Name: Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę hodowli iAT2 w sferach 3D oraz w warunkach granicy faz powietrze-ciecz. Technika ta umożliwia badanie biologii płuc w kontekście homeostazy i chorób, w tym wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na nabłonek pęcherzykowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy członkom laboratoriów Wilson, Kotton i Hawkins za ich pomocne dyskusje. Jesteśmy również bardzo wdzięczni Gregowi Millerowi (CReM Laboratory Manager) i Marianne James (iPSC Core Manager) za ich nieocenione wsparcie. Dziękujemy Brianowi Tiltonowi i BUMC Flow Cytometry Core za ich pomoc techniczną w sortowaniu komórek (wspieraną przez grant NIH #1S10OD021587-01A1). Praca ta była wspierana przez stypendium CJ Martin Early Career Fellowship z Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych przyznane RBW; Dotacja NIH F30HL147426 dla KMA; Nagroda I.M. Rosenzweig dla Młodszego Badacza przyznana przez The Pulmonary Fibrosis Foundation oraz Nagroda Integrated Pilot Grant Award przyznana przez Boston University Clinical & Translational Science Institute (1UL1TR001430) dla KDA; Szwajcarska Narodowa Fundacja Nauki (P2ELP3_191217) do ABA; NIH przyznaje DNK U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 i R01HL095993; oraz granty NIH U01TR001810, R01DK101510 i R01DK117940 przyznane AAW; Utrzymanie, bankowość i udostępnianie iPSC są wspierane przez grant NIH NO1 75N92020C00005. Rysunek 1 został utworzony przy użyciu Biorender.com.

