Name: Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj cyfrową reakcję łańcuchową polimerazy kropelkową do pomiaru liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA w pojedynczych komórkach. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę mutacji mtDNA na poziomie jednej komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję dr L Bozhilovej za porady dotyczące analizy statystycznej danych PCR dotyczących generowania kropel. Dziękuję dr H Zhang za dostarczenie oocytów używanych do generowania danych w <silna klasa="xfig">Rysunek 3C; i <silna klasa="xfig">Rysunek 4B. Praca ta została przeprowadzona przez SPB w Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9) Uniwersytetu Cambridge i sfinansowana przez Wellcome Trust Principal Research Fellowship organizowane przez PFC (212219/Z/18/Z).

<ol><li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome%3A+structure%2C+transcription%2C+translation+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li>
<li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription%2C+mass+and+respiratory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li>
<li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy%3A+implications+for+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li>
<li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--%3EG%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146(2013).</li>
<li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells%3A+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li>
<li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA%28Lys%29+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+%28MERRF%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA%3A+age%2C+fiber+type%2C+and+mutation-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li>
<li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li>
<li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li>
<li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li>
<li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li>
<li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li>
<li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186(2016).</li>
<li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li>
<li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G%26T-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li>
<li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li>
<li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li>
<li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+Technology+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li>
<li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative%2C+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).</li>
</ol>

Brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do szerokiego zakresu typów i gatunków komórek, oprócz tych omówionych powyżej, chociaż staranna optymalizacja nowych projektów testów będzie kluczowa, aby zapewnić utrzymanie dokładności i powtarzalności metody przy odchodzeniu od wcześniej zwalidowanych kombinacji starter/sonda. Podczas pracy z pojedynczymi komórkami ważne jest, aby upewnić się, że pobieranie próbek odbywa się tak dokładnie, jak to możliwe (np. przy użyciu rygorystycznych parametrów pojedynczych komórek podczas so...

