Name: Izolacja preadipocytów z zarodków piskląt brojlerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Naucz się izolacji preadipocytów z tkanki tłuszczowej zarodków brojlerów, umożliwiającej uzyskanie żywych komórek o wysokim potencjale adipogennym. Metoda pozwala badać rozwój tkanki tłuszczowej u kurcząt i ludzi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują UT AgResearch i Departamentowi Nauk o Zwierzętach za wsparcie i optymalizację tego protokołu. Praca ta została sfinansowana z grantu USDA.

<ol><li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFryar%2C+CD+%22Prevalence+of+overweight%2C+obesity%2C+and+severe+obesity+among+children+and+adolescents+aged+2-19+years%3A+United+States%2C+1963-1965+through+2015-2016%22">Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016</a>. , (2018).</li>
<li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Animal+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li>
<li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+efficiency%2C+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957%2C+1978%2C+and+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li>
<li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Lipids+and+Lipid+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li>
<li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li>
<li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li>
<li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology%2C+development%2C+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li>
<li>Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg">https://www.youtube.com/watch?v=JWjckEHO6Wg</a> (2022).</li>
<li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+cell+culture%3A+Advance+technology+for+modern+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li>
<li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li>
<li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crude+oil%2Fdispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+%CE%B3+activity+in+vitro+and+in+vivo%3A+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+%28DOSS%3B+CAS%23+577-11-7%29+as+a+probable+obesogen%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHausman%2C+DB+%22Adipose+Tissue+Protocols%22">Adipose Tissue Protocols</a>. , Springer. 201-219 (2008).</li>
<li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).</li>
<li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+swimming+dots+in+cell+culture%3A+the+identity%2C+detection+method+and+judging+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906(2018).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+a+manual+of+basic+technique+and+specialized+applications%22">Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications</a>. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż kilka dobrze opisanych protokołów donosiło o izolacji preadipocytów 14,15,16,17, izolacja zarodkowych preadipocytów została zoptymalizowana, co można wykorzystać do funkcjonalnych analiz wzrostu i rozwoju tłuszczu we wczesnym okresie życia u piskląt brojlerów. Protokół ten zapewnia embrionalne komórki progenitorowe adipocytów o wysokiej żywotności i wysokim potencjale różnicowania. Co w...