Wszystkie eksperymenty polegające na różnicowaniu ludzkich linii iPSC zostały przeprowadzone zgodnie z Institutional Review Board of Boston University (protokół H33122). Fibroblasty skórne, pozyskane w celu przeprogramowania na iPSC, zostały pozyskane od dawcy za pisemną świadomą zgodą, za zgodą Biura Ochrony Badań Naukowych nad Ludźmi Washington University School of Medicine, St. Louis, MO. Przeprogramowane iPSC zostały wygenerowane w Centrum Medycyny Regeneracyjnej na Uniwersytecie Bostońskim i Boston Medical Center w Bostonie.
1. Dysocjacja pęcherzyków płucnych
<ol>
	<li>Przygotować kompletne pożywki różnicujące bez surowicy (cSFDM) zgodnie ze składem podanym w Tabeli 1.</li>
	<li>Przygotuj nośniki CK + DCI w przygotowanej bazie cSFDM zgodnie z tabelą 2.</li>
	<li>Rozmrozić matrycę 2D (zakwalifikowaną do przeszczepu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych) i/lub 3D (o obniżonym współczynniku wzrostu) na lodzie, zgodnie z wymaganiami dla potrzeb doświadczalnych.</li>
	<li>Odessać całe podłoże CK + DCI za pomocą pipety lub pipety aspirującej z próżnią z kropelek matrycy 3D zawierających pęcherzyki pęcherzykowe, pochodzących z ukierunkowanego różnicowania19, w płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml dypazy (2 mg/ml) na kroplę. Delikatnie odpipetować kroplę do kropli za pomocą pipety P1000. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, pipetując raz w górę i w dół po 30 minutach.</li>
	<li>Przenieść zdysocjowane organoidy (z kroku 1.5) z jednej kropli matrycy w dypazie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Do umycia dodaj 10 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant za pomocą pipety lub pipety aspiracyjnej z podciśnieniem, pozostawiając jak najmniej supernatantu. 
	UWAGA: Ważne jest, aby usunąć całą dyspazę, ponieważ pozostała dypaza może rozpuścić matrycę, do której następnie zostaną zasiane komórki. Jeśli nad osadem widoczne jest wyraźne zamglenie, oznacza to, że dypaza nie rozpuściła całkowicie matrycy i można dodać więcej dypazy do osadu przez kolejne 20-30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 0,05% trypsyny na kroplę i przenieść z powrotem na płytkę 12-dołkową. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-15 min. Obserwuj dysocjację pod mikroskopem. Na tym etapie należy unikać nadmiernego pipetowania komórek. 
	UWAGA: Pod koniec inkubacji komórki muszą uzyskać zawiesinę jednokomórkową po 3-5 krotnym pipetowaniu pipetą P1000. W przypadku pasażowania iAT2 do ALI (krok 3) czas trypsynizacji musi być zminimalizowany (maksymalnie 12 minut), tak aby komórki były w skupiskach 2-3-komórkowych, a nie w zawiesinie pojedynczej komórki, gdy są gotowe do posiewu na wkładce do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Zatrzymaj działanie trypsyny za pomocą równej objętości pożywki zawierającej FBS (10% FBS kwalifikowany przez ES w DMEM). Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki 10 ml IMDM. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości do zliczenia, a następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Z jednej zlewającej się kropli matrycy o objętości 50 μl wysianej w 400 komórkach/μl, oczekiwana wydajność wynosi od 500 000 do 1,5 x 106 komórek na kroplę.</li>
	<li>Zawiesinę jednokomórkową komórek iAT2 należy wykorzystać do wytworzenia pęcherzyków płucnych poprzez posiew w matrycy 3D (krok 2) i/lub posiew na wkładkach do hodowli komórkowych w celu hodowli ALI (krok 3).</li>
</ol>
2. 3D poszycie iAT2s
<ol>
	<li>Po zliczeniu (Krok 1.11) określ liczbę pożądanych komórek do ponownego platerowania w matrycy 3D (400 komórek/μl matrycy z 50-100 μl kropelek matrycy 3D na dołek 12-dołkowej płytki). Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w macierzy 3D. Zawiesić szybko i na lodzie, jeśli to konieczne, aby zapobiec polimeryzacji matrycy (która następuje, gdy jest ciepła).</li>
	<li>Użyj pipety P200, aby dozować jedną kroplę matrycy 3D na dołek do wstępnie podgrzanej 12-dołkowej płytki. Ostrożnie pipetować, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w kropli matrycy. Nie dopuścić do osadzenia się zawiesiny komórek podczas dozowania wielu kropel.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 20-30 minut, aby umożliwić polimeryzację kropelek matrycy.</li>
	<li>Dodać 1 ml CK + DCI + 10 μM pożywki Y-27632 (patrz tabela materiałów) do studzienki, aby przykryć kroplę matrycy.</li>
	<li>Po 72 godzinach zmień medium na CK + DCI bez 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Wymieniaj pożywkę na nową CK + DCI co 48-72 godz. 
	UWAGA: IAT2 zazwyczaj będą musiały być pasażowane mniej więcej co 10-14 dni, w zależności od linii komórkowej i gęstości posiewu.</li>
</ol>
3. Przejście iAT2s do ALI
<ol>
	<li>Przygotować świeżo powleczone wkładki do hodowli komórkowych o średnicy 6,5 mm na 1 godzinę przed użyciem, rozcieńczając matrycę 2D w zmodyfikowanej pożywce Eagle F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco do roztworu roboczego zgodnie z instrukcjami producenta dla matrycy 2D (patrz tabela materiałów). Następnie dodać 100 μl rozcieńczonej matrycy na 6,5 mm wkładkę do hodowli komórkowej. Pozostawić matrycę do polimeryzacji w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 30 minut lub w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odessać nadmiar matrycy z wkładek do hodowli komórkowych za pomocą pipety lub pipety aspiracyjnej z próżnią i przepłukać raz DMEM/F12. Odessać to płukanie bezpośrednio przed dodaniem komórek.</li>
	<li>Po zliczeniu określ liczbę komórek wymaganych do zasiania żądanej liczby komórek we wkładkach hodowlanych (520 000 żywych komórek/cm2, co odpowiada 172 000 żywych komórek na wkładkę do hodowli komórkowej o średnicy 6,5 mm). Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć jak najwięcej supernatantu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości do wysiewu 100 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 na wkładkę do hodowli komórkowej (zawiesina komórek powinna wynosić 1,720 komórek/μL). Dodać 100 μl do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej. Delikatnie poruszyć płytkę w układzie krzyżowym, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek w poprzek wkładki do hodowli komórkowej i potwierdź to, sprawdzając pod mikroskopem przy 4x obiektywie. 
	UWAGA: Gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie i może wymagać optymalizacji, w zakresie od 160 000 do 300 000 komórek na wkładkę do hodowli komórkowej 6,5 mm. Barwnik przepuszczalny dla komórek w kolorze kalceinowym (patrz Tabela materiałów) może być dodany do komórek i oglądany pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym w celu wizualizacji komórek po wysianiu.</li>
	<li>Dodać 500 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 do podstawno-bocznego przedziału każdej wkładki do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Odessać wierzchołkowy CK + DCI + 10 μM pożywki Y-27632 48 godzin po wysiewie za pomocą pipety zainicjować ALI (znany jako "air-lift"). 
	UWAGA: W tym momencie komórki powinny być w 100% zlewne. Jeśli komórki nie są w 100% zlewne, kroki 3.7-3.8 należy nadal wykonywać we wskazanych punktach czasowych; Tworzenie się zlewających się monowarstw komórek może trwać dłużej.</li>
	<li>Zmień podstawno-boczne CK + DCI + 10 μM podłoża Y-27632 po 72 godzinach na CK + DCI bez 10 μM Y-27632. 
	UWAGA: Powinien być minimalny, jeśli w ogóle, "wyciek" medium na stronę wierzchołkową. Jeśli jednak zdarzy się to w ciągu pierwszych kilku dni, kontynuuj codzienne zasysanie strony wierzchołkowej, aż nie będzie dalszego wycieku.</li>
	<li>Wymieniaj podłoże podstawno-boczne na świeże CK + DCI co 48-72 godz. 
	UWAGA: iAT2 stosowane w kulturach ALI dojrzewają maksymalnie po 5-14 dniach od posiewu.</li>
	<li>Utrzymuj komórki pod ścisłym nadzorem do 28 dni po posiewie, jeśli to konieczne, w celu bardziej długotrwałych eksperymentów. 
	UWAGA: Widoczne oznaki niepowodzenia ALI, takie jak odklejanie się komórek od krawędzi wkładki lub tworzenie się w monowarstwie, można zaobserwować po zbyt długim czasie w hodowli, w którym to momencie ALI nie nadaje się już do eksperymentów.</li>
</ol>