Mitochondrialne (mt)DNA ssaków to mały (ok. 16,5 Kb), kolisty genom DNA znajdujący się w macierzy mitochondrialnej, który koduje 37 genów, w tym dwa rRNA, 22 tRNA i 13 genów kodujących białka1. W przeciwieństwie do genomu jądrowego, który zawiera jedną (haploidalną) lub dwie (diploidalne) kopie każdego genu na komórkę, mtDNA jest obecne w wielu kopiach w mitochondriach każdej komórki, od dziesiątek kopii (np. dojrzałych spermatocytów) do setek tysięcy kopii (np. oocytów)2,3. Konsekwencją tej wielokopijnej natury jest to, że mutacje w genomie mtDNA, które mogą istnieć jako polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP), delecje lub duplikacje, mogą być obecne na różnych poziomach w każdej komórce, stanowiąc od 0% do 100% całkowitej populacji mtDNA komórki. Istnienie dzikich i zmutowanych genomów mtDNA w tej samej komórce określa się mianem heteroplazmii, a patogenne heteroplazmatyczne mutacje mtDNA są główną przyczyną chorób mitochondrialnych, z kilkoma powszechnymi zespołami neurologicznymi związanymi z leżącymi u podstaw heteroplazmatycznymi mutacjami mtDNA<klasa sup = 'xref'>4.
Dwa kluczowe parametry, które wpływają na prawdopodobieństwo wystąpienia heteroplazmatycznej mutacji mtDNA powodującej chorobę kliniczną, to poziom heteroplazmii i liczba kopii mtDNA. Wiele mutacji heteroplazmatycznych wykazuje efekt progowy, przy czym fenotypy biochemiczne i kliniczne stają się widoczne dopiero powyżej pewnego poziomu heteroplazmii, zwykle około 80%5, a następnie pogarszają się wraz z dalszym wzrostem heteroplazmii4. Jednak ważne jest również, aby wziąć pod uwagę liczbę kopii mtDNA obecnych w komórce, ponieważ wpłynie to na liczbę genomów mtDNA typu dzikiego (tj. "zdrowych"), które są obecne na danym poziomie heteroplazmii. Badania na pacjentach z chorobami mitochondrialnymi podkreśliły znaczenie tej interakcji między heteroplazmią a liczbą kopii5,6, a Filograna i wsp. niedawno zgłosili wzrost liczby kopii mtDNA łagodzący objawy pomimo niezmienionej heteroplazmii w mysim modelu choroby mitochondrialnej7.
Chociaż wiele zostało zrobione w ostatnich latach, aby poprawić zrozumienie patogenezy i przenoszenia chorób spowodowanych przez heteroplazmię mtDNA, większość tych prac została przeprowadzona na poziomie tkanek, a nie komórek, porównując średnie poziomy heteroplazmii tkanek i pomiary liczby kopii uzyskane z masowych biopsji tkanek i próbek krwi. Niektóre dobrze znane techniki, takie jak mikrodysekcja wychwytu laserowego, pozwalają na takie pomiary na poziomie komórkowym8,9; jednak niedawna eksplozja wysokoprzepustowych metod analizy pojedynczych komórek, czyli tak zwanej "omiki pojedynczej komórki"10, stworzyła zapotrzebowanie na metody, które mogą dokładnie mierzyć te kluczowe parametry mtDNA na poziomie pojedynczej komórki.
Metoda PCR generowania kropelek wykorzystuje najnowsze osiągnięcia w technologii mikroprzepływowej, aby ulepszyć istniejące metody ilościowego oznaczania nieznanych stężeń DNA poprzez amplifikację PCR specyficznych amplikonów docelowych w próbce DNA11. W przeciwieństwie do qPCR, gdzie próbka DNA jest amplifikowana w pojedynczej reakcji, przy czym względna szybkość akumulacji produktu PCR działa jako odczyt, ta metoda dzieli początkową próbkę na tysiące pojedynczych kropel, dzieląc w ten sposób cząsteczki DNA próbki na przestrzennie oddzielne reakcje12. Następująca po sobie reakcja PCR przebiega w każdej pojedynczej kropelce, przy czym produkt PCR gromadzi się tylko w kropelkach zawierających docelowe DNA. Wynikiem tej reakcji jest cyfrowy sygnał wyjściowy w postaci puli kropel, które albo zawierają kopię docelowego DNA i amplifikowanego produktu PCR, albo nie zawierają docelowego DNA. Za pomocą fluorescencyjnych sond DNA lub dwuniciowego barwnika wiążącego DNA (ds)DNA, kropelki zawierające amplifikowany produkt można policzyć, a stosunek kropel "dodatnich" do "ujemnych" można wykorzystać do obliczenia bezwzględnej liczby kopii DNA, które były obecne w próbce początkowej. Ten bezwzględny pomiar, w przeciwieństwie do względnego pomiaru uzyskanego z reakcji qPCR, jest kluczowym czynnikiem, który pozwala na zastosowanie tej metodologii do dokładnego pomiaru liczby kopii mtDNA i heteroplazmii w pojedynczych komórkach11, a kilka ostatnich badań wykorzystało już w tym celu technologię PCR do generowania kropel13,14. W artykule przedstawiono metodę pomiaru liczby kopii mtDNA i heteroplazmii delecji w pojedynczych komórkach zarówno z tkanki ludzkiej, jak i mysjej.

