 30 sekund w temperaturze 70 Hz i 4 stopni Celsjusza przez 3 cykle. Odwirować homogenat o stężeniu 15 000 g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i przenieść supernatanty do nowych probówek. Aby całkowicie usunąć resztki komarów, należy ponownie odwirować supernatant w temperaturze 15 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Porcjować 200 mikrolitrów supernatantu P0 do dwumililitrowej probówki z nakrętką i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Do amplifikacji wirusa należy użyć linii komórkowej komara C6/36 z niedoborem RNAi Aedes albopictus oraz linii komórkowej kręgowców, nerki chomika dziecięcego lub BHK-21 z kolby o średnicy 75 centymetrów kwadratowych i wysiać je osobno na 24-dołkowych płytkach. Umieść 24-dołkową płytkę z nasionami na noc w temperaturze 28 lub 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić 80 do 90% zbieżności w każdej studzience. Przygotuj 500 mililitrów pożywki do konserwacji kultur komórkowych uzupełnionej antybiotykami. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z 24 dołków i dodać 100 mikrolitrów pożywki do konserwacji hodowli komórkowych do każdej studzienki.Następnie zaszczepić komórki 100 mikrolitrami supernatantu homogenatu komara lub P0. Inkubować płytki w temperaturze 28 lub 37 stopni Celsjusza przez 60 minut i delikatnie wstrząsać płytkami co 15 minut, aby zapobiec wysuszeniu komórek. Po zakończeniu usuń supernatant i przepłucz każdą studzienkę 600 mikrolitrami pożywki do konserwacji kultur komórkowych, aby całkowicie usunąć zanieczyszczenia. Następnie dodaj 800 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki przed umieszczeniem płytek w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 28 lub 37 stopni Celsjusza przez 7 dni.Codziennie monitoruj stan komórek każdej studzienki pod mikroskopem. Siódmego dnia zbierz supernatant komórek znany jako P1 i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Powtórz procedurę, aby pobrać supernatanty wirusowe P2 i P3.Ze względu na efekt cytopatogenny lub CPE, komórki z niektórych studzienek obumierają i odrywają się od powierzchni. Aby znacznie wzmocnić wirusy, zbierz od 300 do 400 mikrolitrów supernatantu ze studzienek wykazujących efekt CPE i przenieś go na nową sześciodołkową płytkę o 80 do 90% konfluencji komórek hodowli. Na koniec zbierz i przenieś 500 mikrolitrów supernatantu z dołków sześciodołkowej płytki do dwumililitrowych probówek do przechowywania z zakrętką przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Inokulacja komórek C6/36 homogenatami komarów P0 wykazała szeroką przestrzeń międzykomórkową w złuszczonych komórkach po 120 godzinach po zakażeniu w porównaniu z komórkami nieinokulowanymi lub kontrolnymi. Inkubacja komórek BHK21 z supernatantami wirusa P3 wykazała widoczne CPE po 48 godzinach od infekcji, wskazując na śmierć komórki i oderwanie od powierzchni w przeciwieństwie do komórek kontrolnych. Do wytworzenia produktów PCR dla supernatantu wirusa wykorzystano dostępne na rynku uniwersalne startery lub flawiwirusy, alfawirusy i bunyawirusy.Produkt PCR dla wirusa Bunya, wirusa Ebinur Lake, został ustalony jako kontrola pozytywna. Zakazy amplifikacji PCR na pasach należących do Bunyawirusów i kontrola pozytywna podkreśliły możliwość obecności Bunyavirus w supernatantach. Aby zwiększyć skuteczność izolacji wirusa, należy utrzymywać niską temperaturę podczas transportu, izolacji i mielenia próbki.Dodaj antybiotyki podczas homogenizacji komarów i samej kultury. I szybko obchodź się z kulturą podczas inkubacji i usuwania pożywki hodowlanej. Oprócz tej procedury roztwór do mielenia można wstrzyknąć do cyklicznego zarodka szczura lub kurczaka.Jednak procedura afirmacji wzbudzi obawy etyczne i zwiększy koszty eksperymentu.

mosquito-associated-virus-isolation-from-field-collected-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Opisano metody wykorzystania systemów transdukcyjnych alfawirusów do ekspresji reporterów fluorescencyjnych in vitro oraz u dorosłych komarów. Technikę tę można dostosować w celu ekspresji dowolnego białka docelowego zamiast reportera lub dodatkowo do niego.

System transdukcji alfawirusów: narzędzia do wizualizacji infekcji w wektorach komarzych

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Opisano uproszczoną, a zarazem dokładną metodę pobierania i barwienia hemocytów komarów. Nasza metoda łączy prostotę perfuzji z precyzją technik wysokociśnieniowych w celu wyizolowania czystych preparatów hemocytów u komarów z rodzaju Aedes. Metoda ta ułatwia badania wymagające wiedzy na temat typów hemocytów oraz ich liczebności.

Protokół pobierania i barwienia hemocytów z komarów żółtej febry Aedes aegypti

Opisujemy metodę przetwarzania i przesiewania komarów zebranych w terenie pod kątem różnorodnych wirusów za pomocą testu z hodowlą komórek Vero. Stosując tę technikę, wykryliśmy 9 różnych wirusów z 4 rodzin taksonomicznych w komarach zebranych w Connecticut.

Wykrywanie wirusów zakaźnych z komarów zebranych w terenie za pomocą testu hodowli komórek Vero

Źródło: Liu, X. i inni. Bakteryjny test żywienia ustnego z komarami leczonymi antybiotykami. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje rozwarstwienie jelita śródżałowego komara w celu wyizolowania bakterii jelitowych. Jelita środkowe jest pobierane z przewodu pokarmowego, homogenizowane, aby uwalniać bakterie, i nakładane na agarze odżywczym w celu hodowli kolonii bakterii.

Izolacja bakterii z jelita śródżałowego komarów

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Prezentowany protokół może określić kompetencję wektorową populacji komarów Aedes aegypti dla danego wirusa, takiego jak Zika, w warunkach powstrzymywania.

Wektorowe analizy kompetencyjne komarów Aedes aegypti z wykorzystaniem wirusa Zika

Ta metodologia, która obejmowała karmienie doustne i infekcję iniekcją dopiersiową, mogła skutecznie ocenić wpływ barier środkowego jelita i/lub gruczołów ślinowych na infekcję arbowirusem.

Eksperymentalna infekcja wirusowa u dorosłych komarów przez karmienie doustne i mikroiniekcję

Poznaj metodę izolacji wirusów z komarów Aedes albopictus przy użyciu linii komórkowych C6/36 i BHK-21. Protokół umożliwia bezpieczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez komary bez konieczności eksperymentów na zwierzętach.

Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

Przeglądaj więcej filmów