<ol><li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li>
<li>Mason, R. J., Williams, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+alveolar+cell.+Defender+of+the+alveolus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Type II alveolar cell. Defender of the alveolus.</a> American Review of Respiratory Disease. 115 (6), Pt 2 81-91 (1977).</li>
<li>Nogee, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+surfactant+protein+C+gene+associated+with+familial+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A mutation in the surfactant protein C gene associated with familial interstitial lung disease.</a> New England Journal of Medicine. 344 (8), 573-579 (2001).</li>
<li>Nogee, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+in+the+surfactant+protein+B+gene+responsible+for+fatal+neonatal+respiratory+disease+in+multiple+kindreds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A mutation in the surfactant protein B gene responsible for fatal neonatal respiratory disease in multiple kindreds.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (4), 1860-1863 (1994).</li>
<li>Shulenin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA3+gene+mutations+in+newborns+with+fatal+surfactant+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">ABCA3 gene mutations in newborns with fatal surfactant deficiency.</a> New England Journal of Medicine. 350 (13), 1296-1303 (2004).</li>
<li>Nureki, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mutant+Sftpc+in+murine+alveolar+epithelia+drives+spontaneous+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Expression of mutant Sftpc in murine alveolar epithelia drives spontaneous lung fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 4008-4024 (2018).</li>
<li>Katzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SFTPC+BRICHOS+mutant+links+epithelial+ER+stress+and+spontaneous+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">An SFTPC BRICHOS mutant links epithelial ER stress and spontaneous lung fibrosis.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (6), 126125(2019).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (7), 489-503 (2013).</li>
<li>Purkayastha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+exposure+to+SARS-CoV-2+and+cigarette+Smoke+increases+infection+severity+and+alters+the+stem+cell-derived+airway+repair+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct exposure to SARS-CoV-2 and cigarette Smoke increases infection severity and alters the stem cell-derived airway repair response.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 869-875 (2020).</li>
<li>Matrosovich, M. N., Matrosovich, T. Y., Gray, T., Roberts, N. A., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+avian+influenza+viruses+target+different+cell+types+in+cultures+of+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (13), 4620-4624 (2004).</li>
<li>Tollstadius, B. F., Silva, A. C. G. d, Pedralli, B. C. O., Valadares, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbendazim+induces+death+in+alveolar+epithelial+cells%3A+A+comparison+between+submerged+and+at+the+air-liquid+interface+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Carbendazim induces death in alveolar epithelial cells: A comparison between submerged and at the air-liquid interface cell culture.</a> Toxicology in Vitro. 58, 78-85 (2019).</li>
<li>Winton, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+of+pulmonary+and+non-pulmonary+origin+as+tools+to+study+the+effects+of+house+dust+mite+proteinases+on+the+regulation+of+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">Cell lines of pulmonary and non-pulmonary origin as tools to study the effects of house dust mite proteinases on the regulation of epithelial permeability.</a> Clinical and Experimental Allergy. 28 (10), 1273-1285 (1998).</li>
<li>Kanagaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxypropyl+cyclodextrin+improves+amiodarone-induced+aberrant+lipid+homeostasis+of+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hydroxypropyl cyclodextrin improves amiodarone-induced aberrant lipid homeostasis of alveolar cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 64 (4), 504-514 (2021).</li>
<li>Sucre, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+establishment+of+primary+type+2+alveolar+epithelium+with+3D+organotypic+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Successful establishment of primary type 2 alveolar epithelium with 3D organotypic co-culture.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 158-166 (2018).</li>
<li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+regeneration-associated%2C+transitional+alveolar+epithelial+cell+state+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistence of a regeneration-associated, transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis.</a> Nature Cell Biology. 22, 934-946 (2020).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+signals+induce+AT2+cell-derived+damage-associated+transient+progenitors+that+mediate+alveolar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory signals induce AT2 cell-derived damage-associated transient progenitors that mediate alveolar regeneration.</a> Cell Stem Cell. 27 (3), 366-382 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Katsura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+stem+cell-based+alveolospheres+provide+insights+into+SARS-CoV-2-mediated+interferon+responses+and+pneumocyte+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904 (2020).</li>
<li>Jacob, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+lung+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional lung alveolar epithelial cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 472-488 (2017).</li>
<li>Alysandratos, K. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+iPSCs+carrying+an+SFTPC+mutation+reveal+the+intrinsic+alveolar+epithelial+dysfunction+at+the+inception+of+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Patient-specific iPSCs carrying an SFTPC mutation reveal the intrinsic alveolar epithelial dysfunction at the inception of interstitial lung disease.</a> Cell Reports. 36 (9), 109636(2021).</li>
<li>Hurley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructed+single-cell+fate+trajectories+define+lineage+plasticity+windows+during+differentiation+of+human+PSC-derived+distal+lung+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstructed single-cell fate trajectories define lineage plasticity windows during differentiation of human PSC-derived distal lung progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 593-608 (2020).</li>
<li>Sun, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+human+iPSC-derived+alveolar+epithelial+type+II+cells+revealed+with+ABCA3%2FSFTPC+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in human iPSC-derived alveolar epithelial type II cells revealed with ABCA3/SFTPC reporters.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 65 (4), 442-460 (2021).</li>
<li>Abo, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+alveolar+type+2+cells+mature+and+respond+to+environmental+exposures+in+air-liquid+interface+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived alveolar type 2 cells mature and respond to environmental exposures in air-liquid interface culture.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 7 (6), (2022).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+of+pluripotent+stem+cell-derived+human+lung+alveolar+type+2+cells+elicits+a+rapid+epithelial-intrinsic+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection of pluripotent stem cell-derived human lung alveolar type 2 cells elicits a rapid epithelial-intrinsic inflammatory response.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 962-973 (2020).</li>
<li>Jacob, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+self-renewing+lung+alveolar+epithelial+type+II+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).</li>
<li>Beers, M. F., Moodley, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+an+alveolar+type+2+cell+an+alveolar+type+2+cell%3F+A+conundrum+for+lung+stem+cell+biology+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">When is an alveolar type 2 cell an alveolar type 2 cell? A conundrum for lung stem cell biology and regenerative medicine.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 18-27 (2017).</li>
<li>Alysandratos, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cell+culture+on+the+transcriptomic+programs+of+primary+and+iPSC-derived+human+alveolar+type+2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Impact of cell culture on the transcriptomic programs of primary and iPSC-derived human alveolar type 2 cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

