Name: Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj szybką metodę generowania organoidów raka pęcherza moczowego poprzez edycję genów ex vivo w mysich komórkach urotelialnych z użyciem adenowirusa-cre. To podejście skraca czas badań z lat do tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca badawcza była częściowo wspierana przez NIH Grants, K08CA252161(Q.L.), R01CA234162, and R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation i Friends of Urology Foundation. Dziękujemy Marisie Blask i Mili Pakhomovej za korektę rękopisu.

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY (1395M, 180501 bezpieczeństwa biologicznego i 180502). 
UWAGA: Kroki 1-3 wykonaj tego samego dnia.
1. Wypreparowanie pęcherza myszy
<ol>
	<li>Przygotowanie do sekcji
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie sterylne narzędzia, w tym nożyczki, kleszcze, sterylne DPBS w szalkach hodowlanych 35 mm, 70% etanolu, sterylną gazę i czyste ręczniki papierowe. Oczyść wszystkie powierzchnie obszaru rozwarstwienia. Wygeneruj samce myszy z potrójnym floksem Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f (4 myszy w wieku 10 tygodni), jak wcześniej opisano w laboratorium dr Goodricha 8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eutanazja i nacięcie
	<ol>
		<li>Poddaj myszy eutanazji przez uduszenie CO2 przy użyciu natężenia przepływu 2,0 l / min, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Oczyść obszar sekcji 70% etanolem i przykryj czystym ręcznikiem papierowym.</li>
		<li>Umieść mysz na gazie w obszarze sekcji. Spryskaj brzuch myszy 70% etanolem i użyj sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać dolne nacięcie brzucha w linii środkowej, odsłaniając pęcherz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie pęcherza moczowego
	<ol>
		<li>Użyj kleszczy, aby chwycić pęcherz i delikatnie pociągnij do góry, aby zidentyfikować obustronne połączenia moczowodowo-pęcherzowe. Użyj nożyczek, aby usunąć dno pęcherza moczowego zgodnie z linią graniczną między dwoma otworami moczowodu.</li>
		<li>Przenieś pęcherz do sterylnego naczynia z 2 ml DPBS. Usuń tkankę tłuszczową i łączną i włóż pęcherz do nowego naczynia ze sterylnymi 2 ml DPBS. W tym czasie należy wyjąć adenowirusa z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C i przechowywać go na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dysocjacja komórek urotelialnych
<ol>
	<li>Przygotowanie do dysocjacji komórek
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie sterylne narzędzia, w tym kleszcze, skalpele chirurgiczne (ostrze rozmiaru 10 z rękojeścią), sterylne DPBS w szalkach hodowlanych 35 mm, kompletną pożywkę hodowlaną bez FBS pozbawionego węgla drzewnego zdefiniowanego jako CCM(-), mieszaninę kolagenazy i hialuronidazy, rekombinowany enzym do substytutu trypsyny, 10% FBS pozbawiony węgla drzewnego w DPBS z 10 μM świeżym Y-27632, sterylne sitko do komórek 100 μm, i probówkę wirówkową o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Kompletna pożywka hodowlana (CCM) składa się z pożywki do wzrostu komórek nabłonka sutka uzupełnionej dostarczonymi czynnikami wzrostu i 5% FBS pozbawionego węgla drzewnego, 1% substytutu L-glutaminy, 100 μg/ml primociny i 10 μM świeżego Y-27632.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mielenie i trawienie pęcherza moczowego
	<ol>
		<li>Przenieść i ponownie umyć pęcherz moczowy 2 ml sterylnego DPBS w naczyniu o średnicy 35 mm w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Zbierz tkanki pęcherza moczowego od czterech myszy do naczynia z 1 ml CCM (-) i zmiel każdy pęcherz na cztery równe części za pomocą ostrza chirurgicznego. Użyj kleszczy, aby rozłożyć pęcherz, aby odsłonić powierzchnię nabłonka dróg moczowych na działanie pożywki.</li>
		<li>Przenieść kawałki pęcherza moczowego i pożywkę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Umyj naczynie 2 ml CCM(-) 2x i zbierz je do probówki wirówkowej do całkowitej objętości 5 ml.</li>
		<li>Dodać mieszaninę kolagenazy i hialuronidazy do końcowego stężenia 300 j./ml kolagenazy i 100 j./ml hialuronidazy i umieścić probówkę poziomo w orbitalnym wytrząsarce inkubacyjnej o temperaturze 37 °C na 30 minut przy 200 obr./min.</li>
		<li>Po wytrawieniu tkanek dodać równą objętość (5 ml) 10% FBS pozbawionego węgla drzewnego w DPBS do probówki i odwirować probówkę przy 200 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Dodaj 2 ml substytutu trypsyny do osadu komórkowego i dobrze wymieszaj. Umieścić probówkę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 4 minuty.</li>
		<li>Po inkubacji pipetować w górę i w dół 10-krotnie za pomocą standardowej końcówki P1000. Dodaj 5 ml 10% FBS pozbawionego węgla drzewnego w DPBS.</li>
		<li>Przecedź odłączone komórki przez sterylne sitko do komórek o wielkości 100 μm. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zliczanie i ponowne zawieszanie komórek
	<ol>
		<li>Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml CCM.</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i umieść tylko 6 komórek 0,5 x 10 w studzience 24-dołkowej z 0,5 ml świeżego CCM. W tym czasie wyjąć ekstrakty matrycowe z komórek mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (patrz tabela materiałów) z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i rozmrozić na lodzie. Podgrzej 6-dołkową płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Pozostałe komórki można odwirować i zamrozić jako granulki komórkowe w celu kontroli transdukcji niewirusowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Transdukcja adenowirusowa i organoidy galwaniczne
UWAGA: Proszę zachować ostrożność podczas przetwarzania adenowirusa. Personel laboratoryjny powinien przestrzegać praktyk bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2 i dezynfekować adenowirusa za pomocą 10% wybielacza.
<ol>
	<li>Dodać 2 μl adenowirusa (Ad5CMVCre; 1 x 107 PFU/μL) do płytki 24-dołkowej. Dobrze wymieszaj z odłączonymi komórkami urotelialnymi.</li>
	<li>Aby zwiększyć skuteczność transdukcji, należy przeprowadzić spinokkulację, wirując 24-dołkową płytkę o sile 300 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przenieść komórki i pożywkę ze studzienki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut. Wyjąć i wyrzucić supernatant, dodać 50 μl CCM i dobrze wymieszać z komórkami na dnie.</li>
	<li>Dodaj 140 μl ekstraktu z matrycy i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Szybko dodaj roztwór do wstępnie podgrzanej płytki 6-dołkowej o stężeniu 50 μl/kopułkę, aby utworzyć kopułki dla organoidów.</li>
	<li>Delikatnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i pozostawić kopułki do zestalenia się przez 5 minut. Odwrócić 6-dołkową płytkę do góry nogami i kontynuować krzepnięcie przez dodatkowe 25 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 2,5 ml CCM do każdej studzienki i umieścić płytkę w inkubatorze w celu hodowli organoidów.</li>
</ol>
4. Hodowla organoidów i pasażowanie
<ol>
	<li>Zmieniaj podłoże co 3-4 dni. Przeprowadź hodowlę, pasażowanie i zamrażanie organoidów, jak opisano w Lee et al.9. Wykonaj zatapianie organoidów za pomocą żelu do przetwarzania próbek, jak opisano w Fujii et al.10.</li>
	<li>Usuń pożywkę i dodaj 1 ml dypazy do każdej studzienki. Delikatnie rozbij kopułkę i dobrze wymieszaj końcówką do pipety P1000.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 30 minut. Następnie zbierz wszystkie komórki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i umyj studzienkę 4 ml 10% FBS pozbawionego węgla drzewnego w DPBS. Jeśli komórki organoidów pojawiają się jako duże skupiska, wykonaj krok 2.2.6. i Krok 2.2.7. aby uzyskać rozłączone komórki.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i przemyć komórki 1 ml CCM.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 70% ekstrakcie z matrycy i postępować zgodnie z krokami 3.4.-3.6. dla hodowli. Alternatywnie, kriokonserwuj komórki poprzez ponowne zawieszenie w 90% pozbawionym węgla drzewnego FBS i 10% DMSO uzupełnionym 10 μM świeżym Y-27632.</li>
</ol>
5. Implantacja komórek organoidowych do myszy C57BL/6J podskórnie
<ol>
	<li>Przygotowanie do implantacji
	<ol>
		<li>Przygotuj 25G 1,5 w igłach, strzykawkę 1 ml, 1 mg / ml dypazy, ekstrakt z matrycy, 10% FBS pozbawiony węgla drzewnego w DPBS z 10 μM świeżym Y-27632 i 15 ml probówki wirówkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja komórek organoidowych
	<ol>
		<li>Po uzyskaniu stabilnej hodowli przez co najmniej 5 pasaży, należy zebrać rozszerzone komórki organoidowe do wstrzyknięcia in vivo. Wykonaj kroki 4.2.-4.4. i ponownie zawiesić komórki w 1 ml CCM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczenie komórek i wstrzyknięcie podskórne
	<ol>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Po odwirowaniu w sile 200 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić 2 x 106 komórek w 100 μl 50% ekstraktu matrycowego w DPBS. Umieść zawiesinę na lodzie i przenieś ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego w pomieszczeniu zabiegowym dla zwierząt.</li>
		<li>Znieczulenie dwóch samców myszy C57BL/6J (w wieku 10 tygodni) 4% izofluranem i przepływem 1 l/minO2 przez około 4 minuty w komorze. Gdy myszy stracą odruch prostowania, a ich wzorzec oddychania stanie się głębszy i wolniejszy, przenieś myszy do obwodu bez ponownego oddychania z 2% izofluranem i przepływem 1 l / min O2 . Zastosuj maść weterynaryjną, aby chronić oczy zwierząt przed urazami.</li>
		<li>Ogolić jeden obszar wokół miejsca wstrzyknięcia po prawej stronie myszy i użyć 70% etanolu do oczyszczenia, a następnie użyj igły 25 G, aby bezpośrednio wstrzyknąć zawiesinę komórek 100 μl w prawy bok w znieczuleniu.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu usuń znieczulenie wziewne i umieść myszy w klatce pod lampą grzewczą, aż do wyzdrowienia i pełnej mobilizacji. Zwróć myszy do pomieszczeń i monitoruj tworzenie guza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Pobieranie guzów i rozmnażanie in vivo
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z krokiem przygotowania 2.1.1. Eutanazja myszy przez uduszenie CO2 przy użyciu szybkości przepływu 2,0 l / min, a następnie zwichnięcie szyjki macicy po utworzeniu guza o średnicy ~ 2,0 cm (prawie 2-3 tygodnie). Przenieś myszy do czystego obszaru sekcji, spryskaj 70% etanolem obszar guza boku myszy i użyj sterylnych nożyczek do preparowania i kleszczy, aby wykonać nacięcie w celu oddzielenia guza.</li>
	<li>Umyj guz w naczyniu o średnicy 60 mm z 5 ml DPBS i użyj nożyczek, aby usunąć tkankę łączną. Wytnij jeden kawałek świeżego guza i zanurz go w 4% paraformaldehydzie w DPBS przez 48 godzin, a następnie wyślij do zatopienia parafiny i przekroju do analizy histologicznej.</li>
	<li>Przetwórz drugą połowę świeżego guza pod kątem dysocjacji komórek. Krótko zmielić świeży guz na 1 mm3 kawałki w celu dysocjacji w naczyniu o średnicy 60 mm z 5 ml CCM (-). Następnie, po wykonaniu kroków 2.2.4.-2.2.8., wstrzyknij odłączone komórki nowym myszom C57BL / 6J w celu pasażowania in vivo zgodnie z krokiem 5.3. lub zachować jako hodowlę organoidów in vitro zgodnie z krokami 3.4.-3.6., lub zamrozić bezpośrednio w ciekłym azocie, używając 90% FBS pozbawionego węgla drzewnego i 10% DMSO z 10 μM świeżym Y-27632.</li>
	<li>W razie potrzeby odzyskać zamrożone komórki, szybko rozmrażając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przemłukując CCM(-). Następnie zawieś je ponownie w 100 μl 50% ekstraktu z matrycy w DPBS do bezpośredniego wstrzyknięcia myszom w celu powstania guza in vivo. Do jednego wstrzyknięcia in vivo należy użyć co najmniej 2 x 106 rozmrożonych komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2021%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li>
<li>DeGraff, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+preclinical+models+for+the+advancement+of+translational+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).</li>
<li>Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+treatment+landscape+of+advanced+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma.</a> Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).</li>
<li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids%3A+A+tool+for+bladder+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li>
<li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+bladder+cancer+in+mice%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li>
<li>Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+in+oncology+research+and+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine.</a> EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).</li>
<li>Ku, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb1+and+Trp53+cooperate+to+suppress+prostate+cancer+lineage+plasticity%2C+metastasis%2C+and+antiandrogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance.</a> Science. 355 (6320), 78-83 (2017).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+histopathological+evaluation+of+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A simple method for histopathological evaluation of organoids.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).</li>
<li>Georgas, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+illustrated+anatomical+ontology+of+the+developing+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract.</a> Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).</li>
<li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+organoids+originating+from+Cd49f%28high%29+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communication. 10 (1), 4407(2019).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+defined+disease+model+reveals+that+urothelial+cells+can+initiate+divergent+bladder+cancer+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intertumoral+heterogeneity+in+SCLC+is+influenced+by+the+cell+type+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin.</a> Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).</li>
<li>Sutherland, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+of+origin+of+small+cell+lung+cancer%3A+inactivation+of+Trp53+and+Rb1+in+distinct+cell+types+of+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung.</a> Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).</li>
<li>Bottger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+heterogeneity+underlies+differential+cisplatin+sensitivity+in+mouse+models+of+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer.</a> Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).</li>
<li>Puzio-Kuter, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+p53+and+Pten+promotes+invasive+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer.</a> Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+models+of+bladder+cancer+identify+a+prognostic+signature+associated+with+risk+of+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression.</a> Cancer Research. 81 (20), 5161-5175 (2021).</li>
<li>Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+genetic+removal+of+signaling+molecules+in+cultured+primary+mouse+embryonic+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160(2010).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+interrogation+of+cancer+cell+of+origin+through+CRISPR+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

GEMM są złotymi standardami w modelowaniu nowotworów inicjowanych na podstawie prawidłowych komórek, umożliwiając rygorystyczne testowanie konsekwencji potencjalnych zaburzeń onkogennych (aktywacja onkogenu i/lub utrata supresorów nowotworu). W tym przypadku zapewniony jest szybki i skuteczny protokół generowania organoidów raka pęcherza moczowego poprzez edycję genów ex vivo normalnych mysich komórek urotelialnych zawierających floksowane allele w genach będących przedmiotem zainteresowania. Barwienie H&E i IHC...

Rak pęcherza moczowego jest czwartym najczęściej występującym nowotworem u mężczyzn i dotyka ponad 80 000 osób rocznie w Stanach Zjednoczonych1. Chemioterapia oparta na platynie jest standardem opieki nad pacjentami z zaawansowanym rakiem pęcherza moczowego od ponad trzech dekad. Krajobraz leczenia raka pęcherza moczowego został zrewolucjonizowany przez niedawne zatwierdzenie przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) immunoterapii (inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych anty-PD-1 i anty-PD-L1), erdafitynibu (inhibitor receptora czynnika wzrostu fibroblastów) i enfortumabu vedotin (koniugat przeciwciało-lek)2,3,4. Nie są jednak dostępne klinicznie zatwierdzone biomarkery do przewidywania odpowiedzi na chemioterapię lub immunoterapię. Istnieje pilna potrzeba stworzenia informacyjnych modeli przedklinicznych, które mogą poprawić zrozumienie mechanizmów kierujących progresją raka pęcherza moczowego i opracować biomarkery predykcyjne dla różnych metod leczenia.
Główną przeszkodą w badaniach translacyjnych pęcherza moczowego jest brak modeli przedklinicznych, które podsumowują patogenezę ludzkiego raka pęcherza moczowego i reakcje na leczenie5,6. Opracowano wiele modeli przedklinicznych, w tym modele 2D in vitro (linie komórkowe lub warunkowo przeprogramowane komórki), modele 3D in vitro (organoidy, druk 3D) oraz modele in vivo (ksenoprzeszczep, rakotwórcze, genetycznie modyfikowane modele i ksenoprzeszczep pochodzący od pacjenta)2,6. Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są przydatne w wielu zastosowaniach w biologii raka pęcherza moczowego, w tym w analizach fenotypów nowotworów, badaniach mechanistycznych genów kandydujących i/lub szlaków sygnałowych oraz przedklinicznej ocenie odpowiedzi terapeutycznych6,7. GEMM mogą wykorzystywać rekombinazy specyficzne dla miejsca (Cre-loxP) do kontrolowania delecji genetycznych w jednym lub więcej genach supresorowych nowotworu. Proces generowania pożądanych GEMM z wieloma delecjami genów jest czasochłonny, pracochłonny i kosztowny5. Ogólnym celem tej metody jest opracowanie szybkiej i wydajnej metody dostarczania ex vivo Cre do tworzenia modeli potrójnego nokautu pęcherza moczowego (TKO) z normalnych mysich komórek urotelialnych zawierających potrójnie floksowane allele (Trp53, Pten i Rb1)8. Główną zaletą metody ex vivo jest szybki przebieg pracy (1-2 tygodnie zamiast lat hodowli myszy). W tym artykule opisano protokół zbierania normalnych komórek urotelialnych z floksowanymi allelami, transdukcji adenowirusa ex vivo, kultur organoidowych oraz charakterystyki in vitro i in vivo u immunokompetentnych myszy C57 BL / 6J. Metoda ta może być dalej wykorzystywana do generowania klinicznie istotnych organoidów raka pęcherza moczowego u myszy immunokompetentnych zawierających dowolną kombinację floksowanych alleli.

<table><tbody><tr><td>100 &mu; m sterylne sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>25G Igła 1,5 cala</td><td>EXELINT International</td><td>26406</td><td></td></tr><tr><td>Adenowirus (Ad5CMVCre Wysokie miano, 1E11 pfu/ml)</td><td>UI Wektor wirusowy Rdzeń</td><td>VVC-U Iowa-5-HT</td><td></td></tr><tr><td>C57 BL/6J</td><td>Jackson Lab</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td> <td>z węglem drzewnymGibco</td><td>A3382101</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza/hialuronidaza</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>07912</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Substytut L-glutaminy (GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek nabłonka sutka</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakty z matrycy Engelbreth&ndash; Holm&ndash; Mięsaki myszy roju (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalny anty-CK20</td><td>myszy DAKO</td><td>M7019</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>Monoklonalny mysz anty-CK7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-23876</td><td>IHC 1:50</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-p63</td><td>Abcam</td><td>ab735</td><td>IHC 1:100, IF 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonalny anty-Upk3</td><td>myszy Fitzgerald</td><td>10R-U103A</td><td>IHC 1:50</td></tr><tr><td>Monoklonalna mysia anty-wimentyna</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6260</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>Monoklonalny szczur anty-CK8</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>TROMA-I-s</td><td>IF 1:100</td></tr><tr><td>Inkubator CO2 HERAcell vios 160i</td><td>Thermo Fisher</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalny kurczak anty-CK5</td><td>Biolegend</td><td>905901</td><td>IF 1:500</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany enzym substytutu trypsyny (TrypLE Express Enzyme)</td><td>Termo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Stołowy inkubator z wytrząsaniem Signature Model 1575</td><td>VWR</td><td>35962-091</td><td></td></tr><tr><td>Żel do przetwarzania próbek (HistoGel)</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne rozmiar 10</td><td>Integra Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend RT</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004377</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T1</td><td>Thermo Fisher</td><td>75002383</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Rak pęcherza moczowego jest niedostatecznie zbadanym obszarem, szczególnie w genetycznie modyfikowanych modelach myszy (GEMM). Wsobne GEMM ze specyficznymi tkankowo miejscami Cre i loxP są złotymi standardami w warunkowym lub indukowalnym celowaniu genowym. Aby zapewnić szybsze i bardziej wydajne modele eksperymentalne, opracowano system hodowli organoidów ex vivo przy użyciu adenowirusa Cre i normalnych komórek urotelialnych zawierających wiele alleli loxP supresorów nowotworu Trp53, Pten i Rb1. Normalne komórki urotelialne są enzymatycznie odłączone od czterech pęcherzy myszy z potrójnymi klapkami (Trp53f / f: Ptenf / f: Rb1f / f). Komórki urotelialne są transdukowane ex vivo za pomocą adenowirusa-Cre napędzanego przez promotor CMV (Ad5CMVCre). Transdukowane organoidy pęcherza moczowego są hodowane, rozmnażane i charakteryzowane in vitro i in vivo. PCR służy do potwierdzania delecji genów w Trp53, Pten i Rb1. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) organoidów wykazuje dodatnią ekspresję markerów linii urotelialnej (CK5 i p63). Organoidy są wstrzykiwane podskórnie myszom gospodarzom w celu ekspansji guza i przejść szeregowych. Immunohistochemia (IHC) ksenoprzeszczepów wykazuje dodatnią ekspresję CK7, CK5 i p63 oraz ujemną ekspresję CK8 i Uroplakiny 3. Podsumowując, delecja genu za pośrednictwem adenowirusa z mysich komórek urotelialnych zmodyfikowanych za pomocą miejsc loxP jest skuteczną metodą szybkiego testowania potencjału rakotwórczego zdefiniowanych zmian genetycznych.

Przebieg procesu delecji genów za pomocą adenowirusa-Cre w komórkach urotelium myszy przedstawiono na Rysunku 1A. Towarzyszące wideo demonstruje sposób dysocjacji komórek urotelium z dna pęcherza moczowego oraz sposób transdukcji komórek potrójnie floxowanych ex vivo wirusem Ad5CMVCre. Rysunek 1A wykazał, że po trawieniu enzymatycznym dysocjowano minimalną liczbę komórek błony podśluzowej i mięśniowej. Aby potwierdzić wydajność dostarczania adenowirusa-...

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Opracowaliśmy szybki i skuteczny protokół generowania organoidów raka pęcherza moczowego poprzez edycję genów ex vivo normalnych mysich komórek urotelialnych zawierających floksowane allele w genach będących przedmiotem zainteresowania. Ta metoda ex vivo ma jedno- lub dwutygodniowy przepływ pracy zamiast lat hodowli myszy i jest bardzo skuteczna w transdukcji adenowirusa na delecje genu, w którym pośredniczy Cre. Na początek przygotuj wszystkie sterylne narzędzia i odczynniki, w tym nożyczki, kleszcze, DPBS w 35-mililitrowych naczyniach hodowlanych, 70% etanol, gazę i czyste ręczniki papierowe.Następnie oczyść wszystkie powierzchnie obszaru sekcji i przykryj obszar sekcji czystym ręcznikiem papierowym. Umieść uśpioną mysz na gazie w obszarze sekcji i spryskaj 70% etanolem brzuch myszy, a następnie za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych wykonaj dolne nacięcie brzucha w linii środkowej, aby odsłonić pęcherz. Teraz użyj kleszczy, aby chwycić i delikatnie pociągnąć pęcherz, aby zidentyfikować obustronne połączenie moczowodowo-pęcherzowe.Za pomocą nożyczek usuń dno pęcherza, podążając za linią graniczną między dwoma otworami moczowodu i przenieś pęcherz do sterylnego naczynia zawi

ex-vivo-organoid-model-adenovirus-cre-mediated-gene-deletions-mouse

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie wykorzystujemy adenowirus niosący gen rekombinazy Cre do zakażenia pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy posiadających floxowany allel Rac1.

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Mechanosensoryczne komórki rzęsate są komórkami receptorowymi ucha wewnętrznego. Najlepiej scharakteryzowany system modelowy in vitro dojrzałych komórek rzęsatych ssaków wykorzystuje hodowle organowe utriculów (utriculi) dorosłych myszy. Przedstawiamy metodę preparatyki utriculi dorosłej myszy oraz demonstrujemy zakażenie komórek podporowych w hodowlach utricul za pomocą adenowirusa.

Disekcja utriculi u dorosłej myszy i infekcja komórek podporowych za pomocą adenowirusa

Ten film opisuje generowanie modelu myszy jelita grubego przez segmentową infekcję adeno-cre. Zakażony odcinek jelita grubego prowadzi do nowotworzenia w obrębie tego odcinka błony śluzowej, w wyniku czego gruczolaki ostatecznie przechodzą w raka inwazyjnego i przerzutowego. Model ten stanowi atrakcyjną platformę do badań nad biologią nowotworów i przedklinicznych badań terapeutycznych.

Segmentalna infekcja Adeno-Cre: technika generowania izolowanego raka jelita grubego przy użyciu genetycznie modyfikowanych modeli myszy

Ten film opisuje metodę edycji określonych genów w komórkach gruczołu krokowego za pomocą systemu dostarczania opartego na adenowirusie. Podejście to pozwala na ortotopową i miejscową zmianę ekspresji genów przy użyciu technologii CRISPR do opracowania nowych mysich modeli raka prostaty.

Modelowanie raka prostaty w genetycznie modyfikowanych modelach mysich: technika zlokalizowanej edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach przedniego płata prostaty myszy

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidu DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza myszy za pomocą kombinacji cewnikowania cewki moczowej i technik elektroporacji. Opisana procedura pozwala na wygenerowanie modeli raka pęcherza moczowego u myszy.

Dostarczanie plazmidów DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza myszy: procedura oparta na elektroporacji mająca na celu skuteczne dostarczanie plazmidów DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy w celu wygenerowania modeli modyfikowanych genetycznie

Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Przedstawiono protokół tworzenia genetycznie modyfikowanego mysiego modelu raka jelita grubego poprzez segmentowe zakażenie adeno-cre i jego nadzorowanie za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Ten protokół opisuje nowo ustaloną metodę dostarczania wirusa do mysiej prostaty. Wykorzystując technologię CRISPR/Cas9, nadekspresję genów lub dostarczanie rekombinazy Cre, technika ta umożliwia ortotopową zmianę ekspresji genów i wdraża nowy mysi model raka prostaty.

Dostarczanie wirusów z przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów

Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.

Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.

Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen

Poznaj szybką metodę generowania organoidów raka pęcherza moczowego poprzez edycję genów ex vivo w mysich komórkach urotelialnych z użyciem adenowirusa-cre. To podejście skraca czas badań z lat do tygodni.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Przeglądaj więcej filmów