<table><tbody><tr><td>50% roztwór Tween-20</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany olej generujący kropelki&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864110</td><td>Komercyjny preparat olejowy stosowany do wytwarzania emulsji olejowo-kropelkowej (stosowany w kroku 4.1 protokołu)</td></tr> <tr><td>Maszyna do PCR C1000 z blokiem głębokiej studni</td><td>Bio Rad</td><td>1851197</td><td>termocykler PCR wyposażony w blok grzewczy do głębokiej studni, używany do lizy komórek (krok protokołu 2.1.2.) i cyklu PCR (krok protokołu 5)</td></tr> <tr><td>Blok chłodzący płytkę zbiorczą</td><td>Bio Rad</td><td>12002819</td><td>Blok chłodzący, który utrzymuje próbki w stanie schładzonym podczas generowania kropel (używany w kroku 4.3 protokołu)</td></tr><tr><td>płytki 96-dołkowe ddPCR&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>96-dołkowe końcówki do pipet przeznaczone do stosowania w generatorze kropel QX200 AutoDG, służące do przygotowania próbek (krok 3.4 protokołu) i pobierania kropelek (krok protokołu 4.3)</td></tr><tr><td>olej do czytnika kropelek ddPCR&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>Komercyjna formulacja olejowa używana przez czytnik kropelek (używany w kroku 6.1 protokołu)</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)</td><td>Bio Rad</td><td>1863023</td><td>Komercyjny supermiks do stosowania w eksperymentach ddPCR z wykorzystaniem sond (używany w Kroku 3.3 protokołu)</td></tr><tr><td>Wkłady z automatycznym generatorem kropel DG32&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864108</td><td>Wkłady mikroprzepływowe stosowane w generatorze kropelkowym QX200 AutoDG do generowania emulsji olejowo-kropelkowej (stosowane w kroku 4.3 protokołu 4.3)</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Kwalifikowana płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Pokrywy płytek foliowych&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>Foliowe osłony płytek używane do uszczelniania płytek zbierających kropelki po wytworzeniu kropel (stosowane w kroku 4.6 protokołu)</td></tr><tr><td>Komórki HEK 293T</td><td>Takara</td><td>632180</td><td>Komercyjny subklon transformowanej ludzkiej embrionalnej linii komórek nerkowych, HEK 293, wyrażający antygen SV40 Large-T</td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>Ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy</td></tr><tr><td>Wysoki poziom glukozy DMEM</td><td>Gibco</td><td>13345364</td><td>4,5 g/l D-glukozy, z L-glutaminą i pirogronianem sodu</td></tr><tr><td>Ludzkie cybrydy</td><td>University of Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysie fibroblasty embrionalne&nbsp;</td><td>Uniwersytet w Newcastle</td><td>Uwiecznione na myszach</td><td></td>C57Bl/6</tr><tr><td>Woda bez nukleaz</td><td>Uszczelki</td> płytkowe PCR Ambion <td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pierce</td><td>SP-0027</td><td>Przezroczyste uszczelki samoprzylepne, używane tylko do wytwarzania kropli przed kroplami (w kroku 4.6 należy użyć uszczelki foliowej)</td></tr><tr><td>Kosze na śmieci z końcówką do pipet</td><td>Bio Rad</td><td>1864125</td><td>Jednorazowy pojemnik na śmieci służący do zbierania wyrzuconych końcówek w generatorze kropel QX200 AutoDG (użyty w kroku 4.3 protokołu</td></tr><tr><td>)Końcówki do pipet do systemu AutoDG&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864120</td><td>Filtrowane końcówki do pipet przeznaczone do użytku w generatorze kropel QX200 AutoDG (używanym w kroku 4.3 protokołu)</td></tr><tr><td>Pierwotne ludzkie komórki fibroblastów skórnych</td><td>Newcastle Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Startery/sondy</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Dokładne sekwencje startera/sondy będą zależne od testu. Startery i sondy użyte w tym badaniu podano w tabeli 1</td></tr> Roztwór <tr><td>proteinazy K 20 mg/ml</td><td>Zgrzewarka</td> do płytek PCR Ambion <td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1</td> Bio <td>Rad</td><td>1814000</td><td>Nakłada uszczelki foliowe na płytki próbek ddPCR po wytworzeniu kropelki (używane w kroku protokołu 4.6)</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie QX Manager</td><td>Bio Rad</td><td>12012172</td><td>Oprogramowanie do konfiguracji i analizy czytnika kropel (używane w krokach protokołu 6 i 7)</td></tr><tr><td>Generator kropel QX200 AutoDG</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>Automatyczny generator kropel mikroprzepływowych (używany w Kroku 4 Protokołu)</td></tr> <tr><td>Czytnik kropel QX200</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>Czytnik kropel (używany w Kroku 6 Protokołu)</td></tr> <tr><td>Wstępnie ustawione kryształy Trizma pH 8,3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego dna pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Mitochondrialne (mt)DNA ssaków to mała, okrągła, dwuniciowa, wewnątrzmitochondrialna cząsteczka DNA, kodująca 13 podjednostek łańcucha transportu elektronów. W przeciwieństwie do diploidalnego genomu jądrowego, większość komórek zawiera znacznie więcej kopii mtDNA, od mniej niż 100 do ponad 200 000 kopii w zależności od typu komórki. Liczba kopii mtDNA jest coraz częściej wykorzystywana jako biomarker wielu stanów zwyrodnieniowych i chorób związanych z wiekiem, a zatem dokładny pomiar liczby kopii mtDNA staje się kluczowym narzędziem zarówno w badaniach, jak i diagnostyce. Mutacje w mtDNA, często występujące jako polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) lub delecje, mogą występować we wszystkich kopiach mtDNA w komórce (tzw. homoplazmia) lub jako mieszanina zmutowanych kopii mtDNA i WT (określanych jako heteroplazmia). Heteroplazmatyczne mutacje mtDNA są główną przyczyną klinicznej patologii mitochondriów, zarówno w rzadkich chorobach, jak i w rosnącej liczbie powszechnych chorób o późnym początku, takich jak choroba Parkinsona. Określenie poziomu heteroplazmii obecnej w komórkach jest kluczowym krokiem w diagnostyce rzadkich chorób mitochondrialnych oraz w badaniach mających na celu zrozumienie powszechnych zaburzeń o późnym początku, w których mitochondria mogą odgrywać rolę. Liczba kopii MtDNA i heteroplazmia są tradycyjnie mierzone za pomocą ilościowych testów opartych na (q)PCR lub głębokiego sekwencjonowania. Jednak niedawne wprowadzenie technologii ddPCR zapewniło alternatywną metodę pomiaru obu parametrów. Oferuje kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, w tym możliwość pomiaru bezwzględnej liczby kopii mtDNA i wystarczającą czułość, aby dokonywać dokładnych pomiarów z pojedynczych komórek nawet przy niskiej liczbie kopii. Przedstawiono szczegółowy protokół opisujący pomiar liczby kopii mtDNA w pojedynczych komórkach za pomocą ddPCR, zwany odtąd PCR z generacją kropelkową, z możliwością jednoczesnego pomiaru heteroplazmii w komórkach z delecjami mtDNA. Omówiono również możliwość rozszerzenia tej metody o pomiar heteroplazmii w komórkach z SNP mtDNA.