AT2 utrzymują homeostazę płuc, a dysfunkcja tych kluczowych komórek pęcherzyków płucnych może zarówno powodować, jak i wynikać z różnych chorób płuc. Ze względu na trudności w dostępie i izolowaniu pierwotnych ludzkich AT2, generowane są iAT2. Stosując metody ukierunkowanego różnicowania opisane w innym miejscu25 oraz opisaną tutaj ekspansję i zasiewanie komórek, iPSC wygenerowane od dowolnej osoby mogą zostać zróżnicowane w silnie samoodnawiające się iAT2, dostarczając w ten sposób specyficzne dla pacjenta komórki do badań biomedycznych, w tym podstawowych badań biomedycznych, badań rozwojowych, modelowania chorób, terapii komórkowych lub badań przesiewowych leków. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę dysocjacji iAT2 do zawiesiny pojedynczej komórki, którą można następnie ponownie pokryć w 3D Matrigel w celu wygenerowania pęcherzyków do ekspansji komórek lub ponownie platerować w hodowli 2D ALI w celu dalszych eksperymentów.
Protokół składa się z kilku krytycznych etapów, aby zapewnić pomyślne pasażowanie i ponowne powlekanie zarówno w kulturach 3D, jak i ALI. Mechaniczne rozpryskiwanie musi być zminimalizowane, ponieważ nadmierne pipetowanie może zmniejszyć żywotność komórek. Ponadto gęstość wysiewu iAT2 zarówno w kulturach 3D, jak i 2D ALI ma kluczowe znaczenie; w przypadku hodowli 3D, ogólnie rzecz biorąc, 400 komórek/μl 3D Matrigel jest optymalne dla większości linii iPSC. Jednak zakres gęstości od 100 do 500 komórek/μl czasami kończył się sukcesem, a optymalizacja gęstości może być wymagana dla różnych linii komórkowych. W przypadku hodowli ALI optymalizacja gęstości wysiewu iAT2 na wkładkach do hodowli komórkowych jest również niezbędna do uzyskania zlewającej się monowarstwy komórek 48 godzin po wysiewie (tj. w dniu transportu powietrznego). Niektóre linie iAT2 wymagają więcej komórek na wkładkę; Dlatego, jeśli wymagane jest rozwiązywanie problemów, zalecany jest zakres od 160 000 do 300 000 komórek/wkładkę dla 24-dołkowych wkładek do hodowli komórkowych. Kultury 3D można również skalować do płytek 24- i 48-dołkowych, utrzymując gęstość wysiewu na poziomie 400 komórek/μl matrycy 3D i zmniejszając wielkość kropel matrycy odpowiednio do 25 μl i 20 μl. Hodowle ALI można skalować do 96-dołkowych wkładek do hodowli komórkowych poprzez pokrycie każdej wkładki 30 μl matrycy, posiew 80 000 komórek w 30 μl na wkładkę i podawanie 150 μl podłoża podstawno-bocznego na studzienkę. Gęstość wysiewu oraz objętości matrycy i podłoża muszą być odpowiednio skalowane i optymalizowane dla innych formatów płytek.
Ograniczeniem tego protokołu jest to, że komórki używane do posiewu ALI muszą być wystarczająco oczyszczone, aby były NKX2-1+ i SFTPC+19,20,21,23 w celu utworzenia iAT2 ALIs, a tworzenie kultur ALI może się różnić w zależności od linii. Ponadto protokół ten umożliwia ekspansję i generowanie kultur tylko AT2, zapewniając redukcjonistyczny system modelowy oparty na pojedynczym kluczowym typie komórek pęcherzykowych. Co ważne, na tych platformach brakowało innych istotnych typów komórek pęcherzyków płucnych, takich jak komórki pęcherzyków płucnych typu 1. Inne grupy odniosły sukces w hodowli pierwotnych ludzkich AT2 jako sferoidów lub kultur organotypowych z fibroblastamilub bez 1,14,15,16,17; jednak pierwotne ludzkie AT2 mają tendencję do utraty ekspresji kluczowych środków powierzchniowo czynnych, gdy są hodowane w normalnej hodowli 2D bez warunków ALI26. Co więcej, ostatnie prace wykazały, że iAT2 wyrażają wyższe markery proliferacyjne i niższe markery dojrzewania AT2 niż świeże, niehodowane ludzkie pierwotne AT227. Pomimo tych różnic między iAT2 a świeżymi pierwotnymi ludzkimi AT2, stwierdziliśmy, że nawet hodowane pierwotne AT2 wykazywały różnice transkryptomiczne w stosunku do świeżych, niehodowlanych pierwotnych AT227, a zatem wnioskujemy, że te modele in vitro mają różne mocne strony i ograniczenia w modelowaniu biologii płuc in vivo.
Platforma iAT2 może być stosowana do badania mutacji genetycznych z iPSC pochodzących od pacjentów19,20. System można również znacznie rozbudować, aby dostosować go do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Ponadto iAT2 ALI nadają się do narażenia środowiskowego, takiego jak infekcja wirusowa lub bakteryjna lub narażenie na dym papierosowy, opary e-papierosów lub inne aerozole23. Podsumowując, ten protokół do generowania zarówno 3D, jak i 2D kultur ALI iAT2 pozwala na długoterminową hodowlę typu komórek istotnego z punktu widzenia choroby i zapewnia fizjologiczną, skalowalną platformę, która umożliwia wykorzystanie tych komórek w wielu zastosowaniach.