Otyłość jest globalnym zagrożeniem dla zdrowia zarówno dorosłych, jak i dzieci. Dzieci z nadwagą lub otyłością są około pięć razy bardziej narażone na otyłość niż dorośli, co naraża je na znacznie zwiększone ryzyko chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy i wielu innych chorób współistniejących. Około 13,4% amerykańskich dzieci w wieku 2-5 lat cierpi na otyłość1, co ilustruje, że tendencja do gromadzenia nadmiaru tkanki tłuszczowej może być uruchomiona bardzo wcześnie w życiu. Z bardzo różnych powodów nagromadzenie nadmiaru tkanki tłuszczowej jest problemem dla kurcząt brojlerów (typu mięsnego). Nowoczesne brojlery są niezwykle wydajne, ale nadal gromadzą więcej lipidów, niż jest to fizjologicznie konieczne2,3. Tendencja ta zaczyna się wkrótce po wykluciu i skutecznie marnuje paszę, najdroższy składnik produkcji, przeznaczając ją z dala od wzrostu mięśni. Dlatego zarówno w przypadku dzieci, jak i kurcząt brojlerów, choć z bardzo różnych powodów, istnieje potrzeba zrozumienia czynników wpływających na rozwój tkanki tłuszczowej i określenia sposobów ograniczenia ekspansji tkanki tłuszczowej we wczesnym okresie życia.
Adipocyty powstają z preadipocytów, komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej, które ulegają różnicowaniu, aby rozwinąć dojrzałe, magazynujące lipidy komórki tłuszczowe. W związku z tym preadipocyty in vitro są cennym modelem eksperymentalnym do badań nad otyłością. Komórki te, wyizolowane z zrębowej frakcji naczyniowej magazynów tłuszczu, mogą zapewnić podstawowe zrozumienie szlaków molekularnych kontrolujących różnicowanie i metabolizm adipocytów4,5. Zarodki piskląt są korzystnym modelem eksperymentalnym w badaniach rozwojowych, ponieważ hodowla komórek jajowych zgodnie z pożądanym harmonogramem ułatwia manipulację eksperymentalną, ponieważ umożliwia uzyskanie zarodków bez poświęcania matki w celu obserwacji szeregu etapów rozwojowych zarodków. Co więcej, skomplikowane zabiegi chirurgiczne i długie okresy czasu nie są wymagane do uzyskania zarodków w porównaniu z większymi modelami zwierzęcymi. W związku z tym zarodek pisklęcia stwarza możliwość pozyskania preadipocytów już od najwcześniejszych etapów rozwoju tkanki tłuszczowej. Podskórna tkanka tłuszczowa staje się widoczna u pisklęcia około 12 dnia embrionalnego (E12) jako wyraźnie zaznaczony magazyn zlokalizowany wokół uda. Ten magazyn jest wzbogacony w wysoce proliferacyjne preadipocyty, które aktywnie ulegają różnicowaniu pod wpływem sygnałów rozwojowych, tworząc dojrzałe adipocyty6,7. Proces różnicowania adipogennego jest porównywalny u kurcząt i ludzi. W związku z tym preadipocyty wyizolowane z zarodków piskląt mogą być wykorzystywane jako model o podwójnym przeznaczeniu do badań istotnych dla ludzi i drobiu. Jednak wydajność preadipocytów spada wraz z wiekiem, gdy komórki wyrastają na dojrzałe adipocyty5.
Obecny protokół optymalizuje izolację preadipocytów z tkanki tłuszczowej podczas etapu (E16-E18), w którym różnicowanie adipogenne i przerost adipocytów osiągają szczyt u zarodków piskląt brojlerów8. Procedura ta może ocenić wpływ czynników, na które rozwijający się zarodek jest narażony in ovo, takich jak dieta kur, na rozwój adipocytów i potencjał adipogenny ex vivo. Może również testować wpływ różnych manipulacji (np. niedotlenienia, dodatków składników odżywczych, farmakologicznych agonistów i antagonistów) na adipogenezę lub różne "omy" (np. transkryptom, metabolom, metylom) komórek progenitorowych adipocytów. Jako reprezentacja najwcześniejszego etapu powstawania tkanki tłuszczowej, komórki uzyskane przy użyciu tego protokołu są cennymi modelami do badań istotnych dla drobiu i ludzi.

<table><tbody><tr><td>Pipeta 1 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Z683825</td><td>Pipeta jednokanałowa, 100 - 1000 &mikro; L</td></tr><tr><td>1 ml Końcówka do pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-402</td><td></td></tr><tr><td>100% Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426P4</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Kolba</td><td>Pyrex</td><td>4980-25</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>F75P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka testowa</td> poddana działaniu kultur tkankowych <td>Costar</td><td>3632</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka, czarne dno Costar</td><td></td><td>3603</td><td>Adipo poddana działaniu kultur tkankowych</td></tr><tr><td>AdipoRed</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Wycieraczka laboratoryjna (Kimtechwiper)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>W górę & Up</td><td>NDC 1167300334</td><td>20% roztworem roboczym</td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Corning</td><td>6749</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 i mikro; m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z kurczaka</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe, 15 ml</td><td>Stożkowe</td> probówki wirówkowe VWR <td>10025-690</td><td></td></tr><tr><td>, 50 ml</td><td>Zakrzywione</td> kleszcze Falcon <td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Nunc</td><td>343958</td><td></td></tr>, <tr><td>100 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki chirurgiczne, 115 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6839</td><td></td></tr><tr><td>Milipore</td> wody<td>destylowanej</td><td>SYNSV0000</td><td>dozowane w razie potrzeby</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>70% roztwór roboczy</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td></td>Mikroskop fluorescencyjny <td>Gibco</td> 10437028 <td></td></tr><tr><td></td><td>EVOS</td><td>M7000</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek fluorescencyjnych</td><td>Folia Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds</td><td></td><td>Wrap Heavy Duty Folia aluminiowa, 125 stóp kwadratowych.</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Milipora</td><td>żelatyny</td><td>4055</td><td>2% roztwór roboczy</td></tr><tr><td>Hematocytometr (komora zliczająca)</td><td>Corning</td><td>480200</td><td>Inkubator o głębokości 0,1 mm</td></tr><tr><td></td><td>Sterylizator narzędzi Fisher Scientific</td><td>6845</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>B1205</td><td></td></tr><tr><td>Kwas linolowy-oleinowy Acid-Albumina</td><td>Sigma</td><td>L9655</td><td>1x Mikroskop z roztworem roboczym</td></tr><tr><td></td><td>Evos</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661070</td><td>Pittery 12-kanałowe, 30 - 300 i mikro; L</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-7907</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>IKA</td><td>KS130BS1</td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td>Tork</td><td>RK8002</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Steptomycyna (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1x Roztwór roboczy</td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 100 mm</td><td>Szalki Falcona</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Petriego, 60 mm</td><td>Wytrząsarka</td> płytkowa Falcon <td>351007</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bufor</td> do lizy VWR <td>200</td><td></td></tr><tr><td>RBC</td><td>Rezerwator</td> odczynników Roche <td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td></td></tr><tr><td>Mała zlewka, 100 ml</td><td>Pyrex</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek spektrofotometru</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td><td>McKesson</td><td>762703</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste, 120 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki proste, 140 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6762</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Kolba</td><td>Corning</td><td>430639</td> Inkubator kultur tkankowych <td>poddany kulturom tkankowym</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do tkanek, 250 i mikro; m</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>0,1% roztworu roboczego</td></tr><tr><td>Pęseta, 110 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Collagenaza</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman klasy 1 Whatman</td><td></td><td>1001-110</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja preadipocytów z zarodków piskląt brojlerów

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Pierwotne preadipocyty są cennym systemem eksperymentalnym do zrozumienia molekularnych szlaków kontrolujących różnicowanie i metabolizm adipocytów. Zarodki kurczaków dają możliwość wyizolowania preadipocytów już od najwcześniejszego etapu rozwoju tkanki tłuszczowej. Ta pierwotna komórka może być wykorzystana do identyfikacji czynników wpływających na proliferację preadipocytów i różnicowanie adipogenne, co czyni je cennym modelem do badań związanych z otyłością u dzieci i kontrolą nadmiernego odkładania się tłuszczu u drobiu. Szybki wzrost poporodowej tkanki tłuszczowej skutecznie marnuje paszę, alokując ją z dala od wzrostu mięśni u kurcząt brojlerów. Dlatego metody pozwalające zrozumieć najwcześniejsze etapy rozwoju tkanki tłuszczowej mogą dostarczyć wskazówek do regulacji tej tendencji i zidentyfikowania sposobów ograniczenia ekspansji tkanki tłuszczowej we wczesnym okresie życia. Niniejsze badanie miało na celu opracowanie skutecznej metody izolacji, hodowli pierwotnej i różnicowania adipogennego preadipocytów wyizolowanych z rozwijającej się tkanki tłuszczowej komercyjnych zarodków piskląt brojlerów (typu mięsnego). Procedura została zoptymalizowana w celu uzyskania komórek o wysokiej żywotności (~98%) i zwiększonej zdolności do różnicowania się w dojrzałe adipocyty. Ta prosta metoda izolacji, hodowli i różnicowania zarodków preadipocytów wspiera funkcjonalne analizy wzrostu i rozwoju tłuszczu we wczesnym okresie życia.

Pierwotne preadipocyty są morfologicznie podobne do fibroblastów, mają nieregularne, gwiaździste kształty i centralnie położone jądro (Rysunek 2A-C). Komórki te łatwo przylegają do plastiku do hodowli tkankowych i zaczynają proliferować wkrótce po adhezji. W obecności kwasów tłuszczowych w pożywce szybko różnicują się i gromadzą kropelki lipidowe (Rysunek 3D). Wykazana w prezentowanych tu izolacjach żywotność (98%, na podstawie ...

