Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Protokół ten nakreśla metodę hodowli i pasażowania ważnej populacji komórek w płucach i ustanawia fizjologicznie istotną platformę dla ekspozycji środowiskowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania biologii płuc w kontekście homeostazy i choroby. Metoda ta może dostarczyć informacji, zwłaszcza w zakresie chorób płuc wpływających na pęcherzyki płucne, w tym spowodowanych wariantami genetycznymi, narażeniem środowiskowym, czynnikami zakaźnymi lub kombinacją tych czynników.

Procedurę zademonstrujemy ja i Rhiannon Werder, wspomagani przez Kristy Abo, doktorantkę i Olivię Hix, kierowniczkę laboratorium z naszych laboratoriów. Najpierw odessać całe podłoże CK DCI z kropelek matrycy 3D zawierających pęcherzyki pęcherzykowe pochodzące z ukierunkowanego różnicowania w płytce 12-dołkowej. Dodaj jeden mililitr dypazy na kroplę.

Delikatnie odpipetować kroplę do kropli za pomocą pipety P-1000. Po inkubacji przenieść zdysocjowane organoidy z jednej kropli matrycy w dypazie do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj 10 mililitrów zmodyfikowanej pożywki Dulbecco firmy Iscove i wiruj przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Odessać supernatant tak bardzo, jak to możliwe. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze 0,05% trypsyny na kroplę i przenieść go z powrotem na płytkę 12-dołkową. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 15 minut przed obserwacją dysocjacji pod mikroskopem i unikaj nadmiernego pipetowania komórek.

Pod koniec inkubacji uzyskuje się zawiesinę pojedynczej komórki. Zatrzymać działanie trypsyny za pomocą równej objętości płodowej surowicy bydlęcej zawierającej pożywkę, a następnie odwirować przy 300 x g przez pięć minut. Umyj komórki 10 mililitrami IMDM przed następnym wirowaniem.

Zawieś komórki w odpowiedniej objętości do liczenia. A następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Generowanie pęcherzyków płucnych poprzez sianie zawiesiny pojedynczych komórek iAT2 w matrycy 3D lub na wkładkach do hodowli komórkowych w celu hodowli na granicy faz powietrze-ciecz.

Po zliczeniu komórek określ liczbę pożądanych komórek do odtworzenia w matrycy 3D i odwiruj komórki przy 300 x g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usuń jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety i szybko ponownie zawieś komórki w matrycy 3D. Dozować jedną kroplę matrycy 3D do studzienki wstępnie podgrzanej 12-dołkowej płytki za pomocą pipety P-200 bez tworzenia pęcherzyków w kropli matrycy i bez dopuszczania do osiadania zawiesiny komórek podczas dozowania wielu kropel.

Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 do 30 minut, aby umożliwić polimeryzację kropelek matrycy, a następnie dodaj jeden mililitr CK DCI 10 mikromolowych pożywki Y-27632 na studzienkę, aby przykryć kroplę matrycy. Po 72 godzinach należy zmienić pożywkę na CK DCI bez 10 mikromolowców Y-27632 i zastąpić ją nową CK DCI co 48 do 72 godzin. Na godzinę przed użyciem należy przygotować świeżo pokryte 6,5-milimetrowe wkładki do hodowli komórkowych, rozcieńczając matrycę 2D w zmodyfikowanej pożywce Eagle F-12 firmy Dulbecco do roztworu roboczego.

Następnie dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonej matrycy na 6,5 milimetrową wkładkę do hodowli komórkowej. Pozostawić matrycę do polimeryzacji w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut lub w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odessać nadmiar matrycy z wkładek do hodowli komórkowych za pomocą pipety.

Opłucz go DMEM F-12 i natychmiast odessaj ten płyn do płukania przed dodaniem komórek. Odwirować komórki przy 300 x g przez pięć minut i usunąć jak najwięcej supernatantu. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości do wysiewu 100 mikrolitrami CK DCI 10 mikromolowych Y-27632 na wkładkę do hodowli komórkowej i dodać 100 mikrolitrów do komory wierzchołkowej wkładki do hodowli komórkowej.

Delikatnie porusz płytką na krzyż, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek, i sprawdź ją pod mikroskopem przy obiektywie 10X. Dodać 500 mikrolitrów CK DCI 10 mikromolowych Y-27632 do podstawno-bocznego przedziału każdej wkładki do hodowli komórkowej, a 48 godzin po wysiewie odessać wierzchołkową pożywkę za pomocą pipety, aby zainicjować granicę faz powietrze-ciecz. Po 72 godzinach należy zmienić podłoże podstawno-boczne na CK DCI bez 10 mikromolowych Y-27632, a następnie zastąpić podłoże podstawno-boczne świeżym CK DCI co 48 do 72 godzin przez okres do 28 dni po posiewie.

Reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej wskazują na łatwość wizualizacji linii SPC2 z reporterem tdTomato ukierunkowanym na endogenne białko powierzchniowo czynne C locus i śledzeniem programu komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 w czasie w hodowli. Ekspresja białka surfaktantu C td, pochodzącego z komórek pęcherzykowych typu 2, pochodzącego z IPSC, została utrzymana po ponownym posianiu w matrycy 3D w postaci kulek i po posieciu na wkładkach do hodowli komórkowych. Przeznabłonkowy opór elektryczny można zmierzyć w celu określenia integralności kultury granicy faz powietrze-ciecz.

Podczas próby wykonania tej procedury należy unikać nadmiernej dysocjacji poprzez pipetowanie mechaniczne lub trawienie enzymatyczne, ponieważ może to prowadzić do niskiej żywotności komórek i słabej przeżywalności. Dodatkowymi metodami wykonywanymi po tej procedurze są pomiary przeznabłonkowej oporności elektrycznej na integralność bariery testowej, dodawanie wirusów lub związków w celu stymulacji komórek, immunofluorescencja oraz zbieranie RNA, białka lub supernatantu. Technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania nowych zagadnień związanych z biologią płuc i chorobami, takich jak to, w jaki sposób wirusy takie jak SARS COVID-2 lub związki, takie jak opary papierosów elektronicznych, wpływają na nabłonek wyrostka zębodołowego.