W płucach, drogi oddechowe i komórki nabłonka pęcherzyków płucnych są pierwszymi, które napotykają wdychane ekspozycje środowiskowe, w tym patogeny przenoszone przez wdychane aerozole i szkodliwe bodźce, takie jak dym papierosowy. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 (AT2) są niezbędne do utrzymania homeostazy płuc, ponieważ są fakultatywnymi przodkami dystalnego nabłonka płuc, wytwarzają środki powierzchniowo czynne w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego pęcherzyków płucnych i wywołują wrodzoną odpowiedź immunologiczną na narażenie wziewne1,2. Jednak dysfunkcja AT2 może wynikać z uszkodzeń płuc lub mutacji w genach, które są selektywnie wyrażane w AT2, takich jak SFTPC, SFTPB i ABCA33,4,5. Poprzednie podejścia do badania tych mutacji genetycznych opierały się na modelach mysich6 lub zmodyfikowanych, zawierających mutacje wektorach wprowadzonych do unieśmiertelnionych linii komórkowych7. W związku z tym potrzebne są platformy, które mogą modelować wpływ zaburzeń genetycznych i środowiskowych na AT2 w fizjologicznie odpowiednich typach komórek oraz w produktywnym systemie in vitro, aby lepiej zrozumieć rolę, jaką AT2 odgrywają w zdrowiu i chorobie.
Jeśli chodzi o modelowanie ekspozycji w powietrzu, hodowle komórek nabłonka pierwotnego nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) zostały z powodzeniem wykorzystane do ujawnienia kluczowych reakcji molekularnych na dym papierosowy8 oraz do modelowania infekcji dróg oddechowych9,10. Porównywalny system hodowli ALI dla nabłonka pęcherzyków płucnych, kluczowego miejsca infekcji lub urazu w chorobie, jest znacznie mniej rozwinięty w porównaniu z modelowym systemem nabłonka dróg oddechowych. Unieśmiertelnione linie komórkowe zostały wyhodowane w ALI jako proxy dla nabłonka pęcherzyków płucnych11,12, ale te linie komórkowe są transkryptomicznie różne od pierwotnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych13 i brakuje im kluczowej maszynerii komórkowej, takiej jak zdolność do wydzielania środków powierzchniowo czynnych lub tworzenia ścisłych połączeń w ALI12. Pierwotne ludzkie AT2 mogą być hodowane w sferach 3D w obecności fibroblastów1,14, ale podlegają ograniczeniom, w tym ograniczonemu dostępowi do płuc eksplantatów i ich tendencji do starzenia się lub utraty fenotypu komórkowego w większości dotychczasowych kultur. Cechy te stanowią barierę dla powszechnego przyjęcia pierwotnych badań in vitro AT2, chociaż ostatnio poczyniono postępy w optymalizacji kultur 3D bez karmienia w celu ekspansji pierwotnych AT2s15,16,17,18.
Protokoły ukierunkowanego różnicowania zostały opracowane w celu podsumowania in vivo kamieni milowych rozwoju w celu wygenerowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzących z komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2s)19. IAT2 rosną jako samoodnawiające się kulki w hodowli 3D bez surowicy w zdefiniowanym pożywce zawierającej CHIR99021, KGF, deksametazon, cAMP i 3-izobutylo-1-metyloksantynę (IBMX), określaną jako "CK + DCI"19, w przypadku braku karmników fibroblastów i może być hodowany przez >20 pasaży20,21. Co więcej, iAT2 dzielą program transkryptomiczny z pierwotnymi AT2 dorosłego człowieka, tworzą ciała blaszkowate oraz produkują i pakują surfaktant19,21,22. Protokół ten szczegółowo opisuje szeregowe przechodzenie iAT2 poprzez dysocjację komórek do zawiesiny pojedynczej komórki. W tym momencie iAT2 mogą być ponownie powlekane i dalej rozwijane w kulturze 3D lub powlekane w kulturze 2D ALI 23. Metody te mogą być wykorzystane do badania wewnętrznej biologii AT2 w homeostazie i chorobie20,22 oraz do badania wpływu związków lub bodźców na skalowalnej, fizjologicznie istotnej platformie23,24, jak to zostało wcześniej pokazane.