Po wygenerowaniu kropelek w każdej studience widoczna jest wyraźna warstwa nieprzezroczystych kropelek unoszących się na powierzchni fazy olejowej (Ryc. 1B). Formowanie kropelek może być negatywnie wpływać przez obecność detergentów w lizacie wejściowym podczas przeprowadzania eksperymentów na pojedynczych komórkach. Stosując protokół lizy opisany w sekcji 2.1.2., rutynowo uzyskuje się wydajność kropelek przekraczającą zalecany poziom 10 000, mimo obecności niewielkiej ilości pozostałego TWE...

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Protokół ten może być wykorzystany do dokładnego pomiaru liczby kopii mitochondrialnego DNA obecnego w poszczególnych komórkach oraz poziomu niektórych typów mutacji mitochondrialnego DNA. Poprzednie metody pozwalały na dokładne wykonanie tych pomiarów w próbkach tkanek zawierających wiele komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wykonać te same pomiary w pojedynczych komórkach.Metoda ta jest szczególnie przydatna dla osób zajmujących się badaniem mitochondriów i będzie miała szerokie zastosowanie w tej dziedzinie. Skuteczna izolacja i liza pojedynczych komórek jest kluczem do tej techniki. Wcześniejsze doświadczenia z sortowaniem pojedynczych komórek byłyby bardzo pomocne.Na początek należy przygotować mieszankę wzorcową do PCR bez próbki DNA na lodzie, zgodnie z opisem w tekście. Po krótkim wirowaniu rozprowadzić wymaganą objętość przygotowanej mieszanki wzorcowej do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR z generacją kropelkową, układając próbki w pełnych kolumnach. Następnie dodaj mieszankę wzorcową do dowolnej pustej studzienki w niekompletnych kolumnach, aby użyć ich jako kontrolek innych niż szablon.Następnie dodaj wejściowe DNA do każdej studzienki, aby całkowita objętość każdej studzienki wynosiła 22 mikrolitry. Uszczelnij płytkę samoprzylepną uszczelką płytową i umieść ją na wytrząsarce z prędkością 2000 obr./min na jedną minutę. Następnie odwiruj płytkę w temperaturze 1000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed umieszczeniem jej na lodzie.W przypadku wytwarzania kropel najpierw upewnij się, że generator kropel jest włączony i sprawdź, czy butelka oleju wytwarzającego kropelki jest załadowana do pozycji E zestawu instrumentów. Następnie kliknij przycisk Konfiguruj płytkę próbkową na ekranie dotykowym. Po wybraniu wszystkich kolumn na płytce próbki zawierających próbki lub ślepe próby, kliknij przycisk OK, aby potwierdzić konfigurację płytki.Następnie załaduj wkłady generatora kropel do pozycji B na pokładzie instrumentu, tak aby wszystkie kontrolki zmieniły kolor na zielony i umieść puste koryto na odpady z końcówką w pozycji C. Następnie załaduj pojemniki na końcówki filtrów ze zdjętymi pokrywkami do pozycji D na instrumencie stage, tak aby wszystkie kontrolki zmieniły kolor na zielony. Następnie usuń uszczelkę samoprzylepną przed załadowaniem płytki próbki do pozycji F zestawu przyrządów, tak aby lampka zmieniła kolor na zielony. Załaduj również pustą 96-dołkową płytkę do zbierania kropelek umieszczoną w chłodnym bloku, wstępnie schłodzonym w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, w pozycji G, tak aby światło zmieniło kolor na zielony.Kliknij przycisk Rozpocznij generowanie kropel na ekranie dotykowym przyrządu, a pokrywa generatora kropel zamknie się automatycznie. Po zakończeniu generowania kropel należy sprawdzić wzrokowo płytkę do pobierania próbki, aby potwierdzić, że nad fazą olejową w każdym studzience znajduje się warstwa emulsji kropelkowej. Następnie włącz zgrzewarkę do płyt i ustaw temperaturę na 180 stopni Celsjusza, a czas zgrzewania na pięć sekund.Poczekaj, aż maszyna osiągnie temperaturę roboczą. Następnie umieść płytkę do pobierania próbek na uchwycie płytki zgrzewarki do płytek i umieść świeżą folię uszczelniającą na górze płytki czerwoną linią skierowaną do góry. Gdy zgrzewarka do płyt osiągnie temperaturę roboczą, naciśnij przycisk wysuwania na ekranie dotykowym przyrządu.Po umieszczeniu uchwytu na talerz w szufladzie zgrzewarki do płyt, naciśnij