Obecny protokół opisuje prostą metodę izolowania preadipocytów z tkanki tłuszczowej w zarodkach brojlerów. Metoda ta umożliwia izolację z wysoką wydajnością, hodowlą pierwotną i różnicowaniem adipogennym preadipocytów. Barwienie czerwienią olejową O i barwienie lipidami/DNA mierzyło zdolność adipogenną izolowanych komórek indukowanych pożywką różnicującą.

Izolacja preadipocytów z zarodków piskląt brojlerów

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Pierwotne preadipocyty są cennym systemem eksperymentalnym do zrozumienia szlaków molekularnych kontrolujących metabolizm adipocytów. Zarodki kurczaka dają możliwość wyizolowania preadipocytów już od najwcześniejszego etapu rozwoju adipocytów. Metoda ta została zoptymalizowana w celu uzyskania komórek o wysokiej żywotności i zwiększonej zdolności do różnicowania się w dojrzałe adipocyty, które można wykorzystać do analizy funkcjonalnej wzrostu i rozwoju zarodka tłuszczu we wczesnym okresie życia u piskląt.Proces różnicowania adipogennego jest wysoce porównywalny między kurczętami i ludźmi. W związku z tym wyizolowane preadipocyty mogą być wykorzystane jako podwójnie proponowany model do badań istotnych dla ludzi i drobiu. Aby rozpocząć wymaz z ciała zarodka z 70% etanolem.Następnie, aby zapobiec zakłóceniom podczas filtracji, w późniejszych etapach po trawieniu delikatnie wyszoruj powierzchnię skóry sterylną gazą, aby usunąć pióra. Następnie odetnij skórę między nogami i okolicą brzucha, aby odsłonić parę magazynów tłuszczu udowego. Użyj zakrzywionych kleszczy jedną ręką, aby przytrzymać skórę wokół nogi i delikatnie usunąć podskórną tkankę tłuszczową z kości udowej.drugą ręką. Później użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie odciągnąć magazyn od nogi. Przenieś tkanki do 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki zbiorczej i powtórz sekcję dla drugiej strony poduszeczki tłuszczowej.Teraz przenieś zebrane poduszeczki tłuszczowe na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór sterylizacyjny i krótko spłucz, kilkakrotnie obracając naczynie. Następnie przepłucz roztwór sterylizacyjny, przenosząc poduszeczki tłuszczowe na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą PBS. Delikatnie zakręć płytką i ponownie umyj PBS.W celu strawienia tkanki tłuszczowej przenieś je do 15-milimetrowej rurki zawierającej wstępnie podgrzany roztwór enzymatyczny. Następnie zanurz parę długich, prostych nożyczek w tubce i na koniec zmiel tkankę tłuszczową w roztworze na jak najmniejsze kawałki. Przenieść tkankę mieloną i roztwór enzymatyczny do 25-mililitrowej kolby sterylizowanej w autoklawe.Owinąć kolbę folią parafinową i umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu roztrawienia. Po strawieniu delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Następnie usuń wszelkie kawałki niestrawionej tkanki i zanieczyszczenia, filtrując przez sitko do tkanek o średnicy 250 mikrometrów do 15-mililitrowej probówki za pomocą pipetowania.Teraz usuń komórki przylegające do kolby, przepłukując kolbę czterema mililitrami pożywki wzrostowej i przefiltruj zawiesinę komórek do tej samej 15-mililitrowej probówki. Następnie przepłucz sitko, ponownie pipetując pożywkę wzrostową, aby usunąć wszelkie komórki uwięzione w filtrze. Wirować przy 300 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby zagnieździć frakcję komórkową i zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.Delikatnie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek, dobrze wymieszać pipetując i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczyć komórki, dodając pięć mililitrów pożywki wzrostowej do probówki zawierającej komórki i delikatnie wymieszać je przez pipetowanie. Teraz odpipetuj komórki na sitko o średnicy 40 mikrometrów i przefiltruj je do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Następnie przepłucz sitko dodatkowymi pięcioma mililitrami pożywki wzrostowej i otul komórki, wirując w temperaturze 300 razy G przez siedem minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zassać supernatant. Zawiesić pozostałą osadkę komórkową w jednym mililitrze pożywki wzrostowej przez pipetowanie Aby określić gęstość komórek i żywotność, wymieszaj 10 mikrolitrów każdej próbki z błękitem trypanowym przez pipetowanie.Załaduj 10 mikrolitrów mieszaniny na hemocytometr i policz komórki. Analiza preadipocytów po 24, 48 i 72 godzinach wykazała prawidłową morfologię i liczbę komórek. Indukcja adipogenna preadipocytów wykazała szybkie różnicowanie i akumulację kropelek lipidów.Agresywne obchodzenie się z preadipocytami podczas izolacji skutkowało uszkodzeniem komórek i niską liczbą komórek. Skażenie mikrobiologiczne można zaobserwować pomimo podjęcia środków zapobiegawczych. Barwienie lipidów czerwienią olejową O wykazało, że preadipocyty szybko zaczynają tworzyć kropelki lipidów pod wpływem indukcji adipogennej, a akumulacja postępuje w czasie, jak zaobserwowano w ciągu 24, 48 i 72 godzin.Akumulację lipidów w stosunku do liczby komórek określono ilościowo za pomocą barwienia lipidów i DNA. Zarówno akumulacja lipidów, jak i proliferacja komórek zwiększały się z czasem. Niską liczbę komórek lub uszkodzone komórki można zaobserwować, gdy frakcje tkankowe są trawione zbyt długo.Dlatego zaleca się, aby nie przekraczać półtorej godziny trawienia. Wyizolowane preadipocyty mogą być wykorzystywane do badań ekspresji genów. Można uzyskać wystarczającą ilość RNA do wykorzystania w syntezie cDNA i kontynuacji qPCR lub RNAseq.

isolation-of-preadipocytes-from-broiler-chick-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji i hodowli zarodków przepiórki lub kury na etapie HH14.- komórki endokardialne zastawki oraz mezenchymalne komórki poduszeczki zastawkowej w stadium HH25.

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek progenitorowych zastawek ptasich

Ten film pokazuje izolację błony kosmówkowo-omoczniowej zawierającej guz od zarodka kurczaka. Pozyskany CAM może być wykorzystany do dalszych zastosowań.

Zbiór błony chorioallantoicznej piskląt: metoda izolowania błony chorioomocznowej zawierającej przeszczep guza z jaja kurzego

Modele hodowli komórkowych zapewniają szczegółową kontrolę nad warunkami środowiskowymi, a tym samym stanowią potężną platformę do wyjaśnienia wielu aspektów biologii komórek neuronalnych. Opisujemy szybką, niedrogą i niezawodną metodę izolacji, dysocjacji i hodowli neuronów czuciowych z zarodków piskląt. Podano również szczegółowe informacje na temat przygotowania podłoża i immunocytochemii.

Izolacja i hodowla zdysocjowanych neuronów czuciowych z zarodków piskląt

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Ten artykuł przedstawia metodę izolowania czystych tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków, które mogą być łączone w celu utworzenia chimerycznych organów ex vivo.

Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj opisujemy protokół separacji żółtka, komórek ziarnistych i komórek osłonki w ptasich pęcherzykach przedowulacyjnych. Ta precyzyjna obsługa umożliwia krytyczne badania nad rolą tych warstw w funkcjach rozrodczych, pomagając w zrozumieniu rozwoju pęcherzyków włosowych, regulacji hormonalnej i badań nad chorobami w celu zwiększenia plonów rolnych i wglądu biomedycznego.

Oddzielanie ziarnistych pęcherzyków przedowulacyjnych i warstw komórek osłonki ptasich do dalszych zastosowań

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Naucz się izolacji preadipocytów z tkanki tłuszczowej zarodków brojlerów, umożliwiającej uzyskanie żywych komórek o wysokim potencjale adipogennym. Metoda pozwala badać rozwój tkanki tłuszczowej u kurcząt i ludzi.

Izolacja preadipocytów z zarodków piskląt brojlerów

Przeglądaj więcej filmów