<table><tbody><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Do</td></tr><tr><td>12-dołkowej płytki do hodowli komórek</td> CKDCI <td>Płytki Corning</td><td>3513</td><td>do hodowli</td></tr><tr><td>1-tioglicerolu (MTG)</td> <td>M6145</td><td>Sigma</td><td>do CKDCI</td></tr><tr><td>2D Matrigel (matryca) - Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC</td><td>Corning</td><td>8774552</td><td>Do powlekania ALI Transwells</td></tr><tr><td>3D Matrigel (matryca) - Wzrost Czynnik o obniżonym współczynniku Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Do uprawy kulek iAT2 w</td></tr><tr><td>soli sodowej 8-bromoadenozyny 30,50-cyklicznego monofosforanu (cAMP)</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td>Dla CKDCI</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>A4544</td><td>Sigma</td><td>Dla CKDCI</td></tr><tr><td>B27 bez kwasu retinowego</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>Dla</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej CKDCI (BSA) (7,5%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15260037</td><td>Dla CKDCI</td></tr><tr><td>Calcein blue</td><td>Life Technologies</td><td>C1429</td><td>Do rozróżniania żywych/martwych w cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Calcein green</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td>Opcjonalna wizualizacja komórek na wkładce do hodowli</td></tr><tr><td>komórkowej Wkładki do hodowli komórkowych - Costar 6,5 mm Clear Transwells z 0,4 i mikro; m wielkość porów</td><td>Transwells Millipore-Sigma</td><td>CLS3470-48EA</td><td>ALI</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>Dla CKDCI</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Do CKDCI</td></tr><tr><td>Dispaza (2 mg / ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>354235</td><td>Do rozpuszczenia matrigelu</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995</td><td>Aby dokonać inaktywacji trypsyny podłoża (10% FBS w DMEM)</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana mieszanka Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>A4192002</td><td>Do płukania</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190</td><td>Do analiz cytometrycznych</td></tr><tr><td>płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (charakteryzowana hyklonem)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td>Do wytwarzania pożywki do inaktywacji trypsyny (10% FBS w DMEM)</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td> Do mieszanki składników odżywczych F-12 <td>szynki CKDCI</td></tr><tr><td>(F12)</td><td>Cellgro</td><td>10-080-CV</td> Do <td></td></tr><tr><td>hemocytometru</td> CKDCI <td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Invivogen&nbsp; Primocin 1 G (50 mg / ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9392943</td><td>Do CKDCI</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Ilbecco's Medium (IMDM) firmy Iscove</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12440053</td><td>Do CKDCI</td></tr><tr><td>Milicell ERS-2 Woltomierz</td><td>Milipore</td><td>MERS00002</td><td>Do pomiaru przeznabłonkowego oporu elektrycznego</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Dla CKDCI</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki KGF</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG-010</td><td>Dla CKDCI</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Dla CKDCI</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>Do zliczania komórek podczas pasażu</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>Aby dysocjować sfery iAT2</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Dodaj do komórek po pasażowaniu</td></tr></tbody></table>

generowanie sfer 3d i kultur 2d granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Generating 3D Spheres and 2D Air-Liquid Interface Cultures of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Type 2 Alveolar Epithelial Cells

W płucach nabłonek pęcherzyków płucnych stanowi fizyczną barierę przed bodźcami środowiskowymi i odgrywa istotną rolę w homeostazie i chorobie. Komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 (AT2) są fakultatywnymi przodkami dystalnego nabłonka płuc. Dysfunkcja i uszkodzenie AT2 mogą wynikać z różnych chorób płuc i przyczyniać się do nich. Lepsze zrozumienie biologii AT2 ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii i chorób płuc; jednak pierwotne ludzkie AT2 są na ogół trudne do wyizolowania i mają ograniczoną podaż. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, za pomocą protokołu ukierunkowanego różnicowania, który podsumowuje rozwój płuc płuc typu 2 pochodzącego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), można wygenerować za pomocą protokołu ukierunkowanego różnicowania, który podsumowuje rozwój płuc in vivo. iAT2 rosną w warunkach wolnych od karmienia, dzielą program transkryptomiczny z dorosłymi pierwotnymi AT2 i wykonują kluczowe funkcje AT2, takie jak produkcja, pakowanie i wydzielanie środka powierzchniowo czynnego. Protokół ten szczegółowo opisuje metody utrzymywania samoodnawiających się iAT2 poprzez szeregowe pasażowanie w kulturze trójwymiarowej (3D) lub adaptację iAT2 do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). Jednokomórkowa zawiesina iAT2 jest generowana przed posiewem w 3D rozpuszczonej matrycy błony podstawnej (zwanej dalej "matrycą"), gdzie samoorganizują się w jednowarstwowe kule nabłonkowe. iAT2 w hodowli 3D mogą być seryjnie dysocjowane na zawiesiny jednokomórkowe, które mają być pasażowane lub posiane w hodowli 2D ALI. W hodowli ALI iAT2 tworzą spolaryzowaną monowarstwę z powierzchnią wierzchołkową wystawioną na działanie powietrza, dzięki czemu platforma ta jest łatwo podatna na ekspozycje środowiskowe. W związku z tym protokół ten generuje niewyczerpany zapas iAT2, wytwarzając ponad 1 x 1030 komórek na komórkę wejściową w ciągu 15 przejść, zachowując program AT2 wskazywany przez wyrażenieSFTPC tdTomato. Uzyskane w ten sposób komórki stanowią powtarzalną i istotną platformę, którą można zastosować do badania mutacji genetycznych, modelowania ekspozycji środowiskowych lub badań przesiewowych leków.