uszczelkę, aby zamknąć szufladę. Po zakończeniu zgrzewania szuflada otworzy się automatycznie. Zdejmij uszczelnioną płytkę i umieść ją na zimnym bloku.Następnie wyłącz zgrzewarkę do płyt. Aby przeprowadzić PCR, umieść zapieczętowaną płytkę do zbierania kropelek w maszynie do PCR z blokiem głębokiej 96. Po zakończeniu PCR włącz czytnik kropel i podłączony komputer.Załaduj płytkę z próbkami po PCR do uchwytu płytki czytnika kropel. Trzymając foliową pokrywkę na płytce próbki, umieść pokrywę na górze uchwytu i zabezpiecz ją czarnymi klipsami blokującymi. Następnie, aby otworzyć pokrywę czytnika kropel, naciśnij przycisk otwierania/zamykania.Następnie załaduj uchwyt płytki czytnika kropel wraz z płytką próbki do komory czytnika i umieść go bezpiecznie na podstawie magnetycznej. Naciśnij ponownie przycisk otwierania/zamykania, aby zamknąć pokrywę. Otwórz interfejs oprogramowania analitycznego.Wybierz kartę Dodaj blachę, kliknij przycisk Dodaj blachę, a następnie Konfiguruj blachę. Na karcie Informacje o płycie wprowadź nazwę płytki, wybierz opcję Supermix dla sond, Brak DUTP z menu rozwijanego Supermix i wprowadź nazwę pliku w polu Zapisz plik danych As.In karcie Wybór studni zaznacz studnie do analizy i kliknij przycisk Uwzględnij wybrane studnie. Następnie w zakładce Informacje o studni wybierz studnie, które mają zostać oznaczone.Wybierz opcję Bezpośrednia kwantyfikacja z menu rozwijanego Typ eksperymentu. Następnie wypełnij pola opisu próbki, typu próbki i nazwy celu, a następnie dodaj notatki dotyczące studni i/lub notatki dotyczące tablicy zgodnie z wymaganiami. Następnie kliknij przycisk Zastosuj.Po zakończeniu konfiguracji blachy kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie. W celu analizy wyników wybierz kartę Analiza danych i otwórz plik do analizy z menu Moje pliki danych. Następnie kliknij kartę Amplituda 1D w przypadku eksperymentów jednokolorowych lub kartę Amplituda 2D w przypadku eksperymentów dwukolorowych.Następnie wybierz studnie, które wymagają progowania. Użyj narzędzia Tryb linii progowej, aby ręcznie zastosować próg w wolnej przestrzeni między dodatnimi i ujemnymi populacjami na wykresie amplitudy, upewniając się, że krzyż nitkowy jest umieszczony w taki sposób, aby cztery populacje kropel były wyraźnie oddzielone. Po zastosowaniu progu dla wszystkich próbek, wyeksportuj wyniki jako plik csv do dalszej analizy, klikając kartę Tabela danych, Import/Eksport i wybierając opcję Eksportuj widoczne dane do pliku CSV.Wprowadź odpowiednią nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz. Procedury PCR i odczytu kropelek zastosowane w tym protokole wykazały obecność wyraźnie oddzielonych populacji dodatnich i ujemnych kropel, zarówno w kanale fam, jak i sześciokątnym. Populacje mitochondrialnego DNA dodatnie dla obu sond można było również odróżnić od lizatów jednokomórkowych.Metoda ta wykazała również, że w przypadku próbek z delecjami w mitochondrialnym DNA obecna jest mieszana populacja podwójnie dodatnich kropelek i kropelek dodatnich tylko dla nieusuniętej części DNA. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do zliczenia liczby kopii mitochondrialnego DNA na komórkę w różnych komórkach ssaków, w tym oocytach myszy i pierwotnych komórkach embrionalnych myszy. Co więcej, w komórkach z wysoką heteroplazmią delecji stwierdzono, że populacja dodatnia dla pojedynczej sondy była znacznie większa niż populacja podwójnie dodatnia.Jednak w komórkach z heteroplazmią o niskiej delecji obie populacje były podobnej wielkości. Dzięki temu dokładne wyniki zawsze gwarantują, że generowanie kropel zakończyło się sukcesem i że progowanie zostało odpowiednio zastosowane przy użyciu widoku amplitudy 1D lub 2D. Niewykorzystany lizat można wykorzystać do innych testów jednokomórkowych, takich jak pirosekwencjonowanie, które może mierzyć heteromorfizm polimorfizmu pojedynczego nukleotydu.Opracowanie tej techniki pozwoliło nam na dokładne pomiary liczby kopii mitochondrialnego DNA oraz heteroplazmii delecji w poszczególnych komórkach, co wcześniej nie było możliwe.

measuring-single-cell-mitochondrial-dna-copy-number-heteroplasmy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Ten film demonstruje technikę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej multipleksowej do jednoczesnej kwantyfikacji regionów metylowanego DNA w różnych populacjach białych krwinek jako wczesnego biomarkera dla diagnozy klinicznej i prognozowania.

Reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej Multiplex w celu wykrycia metylacji DNA w leukocytach

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Tutaj opisujemy metodę umożliwiającą jednoczesne ilościowe oznaczanie i mapowanie całego genomu rybonukleotydów w wysoce nienaruszonym DNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu, łącząc enzymatyczne rozszczepienie genomowego DNA z jego alkaliczną hydrolizą i późniejszym sekwencjonowaniem 5'-końca.

Jednoczesne mapowanie i oznaczanie ilościowe rybonukleotydów w ludzkim mitochondrialnym DNA

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający dokładne ilościowe określenie metylacji mitochondrialnego DNA (mtDNA). W tym protokole opisujemy enzymatyczne trawienie DNA za pomocą BamHI w połączeniu z procesem analizy bioinformatycznej, który można wykorzystać do uniknięcia przeszacowania poziomów metylacji mtDNA spowodowanych drugorzędową strukturą mtDNA.

Metodologia dokładnego wykrywania metylacji mitochondrialnego DNA

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Testy pirosekwencjonowania umożliwiają solidne i szybkie genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu mitochondrialnego DNA w heteroplazmatycznych komórkach lub tkankach.

Genotypowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genomie mitochondrialnym metodą pirosekwencjonowania

Opisano procedurę badania dynamiki metabolizmu mitochondrialnego DNA (mtDNA) w komórkach przy użyciu formatu wielodołkowej płytki i automatycznego obrazowania immunofluorescencyjnego w celu wykrycia i ilościowego określenia syntezy i dystrybucji mtDNA. Można to dalej wykorzystać do zbadania wpływu różnych inhibitorów, stresów komórkowych i wyciszania genów na metabolizm mtDNA.

Wysokoprzepustowa, obrazowa kwantyfikacja syntezy i dystrybucji mitochondrialnego DNA

Badanie to przedstawia metodę szybkiego ddPCR do ilościowego określania biomasy mikroorganizmów glebowych oraz stosunków grzybów do bakterii. Chociaż węgiel biomasy mikroorganizmów pochodzącej z ddPCR wykazuje jedynie słabą korelację z szacunkami fumigacji chloroformów, metoda ta zapewnia wrażliwe, skalowalne podejście molekularne do oceny liczebności mikroorganizmów bez dodatkowych próbek gleby czy stosowania silnych chemikaliów.

Określenie biomasy mikroorganizmów w glebie za pomocą cyfrowego PCR kroplowego (ddPCR)

Poznaj cyfrową reakcję łańcuchową polimerazy kropelkową do pomiaru liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA w pojedynczych komórkach. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę mutacji mtDNA na poziomie jednej komórki.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Przeglądaj więcej filmów