Komórki iAT2 zostały poddane pasażowaniu do zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie wysiane ponownie w macierzy 3D lub w 2D na wkładkach do hodowli komórkowych w celu prowadzenia hodowli ALI (Rycina 1). Po dysocjacji do pojedynczych komórek, iAT2 poddano analizie za pomocą cytometrii przepływowej. W skrócie, komórki zawieszone w 1% płatkowej surowicy bydlęcej (FBS) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z barwnikiem żywotności calcein blue (1:1000) przeanalizowano na cytometrze przepływowym, stosując bramkowanie dla frakcji niebędących fragmentami, singletów oraz tdTomato. Jako przykład przedstawiono tutaj linię SPC2 (klon SPC2-ST-B220), która posiada reporter tdTomato ukierunkowany na endogenny locus SFTPC, co ułatwia wizualizację i śledzenie programu AT2 w czasie trwania hodowli (Rycina 2A). Ekspresja iAT2 SFTPC-tdTomato została utrzymana po ponownym wysianiu w macierzy 3D w formie sfer (Rycina 2B) oraz po wysianiu na wkładkach do hodowli komórkowych (Rycina 2C). Aby określić integralność hodowli ALI, można zmierzyć transepitelialną oporność elektryczną (TEER) (Rycina 2D). Do pomiaru TEER użyto woltomierza (patrz Tabela materiałów), dodając 100 µL medium CK + DCI do komory apikalnej. Wkładki do hodowli komórkowych pokryte Matrigelem bez wysianych komórek potraktowano jako próbki ślepe. Odczyty wykonywano w trzech punktach w każdej studzience.
<img alt="Schemat różnicowania komórek iAT2; hodowla 3D, dysocjacja pojedynczych komórek, proces ALI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63875/63875fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja przebiegu protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63875/63875fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Cytometria przepływowa, mikroskopia i wykres TEER dla analizy i różnicowania hodowli komórek płuc." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63875/63875fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki protokołu. (A) Reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej dla SFTPC-tdTomato w ludzkich komórkach przypominających nabłonek pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2s), pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, hodowanych w 3D. Przedstawiona kontrola negatywna to niepłucny endoderm (CD47lo). (B) Reprezentatywne obrazowanie żywych komórek iAT2s hodowanych w 3D w różnych dniach po pasażowaniu (dpp) (SFTPC-tdTomato, pasek skali = 50 µm). (C) Reprezentatywne obrazowanie żywych komórek iAT2s wysianych na granicy powietrze-ciecz (SFTPC-tdTomato, pasek skali = 500 nm). (D) Reprezentatywny pomiar transepitelialnej oporności elektrycznej iAT2s wysianych na granicy powietrze-ciecz. n = 3, słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63875/63875fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynniki</td>
			<td>Objętość dla 500 ml</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modyfikowane Pożywka Dulbecco Iscove'a (IMDM)</td>
			<td>375 ml</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pożywka Ham's F-12 (F12)</td>
			<td>125 ml</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement B-27 (z kwasem retinowym)</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suplement N-2</td>
			<td>2,5 mL</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (roztwór zapasowy 7,5%)</td>
			<td>3,3 ml</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin (roztwór stokowy 50 mg/mL)</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>100 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (stężenie zapasowe 100x)</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas askorbinowy (roztwór zapasowy 50 mg/ml)</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-tioglicerol (MTG) (z 26 µL w 2 ml IMDM)</td>
			<td>1,5 ml</td>
			<td>4,5 x 10-4 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład kompletnej pożywki do różnicowania bez dodatku surowicy (cSFDM).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>3 µM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhKGF</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deksametazon</td>
			<td>50 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sól sodowa 8-bromoadenozyno-3',5'-cyklicznego monofosforanu (cAMP)</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Składy pożywek CK + DCI.

Obecny protokół opisuje ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki nabłonkowe typu 2 z pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2). Komórki te mogą być hodowane jako samoodnawiające się kulki w hodowli 3D lub przystosowane do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI).

Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

In the lung, the alveolar epithelium is a physical barrier from environmental stimuli and plays an essential role in homeostasis and disease. Type 2 ...

Protokół ten nakreśla metodę hodowli i pasażowania ważnej populacji komórek w płucach i ustanawia fizjologicznie istotną platformę dla ekspozycji środowiskowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania biologii płuc w kontekście homeostazy i choroby. Metoda ta może dostarczyć informacji, zwłaszcza w zakresie chorób płuc wpływających na pęcherzyki płucne, w tym spowodowanych wariantami genetycznymi, narażeniem środowiskowym, czynnikami zakaźnymi lub kombinacją tych czynników.Procedurę zademonstrujemy ja i Rhiannon Werder, wspomagani przez Kristy Abo, doktorantkę i Olivię Hix, kierowniczkę laboratorium z naszych laboratoriów. Najpierw odessać całe podłoże CK DCI z kropelek matrycy 3D zawierających pęcherzyki pęcherzykowe pochodzące z ukierunkowanego różnicowania w płytce 12-dołkowej. Dodaj jeden mililitr dypazy na kroplę.Delikatnie odpipetować kroplę do kropli za pomocą pipety P-1000. Po inkubacji przenieść zdysocjowane organoidy z jednej kropli matrycy w dypazie do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj 10 mililitrów zmodyfikowanej pożywki Dulbecco firmy Iscove i wiruj przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Odessać supernatant tak bardzo, jak to możliwe. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze 0,05% trypsyny na kroplę i przenieść go z powrotem na płytkę 12-dołkową. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 15 minut przed obserwacją dysocjacji pod mikroskopem i unikaj nadmiernego pipetowania komórek.Pod koniec inkubacji uzyskuje się zawiesinę pojedynczej komórki. Zatrzymać działanie trypsyny za pomocą równej objętości płodowej surowicy bydlęcej zawierającej pożywkę, a następnie odwirować przy 300 x g przez pięć minut. Umyj komórki 10 mililitrami IMDM przed następnym wirowaniem.Zawieś komórki w odpowiedniej objętości do liczenia. A następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Generowanie pęcherzyków płucnych poprzez sianie zawiesiny pojedynczych komórek iAT2 w matrycy 3D lub na wkładkach do hodowli komórkowych w celu hodowli na granicy faz powietrze-ciecz.Po zliczeniu komórek określ liczbę pożądanych komórek do odtworzenia w matrycy 3D i odwiruj komórki przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usuń jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety i szybko ponownie zawieś komórki w matrycy 3D. Dozować jedną kroplę matrycy 3D do studzienki wstępnie podgrzanej 12-dołkowej płytki za pomocą pipety P-200 bez tworzenia pęcherzyków w kropli matrycy i bez dopuszczania do osiadania zawiesiny komórek podczas dozowania wielu kropel.Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aby umożliwić polimeryzację kropelek matrycy, a następnie dodaj jeden mililitr CK DCI 10 mikromolowych pożywki Y-27632 na studzienkę, aby przykryć kroplę matrycy. Po 72 godzinach należy zmienić pożywkę na CK DCI bez 10 mikromolowców Y-27632 i zastąpić ją nową CK DCI co 48 do 72 godzin. Na godzinę przed użyciem należy przygotować świeżo pokryte 6,5-milimetrowe wkładki do hodowli komórkowych, rozcieńczając matrycę 2D w zmodyfikowanej pożywce Eagle F-12 firmy Dulbecco do roztworu roboczego.Następnie dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonej matrycy na 6,5 milimetrową wkładkę do hodowli komórkowej. Pozostawić matrycę do polimeryzacji w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut lub w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odessać nadmiar matrycy z wkładek do hodowli komórkowych za pomocą pipety.Opłucz go DMEM F-12 i natychmiast odessaj ten płyn do płukania przed dodaniem komórek. Odwirować komórki przy 300 x g przez pięć minut i usunąć jak najwięcej supernatantu. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości do wysiewu 100 mikrolitrami CK DCI 10 mikromolowych Y-27632 na wkładkę do hodowli komórkowej i dodać 100 mikrolitrów do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej.Delikatnie porusz płytką na krzyż, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek, i sprawdź ją pod mikroskopem przy obiektywie 10X. Dodać 500 mikrolitrów CK DCI 10 mikromolowych Y-27632 do podstawno-bocznego przedziału każdej wkładki do hodowli komórkowej, a 48 godzin po wysiewie odessać wierzchołkową pożywkę za pomocą pipety, aby zainicjować granicę faz powietrze-ciecz. Po 72 godzinach należy zmienić podłoże podstawno-boczne na CK DCI bez 10 mikromolowych Y-27632, a następnie zastąpić podłoże podstawno-boczne świeżym CK DCI co 48 do 72 godzin przez okres do 28 dni po posiewie.Reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej wskazują na łatwość wizualizacji linii SPC2 z reporterem tdTomato ukierunkowanym na endogenne białko powierzchniowo czynne C locus i śledzeniem programu komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 w czasie w hodowli. Ekspresja białka surfaktantu C td, pochodzącego z komórek pęcherzykowych typu 2, pochodzącego z IPSC, została utrzymana po ponownym posianiu w matrycy 3D w postaci kulek i po posieciu na wkładkach do hodowli komórkowych. Przeznabłonkowy opór elektryczny można zmierzyć w celu określenia integralności kultury granicy faz powietrze-ciecz.Podczas próby wykonania tej procedury należy unikać nadmiernej dysocjacji poprzez pipetowanie mechaniczne lub trawienie enzymatyczne, ponieważ może to prowadzić do niskiej żywotności komórek i słabej przeżywalności. Dodatkowymi metodami wykonywanymi po tej procedurze są pomiary przeznabłonkowej oporności elektrycznej na integralność bariery testowej, dodawanie wirusów lub związków w celu stymulacji komórek, immunofluorescencja oraz zbieranie RNA, białka lub supernatantu. Technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania nowych zagadnień związanych z biologią płuc i chorobami, takich jak to, w jaki sposób wirusy takie jak SARS COVID-2 lub związki, takie jak opary papierosów elektronicznych, wpływają na nabłonek wyrostka zębodołowego.

generating-3d-spheres-2d-air-liquid-interface-cultures-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film demonstruje metodę generowania astrosfer z komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Polega na wzroście i proliferacji komórek macierzystych z pożywkami zawierającymi czynniki wzrostu i inhibitory kinaz. Komórki te następnie agregują się i różnicują w astrocyty, tworząc astrosfery.

Generowanie i utrzymywanie astrosfer przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film demonstruje procedurę kokulturacji astrocytów i neuronów w celu utworzenia sfer 3D. Te sfery 3D stanowią odrębną platformę do badania tworzenia synaps i integracji sieci neuronowych, służąc tym samym jako potencjalny model do badań w neuronauce rozwojowej, chorobach neurodegeneracyjnych i interwencjach neurofarmakologicznych.

Generowanie 3D sfer kokulturowych astrocytów i neuronów w celu indukowania tworzenia synaps

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Tutaj opisujemy metodę generowania trójwymiarowych kultur sferoidalnych ludzkich komórek nabłonka nosa. Sferoidy są następnie stymulowane do napędzania wydzielania jonów i płynów zależnych od cyscydozy Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), określając ilościowo zmianę wielkości sferoidalnego światła jako wskaźnik zastępczy dla funkcji CFTR.

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy niedrogie i proste procedury wprowadzania różnych modeli 3D skóry do rutynowych badań w laboratorium hodowli komórkowych. Badacze mogą tworzyć modele dostosowane do ich potrzeb bez konieczności polegania na modelach dostępnych na rynku.

Tworzenie modeli skóry do wielu zastosowań - od dwuwymiarowej (2D) monokultury do trójwymiarowej (3D) wielokulturowości

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Ta publikacja demonstruje metody skutecznego pobierania próbek i hodowli błony śluzowej nabłonka nosa od dzieci oraz przeprogramowania tych komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Poznaj metodę hodowli iAT2 w sferach 3D oraz w warunkach granicy faz powietrze-ciecz. Technika ta umożliwia badanie biologii płuc w kontekście homeostazy i chorób, w tym wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na nabłonek pęcherzykowy.

Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów