Name: Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Poznaj metodę chemicznej trifosforylacji oligonukleotydów 5' przy użyciu salicylofosforochloridytu i pirofosforanu. Protokół umożliwia syntezę trifosforylowanych oligonukleotydów o dowolnej sekwencji, w tym niestandardowego L-RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Gregowi Springsteenowi, Natashy Paul, Charlesowi Olea, Jr., Jonathanowi Sczepanskiemu i Katrinie Tjhung za użyteczne dyskusje na temat najlepszych praktyk dla chemicznych reakcji trifosforylacji oraz Geraldowi Joyce'owi za pomocne komentarze. Prace te były wspierane przez grant MCB 2114588 z National Science Foundation.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj procedura trifosforylacji jest zasadniczo zgodna z syntezą oligonukleotydów przy użyciu standardowej chemii fosforamidytów. Fosforamidyty nukleozydowe powinny mieć grupy ochronne o labilnej zasadzie zgodne z szybką deprotekcją w AMA39, w tym standardową β-cyjanoetylową na fosforynie oraz grupy izobutyrylowe, dimetyloformamidylowe, acetylowe, fenoksyacetylowe lub 4-izopropylofenoksyacetylowe na egzocyklicznych aminach nukleozasad. Grupy 2'-hydroksylowe rybozy powinny być chronione przez sililowe grupy ochronne, albo t-butylodimetylosililo (TBDMS), albo tri-izo-propylosililosmetylowe (TOM)40,41. Doniesiono również, że grupa labilna w postaci piwaloiloksymetylu (PivOM) jest zgodna z trifosforylacją chemiczną30.
Opisano wiele metod chemicznej trifosforylacji syntetycznych oligonukleotydów 28,29,30,31,32,33,34,35. Stwierdziliśmy, że trifosforylacja przy użyciu odczynnika Ludwiga-Ecksteina37 jest jedną z najbardziej dostępnych, nie wymagającą specjalistycznej syntezy odczynników ani specjalistycznego sprzętu. Oligonukleotydowe 5′-trifosforany otrzymane tą metodą były rutynowo stosowane jako substraty dla rybozymów ligazy RNA, w tym przy użyciu enzymatycznie niedostępnych trifosforanów oligonukleotydów L-RNA w celu uzyskania zależnej od matrycy syntezy i replikacji tego "lustrzanego odbicia" kwasu nukleinowego 14,16,17,18 . Metoda nadaje się również do otrzymywania małych 5′-trifosforylowanych RNA pętli macierzystej, które są silnymi aktywatorami wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u kręgowców 6,7.
Odczynnik Ludwiga-Ecksteina, fosforochloryd salicylu37, jest wysoce reaktywny z wodą i skutecznie usuwa wodę wprowadzoną podczas rozpuszczania odczynnika przed załadowaniem do kolumny oligonukleotydowej. Jednak po tym momencie 5′-fosforytylowany oligonukleotyd będzie preferencyjnie reagować z każdą wodą wprowadzoną do układu nad pirofosforanem, tworząc produkt uboczny 5′-H-fosfonianu po przetworzeniu 28,37,38. Staranne przygotowanie odczynników do trifosforylacji i komora reakcji trifosforylacji zapewniają, że ten produkt uboczny nie powstaje. Do suszenia rozpuszczalnikowego sita molekularne typu 4 A są sprzedawane w opakowaniach teflonowych kompatybilnych z większością rozpuszczalników organicznych pod różnymi nazwami handlowymi przez większość firm produkujących odczynniki do syntezy oligonukleotydów. Dodatkowe środki ostrożności, takie jak przeprowadzanie trifosforylacji w komorze rękawicowej w bezwodnej atmosferze, na ogół nie są konieczne.
Reakcja 5′-fosforylowanego oligonukleotydu z TBAP tworzy cykliczny półprodukt 5′-trimetafosfitu, który jest następnie utleniany do cyklicznego 5′-trimetafosforanu za pomocą roztworu utleniacza do syntezy oligonukleotydów (jod w wodzie/pirydynie/THF). Należy zauważyć, że komercyjne roztwory utleniacza wykorzystują różne ilości jodu i konieczne jest stosowanie wysokiego stężenia jodu 0,1 M, aby zapewnić całkowite utlenienie trifosforanu. Produkt cykliczny jest hydrolizowany do końcowego liniowego 5′-trifosforanu w tym samym roztworze37, a alternatywne, bezwodne roztwory utleniacza muszą być stosowane, jeśli pożądana jest linearyzacja z nukleofilami innymi niż woda (patrz poniżej dla zastosowań)33. Wszelkie pozostałości cyklicznego trimetafosforanu zostaną jednak zlinearyzowane podczas późniejszej alkalicznej deprotekcji oligonukleotydu. W wyniku hydrolizy cyklicznego 5′-trimetafosforanu powstaje tylko trifosforan liniowy, a nie rozgałęziony37,46.
Deprotekcja oligonukleotydów zazwyczaj nie musi być modyfikowana, aby dostosować się do 5′-trifosforylacji, ale należy podjąć kilka środków ostrożności. Trifosforan jest stosunkowo stabilny do krótkiej ekspozycji na warunki zasadowe, ale należy zachować ostrożność, aby nie wystawiać trifosforanu na działanie AMA dłużej niż to konieczne. Należy unikać ochrony grup, które wymagają dłuższego leczenia amoniakiem lub AMA przez ponad 10 minut w temperaturze 65 °C. Bardziej delikatne zabiegi, takie jak 2 godziny w amoniaku w temperaturze pokojowej, są dopuszczalne, jeśli są kompatybilne z innymi grupami ochronnymi fosforamidytu. Powszechna, szybka metoda deprotekcji syntetycznych oligonukleotydów RNA chronionych silanami wykorzystuje trihydrofluorek trietyloaminy i wysoką temperaturę47; należy jednak tego unikać podczas przygotowywania 5′-trifosforanów RNA, ponieważ stwierdzono, że przedłużające się warunki kwaśne przyspieszają hydrolizę trifosforanu31,32.
Preparatywna PAGE okazała się najprostszą i najbardziej wiarygodną metodą oczyszczania oligonukleotydów 5′-trifosforylowanych po deprotekcji (ryc. 3 i ryc. 4). Jednak preparatywna HPLC z odwróconymi fazami może być również stosowana do oczyszczania produktów trifosforylowanych. Obecność produktów 5′-difosforanu i, w mniejszym stopniu, 5′-monofosforanu jest rutynowo obserwowana podczas sprawdzania trifosforylacji za pomocą spektrometrii mas. Zaobserwowaliśmy fragmentację 5′-trifosforanu podczas spektrometrii mas z wysoce czystego materiału przygotowanego przez syntezę chemiczną lub transkrypcję, szczególnie jeśli instrument nie jest zoptymalizowany do analizy oligonukleotydów. Niemniej jednak analiza RP-LC często pokazuje, że 10% -20% produktu ubocznego 5′-difosforanu jest obecne w dłuższych oligonukleotydach 5′-trifosforylowanych (ryc. 4). Komercyjne preparaty pirofosforanu tributyloamonu mogą być zanieczyszczone nawet 20% monofosforanem, który otrzyma 5′-difosforan jako produkt uboczny podczas trifosforylacji30,31. Staranne przygotowanie tego odczynnika we własnym zakresie może dać znacznie czystsze zapasy TBAP31. Odkryliśmy jednak, że oligonukleotydy trifosforylowane przy użyciu komercyjnych źródeł TBAP nadal wykazują porównywalną lub większą reaktywność, gdy są stosowane jako substraty w reakcjach enzymatycznych (Figura 5B), w porównaniu z materiałem przygotowanym przez transkrypcję in vitro.
Jedno godne uwagi dalsze zastosowanie trifosforylacji oligonukleotydów z odczynnikiem Ludwiga-Ecksteina wykorzystuje cykliczny produkt pośredni trimetafosforytu33. Jeśli kolejny etap utleniania przeprowadza się z 1 M nadtlenkiem t-butylu w heksanach, który jest często stosowany do utleniania oligonukleotydów w warunkach bezwodnych, utlenianie fosforynu zachodzi bez hydrolizy z otwarciem pierścienia, dając cykliczny trimetafosforan. Ten produkt pośredni może być następnie poddany reakcji z pierwszorzędowymi nukleofilami aminowymi lub alkoholowymi, aby uzyskać 5′-trifosforany z modyfikacjami w γ-fosforanie. Modyfikacje te obejmują dodanie znacznika lipofilowego połączonego wiązaniem fosforoamidowym, co ułatwia szybkie oczyszczanie specyficzne dla trifosforanu przez RP-LC, a następnie kwaśną hydrolizę znacznika z trifosforanu33. Modyfikacje fluorescencyjne w pozycji γ-fosforanu mogą być również wprowadzone do użytku jako reportery fluorescencyjne w czasie rzeczywistym w reakcjach ligacji katalizowanych rybozymem15,33.

Forma RNA z 5′-trifosforanem jest powszechnie występująca w biologii, ponieważ powstaje w wyniku transkrypcji RNA we wszystkich domenach życia oraz podczas replikacji RNA w cyklu życiowym wielu wirusów RNA. Trifosforany te służą jako substrat do tworzenia mRNA z czapeczką 7-metyloguanylową u eukariotów i w związku z tym odgrywają kluczową rolę w ekspresji białek1. W przeciwieństwie do tego, grupa trifosforanowa jest zachowana u bakterii i wirusów; w związku z tym 5′-trifosforany RNA są rozpoznawane przez regulatory odpowiedzi odporności wrodzonej u eukariotów2,3,4,5,6,7. Poza biologią opracowano szereg rybozymów ligaz RNA wykorzystujących 5′-trifosforan in vitro8, które zmodyfikowano do zastosowań w testach diagnostycznych9,10,11,12,13,14,15. Jeden z takich rybozymów może być wykorzystany do syntezy zależnej od matrycy L-RNA, niebiologicznego enancjomeru „lustrzanego odbicia” naturalnego D-RNA, z niewielkich 5′-trifosforanowych oligonukleotydów L-RNA16,17,18. Rutynowe przygotowanie trifosforanowanych oligonukleotydów o różnej sekwencji i składzie szkieletu jest niezbędne do badania tych układów.
Najczęstszą i najbardziej dostępną metodą przygotowywania 5′-trifosforanów RNA w laboratorium jest transkrypcja in vitro. Jednak RNA wytwarzane tą metodą jest ograniczone pod względem sekwencji i rozmiaru przez wymagania promotora i substratu enzymu polimerazy RNA. Do tego celu najczęściej wykorzystuje się polimerazę RNA T7 oraz jej wyspecjalizowane pochodne19,20,21,22. RNA transkrybowane in vitro za pomocą tych enzymów musi rozpoczynać się od puryny na końcu 5′ i wykazuje silną preferencję dla puryn w pierwszych 10 nukleotydach23,24. Ponadto enzymatyczna inkorporacja nukleotydów z modyfikacjami zasady lub szkieletu jest w najlepszym przypadku mało wydajna, a częściej niemożliwa przy użyciu naturalnych polimeraz, co ogranicza możliwość produkcji 5′-trifosforanów oligonukleotydów składających się z czegoś innego niż naturalne D-RNA. Kolejnym czynnikiem ograniczającym jest fakt, że RNA generowane poprzez transkrypcję in vitro może wykazywać znaczną heterogeniczność na końcach 5′ i 3′, a w przypadku produktów krótszych niż 20 nt jest wytwarzane jako produkty niezwykle heterogeniczne23,24,25,26,27.
W przeciwieństwie do tego, chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów otrzymywanych za pomocą syntezy fosforamidytowej w fazie stałej28,29,30,31,32,33,34,35 może być wykorzystana do przygotowania 5′-trifosforanów oligonukleotydów o długości od 3 do 50 nt i dowolnej sekwencji. Dodatkowo, przed 5′-trifosforylacją do oligonukleotydów można wprowadzić szeroki wachlarz modyfikacji kwasów nukleinowych dostępnych w syntezie fosforamidytowej14,15,16,17,18,29,36. Wiele z tych metod wykorzystuje odczyn do fosfitylacji – fosforochlorek salicylowy, który został opracowany przez Ludwiga i Ecksteina do trifosforylacji mononukleozydów w fazie ciekłej37. Trifosforylację oligonukleotydów tym odczynnikiem przeprowadza się w fazie stałej poprzez fosfitylację grupy 5′-hydroksylowej oligonukleotydu, konwersję do trifosforanu w reakcji z pirofosforanem oraz utlenianie, a następnie standardowe procedury odszczepiania oligonukleotydu z nośnika stałego, deprotekcji i oczyszczania (Rycina 1)28.
<img alt="Schemat syntezy chemicznej przedstawiający przygotowanie fosforamidytu nukleozydu z użyciem odczynników i rozpuszczalników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat trifosforylacji syntetycznych oligonukleotydów. W pierwszym kroku grupa 5ʹ-hydroksylowa oligonukleotydu zostaje poddana fosfitylowaniu za pomocą SalPCl. W kolejnym kroku 5ʹ-fosforyt salicylowy reaguje z TBAP, tworząc cykliczny metafosforyt, który w trzecim kroku ulega utlenieniu w roztworze utleniającym do syntezatora DNA/RNA (0,1 M jodu/pirydyny/H2O/THF), generując cykliczny 5ʹ-trimetafosforan, który szybko hydrolizuje w tym samym roztworze do liniowego 5ʹ-trifosforanu28,33,37. Następne zasadowe odszczepienie z litego nośnika CPG oraz deprotekcja oligonukleotydu w wodnym MeNH2/amoniaku spowoduje hydrolizę pozostałego cyklicznego trimetafosforanu do formy liniowej. Skróty: SalPCl = chlorofosforyt salicylowy; TBAP = pirofosforan tributyloamoniu; THF = tetrahydrofuran; CPG = szkło o kontrolowanych porach; MeNH2 = metyloamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Mimo że wczesne publikacje opisujące tę metodę często wskazywały na niskie wydajności i powstawanie niepożądanych produktów ubocznych28,37,38, staranne utrzymanie warunków bezwodnych jest wystarczające do rutynowego uzyskiwania wysokich wydajności. Można to osiągnąć poprzez dokładne przygotowanie odczynników oraz zastosowanie prostego urządzenia reakcyjnego złożonego ze standardowych komponentów plastikowych. W niniejszej pracy prezentujemy odpowiednie etapy chemicznej trifosforylacji oligonukleotydów, w tym przygotowanie odczynników, montaż komory reakcyjnej, przeprowadzenie reakcji trifosforylacji oraz następującą po niej deprotekcję i oczyszczanie trifosforylowanych oligonukleotydów. Przedstawiono również reprezentatywne zastosowanie oligonukleotydów trifosforylowanych na końcu 5′ jako substratów dla rybozymów ligazowych w syntezie większych produktów kwasów nukleinowych z naturalnym szkieletem D-RNA oraz abiotycznym szkieletem L-RNA.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m filtr strzykawkowy z polieterosulfonu</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>Filtr strzykawkowy do usuwania pokruszonych cząstek żelu poliakryloamidowego (sekcja 5)</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Filtr strzykawkowy z PTFE</td><td>MilliporeFiltr</td><td></td><td>strzykawkowy Sigma SLLG013SL do usuwania żywicy CPG (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Plastikowe strzykawki 1 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>Elementy aparatu do trifosforylacji (sekcje 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>1,4-dioksan, bezwodny</td><td>rozpuszczalnik MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>Triphosphorylation (sekcje 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>2-chloro-4H-1,3,2-benzodioksafosforyno-4-on, fosforochloryd salicylu (SalPCl)</td><td>MiliporeSigma</td><td>324124</td><td>odczynnik trifosforylacji (sekcje 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Butelki szklane 30 ml</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>Butelki do przygotowania rozpuszczalników trifosforylacyjnych i roztworu TBAP (sekcja 2)</td></tr> <tr><td>3-drogowy kran odcinający, poliwęglan/polipropylen</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7328103</td><td>Składnik aparatu do trifosforylacji (sekcje 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>40% roztwór akrylamidu/bis-akrylamidu, 19:1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>Dla STRONY (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Acetonitryl, bezwodny, 100 ml</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Rozpuszczalnik trifosforylacji (sekcje 2 i ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Pułapka neutralizująca amoniak</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 i ANS121</td><td>Do stosowania z Speedvac DNA130 (sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td> <td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>Dla PAGE, katalizator do polimeryzacji akrylamidu (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Wodny amoniak, 28%</td> <td>miliporówSigma</td><td>338818</td><td>Do przygotowania odczynnika deprotekcyjnego AMA (sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Wodna metyloamina, 40%</td> <td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>Do przygotowania odczynnika deprotekcji AMA (sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Automatyczny syntezator oligonukleotydów DNA / RNA</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 Syntezator DNA/RNA</td><td>dowolny syntezator oparty na kolumnie jest dopuszczalny (sekcja 1)</td></tr><tr><td>Magnes wychwytujący koraliki</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>Do wychwytywania kulek streptawidyny (sekcja 7)</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610404</td><td>Do PAGE Bufor mocznikowy (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Pompa olejowa do głębokiej próżni</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>Do stosowania z liofilizatorem (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Drierite dessicanty, 10-20 mesh</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>Środek osuszający do przechowywania chemikaliów i sprzętu do trifosforylacji (sekcje 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>Krzyżowo-chiralna polimeraza D-RNA 27,3t</td><td>przygotowana w domu18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAAAAAA, GUCGACAAAG, CUUAUACAAG, AACUGUAUCA CCGGAGGGCG, AGCACCACC-3&PRIME;</td><td>W przypadku reakcji rybozymu krzyżowego chiralnego (sekcja 7)</td></tr><tr><td>Stałe podpory D-RNA CPG, 1,000&Aring;, paczkowane 1 &mikro; kolumny syntezy kretów</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, przedstawiciel 20-3430-41E</td><td>, do syntezy oligonukleotydów D-RNA (sekcja 1)</td></tr><tr><td>Fosforamidyty chronione przez TOM D-RNA</td><td>Przedstawiciel ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td>, <td>do syntezy oligonukleotydów D-RNA (sekcja 1)</td></tr><tr><td>Puste kolumny do syntezy przyspieszonej, 1&mikro; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Kolumny do syntezy do użytku z syntezatorem Expedite DNA/RNA (sekcja 1)</td></tr><tr><td>EPPS, Kwas N-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N&prime;-(3-propanosulfonowy), stały</td><td>MiliporeSigma</td><td>E1894</td><td>Składnik buforu reakcyjnego rybozymu (sekcja 6)</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), stały</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>Dewalentny chelator jonów metali do stosowania w różnych ( Sekcje 5 i ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Filtry do kolumn syntezy Expedite</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Filtry kolumn syntezy w stylu Expedite, do użytku z pustymi kolumnami syntezy (sekcja 1)</td></tr> <tr><td>Skaner żelowy fluorescencyjny/fosforyzujący</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>Do wizualizacji analitycznej STRONY (sekcje 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Formamid, dejonizowany</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>Dla bufora ładującego żel formamidowy PAGE (sekcje 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do kwantyfikacji obrazu żelu</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>Do ilościowego oznaczania zeskanowanych obrazów żelu (sekcja 6)</td></tr> <tr><td>Szklany eksykator</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Przechowywanie rozpuszczalnika trifosforylacji (sekcja 2)</td></tr> <tr><td>Stałe nośniki L-RNA CPG, 1,000 & Aring;, luzem</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>Synteza oligonukleotydów L-RNA (sekcja 1)</td></tr><tr><td>Matryca L-RNA młota</td><td>przygotowana w domu18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>W przypadku reakcji rybozymu krzyżowego chiralnego (sekcja 7)</td></tr><tr><td>Starter L-RNA</td><td>przygotowany w domu18</td><td>5&prime;-fluoresceina-GGCUCGA-3&prime;</td><td>W przypadku reakcji rybozymu krzyżowego chiralnego (sekcja 7)</td></tr><tr><td>Fosforamidyty chronione L-RNA</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>Synteza oligonukleotydów L-RNA (sekcja 1)</td></tr><tr><td>Liofilizator/liofilizator</td><td>VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>Do koncentracji oligonukleotydów (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny, stały</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>Do reakcji rybozymowych (sekcje 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>N,N-dimetyloformamid, bezwodny</td><td>MiliporeRozpuszczalnik trifosforylacyjny Sigma</td><td>227056</td><td>(sekcja 2)</td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca NAP-25 (żywica Sephadex G-25)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>Jednorazowe kolumny chromatograficzne wykluczające grawitacyjne z przepływem zawierającym żywicę Sephadex G-25 (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Igła bez rdzenia ze stali nierdzewnej, 20 G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>Igły do przekłuwania przegród gumowych (sekcje 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Kalkulator współczynnika ekstynkcji oligonukleotydów</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Narzędzie OligoAnalyzer</td><td>Model najbliższego sąsiada Krótki kalkulator współczynnika ekstynkcji oligonukleotydu 260 nm (sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Roztwór utleniacza, 0,1 M Jod w THF / pirydynie / wodzie</td><td>Odczynnik do trifosforylacji</td> <td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td> (sekcja 4)</tr> <tr><td>Tabliczki PAGE</td><td>Timberrock / CBS</td><td>NGP-250-BO i NO</td><td>Dla STRONY (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Zasilacz PAGE</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>Dla PAGE (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Przekładki i grzebienie PAGE (analityczne)</td><td>Timberrock / CBS</td><td>VGS-0725 i VGC-0714</td><td>Dla PAGE (sekcje 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Przekładki i grzebienie PAGE (preparatywne)</td> <td>Timberrock / CBS</td><td>VGS-3025R i VGC-3001</td><td>Dla PAGE (sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Stojak PAGE</td><td>Timberrock / CBS</td><td>ASG-250</td><td>Dla PAGE (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td> <td>Woskowa folia uszczelniająca do aparatu do trifosforylacji (sekcje 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>Termocykler PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Thermalcycler</td><td>Do reakcji rybozymów krzyżowych chiralnych (sekcja 7)</td></tr> <tr><td>PD 10 Kolumna odsalająca (żywica Sephadex G-10)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>Jednorazowe kolumny chromatograficzne wykluczające wielkość przepływu grawitacyjnego zawierające żywicę Sephadex G-10, do oligonukleotydów < 15 nt (sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Sita fosforowe</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>Do wizualizacji reprezentatywnego RNA znakowanego 32P (sekcja 6)</td></tr><tr><td>Odczynniki do syntezy fosforoamidytu</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62</td><td>, do standardowej syntezy RNA/DNA (sekcja 1)</td></tr><tr><td>Polipropylenowa zamykana rurka z nakrętką</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>1,5 ml probówki mikrowirówkowe z nakrętką i silikonowym O-ringiem, do bezpiecznej deprotekcji AMA ( sekcja 5)</td></tr><tr><td>Pirydyna, bezwodna</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>Rozpuszczalnik trifosforylacji (sekcja 2)</td></tr><tr><td>Chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami/spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylającą (RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>Usługa komercyjna dla LC/MS specjalizująca się w oligonukleotydach (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Przegroda gumowa (ID x OD 7,9 mm x 14 mm), biała</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>Przegrody do przygotowania rozpuszczalników trifosforylacyjnych i TBAP (sekcja 2)</td></tr><tr><td>Rybozym E z samoreplikatorem</td><td>przygotowany w domu14</td><td>5&prime;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&prime;</td><td>W reakcjach rybozymowych z samoreplikatorem (sekcja 6)</td></tr><tr><td>Podłoże samoreplikatora A</td><td>przygotowane w domu14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU U-3&prime;-OH</td><td>Do reakcji rybozymów samoreplikatorowych (sekcja 6)</td></tr><tr><td>Substrat B samoreplikatora, transkrybowany</td><td>przygotowany w domu14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>W reakcjach rybozymowych z samoreplikatorem (sekcja 6)</td></tr><tr><td>Małe pułapki suszące, 4 i Aring; sita molekularne</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>Pułapki suszące do fosforamidytów syntezatora DNA/RNA i odczynników trifosforylacji (sekcje 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>Chlorek sodu (NaCl), stała</td> sól <td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>do stosowania w różnych (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH), stała</td> sól <td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>do stosowania w różnych (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do dopasowywania danych statystycznych</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Do dopasowywania danych z analitycznego PAGE do modeli kinetycznych (sekcja 6)</td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne pokryte streptawidyną</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>Do wychwytywania RNA znakowanego biotyną w reakcjach rybozymu krzyżowego chiralnego (sekcja 7)</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>Do bufora ładującego mocznik PAGE (sekcja 5)</td></tr><tr><td>TBE bufor biegowy, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ62788K3</td><td>Dla STRONY (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Fluorek tetrabutyloamoniowy, 1,0 M roztwór w Tetrahydrofuran</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>Do usuwania 2&prime;-sililowych grup ochronnych (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610801</td><td>Do polimeryzacji akrylamidu dla PAGE (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Tributyloamina</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>Odczynnik do trifosforylacji (sekcja 2)</td></tr><tr><td>Pirofosforan tributyloamonu (TBAP)</td><td>MiliporeSigma</td><td>P8533</td><td>Odczynnik trifosforylacji (sekcja 2)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>Środek buforujący do stosowania w różnych (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>TWEEN20 detergent polisorbatowy</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>Neutralny detergent do stosowania z kulkami magnetycznymi (sekcja 7)</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>MiliporeSigma</td><td>U5378</td><td>Do bufora ładującego PAGE i żel (sekcje 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>Do pomiaru stężeń oligonukleotydów (sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Wirówka próżniowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 Koncentrator próżniowy</td><td>Do usuwania AMA i THF (sekcja 5)</td></tr><tr><td>Ksylen-cyjanol</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610423</td><td>Do PAGE bufor ładujący mocznik (sekcja 5)</td></tr></tbody></table>

chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

5′-trifosforan jest niezbędną modyfikacją kwasu nukleinowego występującą przez całe życie i coraz częściej używaną jako funkcjonalna modyfikacja oligonukleotydów w biotechnologii i biologii syntetycznej. Oligonukleotydowe 5′-trifosforany były historycznie przygotowywane in vitro metodami enzymatycznymi. Jednak metody te ograniczają się do naturalnych oligonukleotydów RNA, mają silne preferencje sekwencyjne i mają tendencję do wytwarzania niejednorodnych produktów. Nowe metody chemicznej trifosforylacji uzupełniają zarówno obniżone koszty zautomatyzowanej syntezy oligonukleotydów za pomocą chemii fosforoamidytu, jak i różnorodny zakres dostępnych obecnie modyfikacji nukleotydów. W ten sposób synteza trifosforanów oligonukleotydów o dowolnej sekwencji i długości, opcjonalnie zawierających różne nienaturalne modyfikacje, jest teraz dostępna.
Ten artykuł przedstawia odpowiednie metody i techniki chemicznej trifosforylacji oligonukleotydów przy użyciu fosforochlorydu salicylu i pirofosforanu. Metoda ta wykorzystuje dostępne na rynku odczynniki, jest kompatybilna z większością oligonukleotydów otrzymanych standardowymi metodami syntezy w fazie stałej i może być zakończona w ciągu 2 godzin po syntezie oligonukleotydów, przed deprotekcją i oczyszczeniem. Wykazano dwa zastosowania chemicznie trifosforylowanych oligonukleotydów jako substratów dla katalitycznych enzymów RNA, w tym syntezę lustrzanej wersji rybozymu młota z niebiologicznych trifosforanów L-RNA.

Oligonukleotydy należy syntetyzować zgodnie ze standardowymi protokołami dostosowanymi do fosforamidytów i automatycznego syntezatora DNA/RNA, pozostawiając produkt w postaci oligonukleotydu nieodłączonego od wsparcia stałego w oryginalnej plastikowej kolumnie syntezy, z usuniętą 5ʹ-końcową grupą dimetoksytritylową w celu uzyskania wolnej grupy 5ʹ-hydroksylowej (sekcja 1). Wszystkie oligonukleotydy użyte w tym pokazie przygotowano przy użyciu żywicy z kontrolowaną wielkością porów (CPG) 1 000 Å jako wsparcia stałego w skali 0,2 lub 1 µmole. Reprezentatywne przykłady kolumn syntezatora, żywic, odczynników i fosforamidytów znajdują się w Tabeli Materiałów. W przypadku reakcji na większą skalę może być konieczna korekta objętości i czasów zastosowanych w kolejnych krokach.
Reakcja trifosforylacji jest przeprowadzana na kolumnie w specjalnie zbudowanej komorze reakcyjnej (Rysunek 2, sekcja 3) przy użyciu standardowych, dostępnych komercyjnie komponentów wymienionych w Tabela materiałów i przebiega zgodnie ze schematem przedstawionym w Rysunek 1 (sekcja 4)28Podczas trifosforylacji niezbędne jest zachowanie rygorystycznych warunków bezwodnych; wszystkie rozpuszczalniki i odczynniki należy przygotować wcześniej nad sitami molekularnymi i całkowicie osuszyć przed użyciem (rozdział 2). Proces trifosforylacji trwa zazwyczaj 2 godziny, po czym wypłukaną i osuszoną kolumnę można poddać standardowym procedurom usuwania grup ochronnych i oczyszczania oligonukleotydów (rozdział 5).
Po usunięciu grup ochronnych trynukleotydy oligonukleotydowe są oczyszczane za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), wykazując w świetle UV jedną główną prążek produktu, który można wyciąć i wyeluować z żelu. Produkt 5′-trifosforanowy jest łatwo oddzielany od produktów ubocznych reakcji w przypadku krótkich oligonukleotydów, co pokazano dla 5ʹ-trifosforanów trinukleotydów DNA, pppAAA i pppCCC, oraz 5ʹ-trifosforanu trinukleotydowego L-RNA pppGAA na Rysunku 3A,B. Zarówno produkty 5′-hydroksylowe, jak i 5′-trifosforanowe dla trimerów DNA AAA i CCC zostały wycięte i zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas oraz odpowiednio oznaczone na Rysunku 3A. Dodatkowe prążki, widoczne w przypadku trimeru DNA AAA, zazwyczaj nie zawierają wystarczającej ilości materiału do odzyskania i identyfikacji. Obecność tych prążków koreluje jednak z dodatkowymi masami produktów w nieoczyszczonych produktach reakcji (Rysunek 3C), co zazwyczaj reprezentuje produkty uboczne w postaci 5′-difosforanów, monofosforanów i H-fosfonianów, o czym omówiono poniżej.
Po oczyszczaniu metodą PAGE większe oligonukleotydy można eluować metodą rozdrabniania i namaczania (crush and soak)42 z następującym wytrącaniem etanolem. Jednak oligonukleotydy krótsze niż 15 nt nie mogą być wydajnie wytrącone etanolem, w związku z czym wymagają zmodyfikowanej procedury elucji z żelu (krok 5.11.3). Jednorazowa kolumna do chromatografii wykluczania cząsteczkowego wymieniona w Tabeli materiałów jest przeznaczona wyłącznie do stosowania z oligonukleotydami dłuższymi niż 10 nt. Stwierdziliśmy jednak, że oligonukleotydy o długości nawet trzech nukleotydów (trymery) mogą być skutecznie odsolone zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Niemniej jednak przy odsalaniu krótkich oligonukleotydów (jak w krokach 5.6 i 5.11.3) zaleca się zbieranie eluatu z kolumny w frakcjach i identyfikację frakcji produktu poprzez pomiar absorbancji przy 260 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Alternatywna kolumna do chromatografii wykluczania cząsteczkowego, zoptymalizowana dla krótszych oligonukleotydów, została podana w Tabeli materiałów. Końcowa wydajność z syntezy oligonukleotydów w skali 1 µmole po oczyszczaniu wynosi 50-300 nmol.
Triphosphorylation można potwierdzić za pomocą spektrometrii mas, gdzie produkt trifosforylowany posiada masę większą o +239,94 Da w porównaniu do oligonukleotydu z grupą 5′-hydroksylową, choć często obserwuje się obecność materiałów odpowiadających 5′-difosforanowi i monofosforanowi (odpowiednio +159,96 i +79,98 Da). Może również pojawić się produkt uboczny w postaci 5′-H-fosfonianu o masie większej o +63,98 Da względem masy 5′-OH; wysoki poziom tego produktu wskazuje, że warunki podczas trifosforylacji nie były wystarczająco bezwodne. Przed oczyszczaniem odprotekcjonowane oligonukleotydy zazwyczaj wykazują wszystkie te produkty (Rysunek 3C), natomiast oczyszczony materiał wykazuje piki odpowiadające produktowi 5′-trifosforanowemu wraz z 5′-difosforanami i monofosforanami (Rysunek 3D,E).
Sama spektrometria mas zazwyczaj nie pozwala na rygorystyczne określenie czystości 5′-trifosforanu ze względu na różnice w szybkościach jonizacji i fragmentacji trifosforanu podczas procesu jonizacji. Aby zmierzyć czystość produktu końcowego, zaleca się zastosowanie odwrotnej fazy chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas z jonizacją w źródle elektronspray (RP-LC/ESI-MS), szczególnie w przypadku dłuższych oligonukleotydów. Analiza 5ʹ-trifosforanów D-RNA pppACGAGG oraz pppGAGACCGCAACUUA za pomocą RP-LC/ESI-MS (odpowiednio Rysunek 4A,B) wykazuje typową czystość produktu końcowego, zawierającego 20% 5ʹ-difosforanu, ponieważ te dwie formy są trudne do rozdzielenia, gdy występują w dłuższych oligonukleotydach.
Syntetyczne oligonukleotydy z 5′-trifosforanem zazwyczaj sprawdzają się w badaniach biochemicznych równie dobrze lub lepiej niż materiały przygotowane enzymatycznie. W sekcji 6, jako przykład, podano substraty RNA o długości 14 nt z 5′-trifosforanem, przygotowane albo syntetycznie, albo przez in vitro transkrypcje porównano w reakcji samoreplikacji katalizowanej przez RNA14,15,43,44,45Ribozym E katalizuje łączenie substratów A i B w celu uzyskania nowej kopii E w reakcji autokatalitycznej zdolnej do wzrostu wykładniczego (Rycina 5A). E i 32Komponenty A znakowane fosforem ($\text{P}$) przygotowano poprzez in vitro transkrypcja, a trifosforylowany substrat B przygotowano albo syntetycznie, zgodnie z powyższym opisem, albo poprzez in vitro transkrypcja14Postęp reakcji samoreplikacji monitorowano poprzez pobieranie okresowych próbek, które poddano analizie za pomocą denaturującej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (PAGE), a następnie poddano kwantyfikacji. poprzez skaner żeli fluorescencyjnych/fosforyzujących. Uzyskane dane, dopasowane do funkcji wzrostu logistycznego, wykazały, że zarówno transkrybowany, jak i syntetyczny substrat B wspomagają wzrost wykładniczy, przy czym syntetyczny B daje nieco większą ilość produktu (Rysunek 5B). Wynik ten może odzwierciedlać heterogeniczność składu na końcu 5′ RNA przygotowanego przez in vitro transkrypcja23,24.
Chemiczna trifosforylacja umożliwia również syntezę trifosforanów oligonukleotydów, których nie można przygotować biologicznie, ani in vitro, ani w komórkach. W sekcji 7 niebiologiczne trifosforany oligonukleotydów składające się z L-RNA, enancjomeru naturalnego D-RNA, przygotowane zgodnie z opisem w sekcjach 1-5, zostały użyte jako substraty dla „cross-chiralnego” rybozymu polimerazy D-RNA 27.3t (Rysunek 6A), który katalizuje sterowaną matrycą polimeryzację dłuższego produktu L-RNA z krótkich 5′-trifosforanów oligonukleotydów L-RNA w sposób niezależny od sekwencji. Przykładowo, rybozym ten może syntetyzować wersję L-RNA motywu samoprzecinającego hammerhead (Rysunek 6B)18. Oczyszczone trifosforany trinukleotydów L-RNA połączono z l-RNA primerem znakowanym fluoresceiną oraz matrycą L-RNA (Rysunek 6C), a następnie poddano reakcji z ligazą cross-chiralną. Próbki pobierane w trakcie reakcji analizowano metodą PAGE i obrazowano za pomocą fluorescencyjnego/fosforescencyjnego skanera żeli, aby wykazać syntezę wersji L-RNA rybozymu hammerhead zakodowanego przez matrycę (Rysunek 6D).
<img alt="Wyniki elektroforezy, dane spektrometrii mas, analiza białek, wykresy intensywności względem masy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Oczyszczanie trynukleotydów 5ʹ-trifosforanowych. (A) Analiza PAGE (wizualizowana metodą cieniowania UV) trifosforylacji trynukleotydów DNA: tri-deoksyadenozyny (AAA, niebieski) i tri-deoksycytydyny (CCC, czerwony), celowo przeładowanych w celu wizualizacji niewielkich produktów ubocznych. Zarówno produkt 5ʹ-trifosforanowy (ppp), jak i materiał wyjściowy 5ʹ-hydroksylowy (OH) zostały wycięte i zidentyfikowane za pomocą MALDI-MS. (B) Preparatywna elektroforeza PAGE trifosforylacji trynukleotydu L-RNA GAA, z wyciętym głównym prążkiem produktu, zidentyfikowanym jako 5ʹ-trifosforan (ppp) za pomocą ESI-MS. (C) MALDI-MS surowych produktów reakcji po deprotekcji oraz (D) oczyszczonych produktów z (A). Oznaczono: 5ʹ-trifosforan (ppp; pppAAA oczekiwane 1 119 Da, zaobserwowano 1 118 Da; pppCCC oczekiwane 1 047 Da, zaobserwowano 1 046), 5ʹ-difosforan (pp), 5ʹ-monofosforan (p), 5ʹ-hydroksyl (OH) oraz 5ʹ-H-fosfonian (Hp). (E) Dekonwolucyjne widmo masowe z bezpośredniego wtrysku ESI-MS wyizolowanego produktu 5ʹ-trifosforanowego z (B), z oznaczonymi zidentyfikowanymi pikami (oczekiwane 1 181,6 Da, zaobserwowano 1 181,0 Da). Zaobserwowano również produkty 5ʹ-difosforanowe (pp), jak i piki jonów sodu dla produktów trifosforanowych i difosforanowych (+22 Da). Typowe piki zanieczyszczeń oznaczono gwiazdką. Dla ułatwienia porównania widma masowe znormalizowano do najwyższej intensywności zmierzonej w każdym widmie i przedstawiono jako procent tej wartości. Skróty: PAGE = elektroforeza w żelu poliakryamidowym; MALDI-MS = spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą macierzą; ESI-MS = spektrometria mas z jonizacją elektrospray. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny przedstawiający intensywność piku w funkcji czasu retencji dla analizy związków pp, ppp." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analityczna RP-LC trifosforanowych oligonukleotydów D-RNA o długości 6 nt i 14 nt. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ oraz (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandemowa ESI-MS zidentyfikowała główny pik w obu przypadkach (~70%) jako 5ʹ-trifosforan (ppp), przy mniejszych ilościach 5ʹ-difosforanu (pp). Skróty: RP-LC = odwrotna faza chromatografii cieczowej; nt = nukleotydy; ESI-MS = spektrometria mas z jonizacją w rozpylaniu elektrycznym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat struktury drugorzędowej RNA z wykresem stężenie-czas dla analizy kinetycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Porównanie substratów oligonukleotydów 5ʹ-trifosforanowych przygotowanych metodą syntezy chemicznej lub transkrypcji in vitro. (A) Samoreplikujący się rybozym E liguje RNA A i 5′-trifosforylowane RNA B. (B) Porównanie reakcji samoreplikacji z użyciem 10 µM A i 10 µM B, syntetycznych (puste kółka) lub transkrybowanych in vitro (pełne kółka). (B) Dane dopasowano do równania wzrostu logistycznego: [E] = a / (1 + be-ct), gdzie a jest wydajnością końcową, b stopniem sygmoidalności, a c wykładniczą szybkością wzrostu. Szybkości wzrostu dla obu reakcji były identyczne i wynosiły 1,14 h-1, natomiast końcowy zakres był o 10% wyższy dla reakcji z syntetycznym B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Struktura drugorzędowa RNA, schematy procesu transkrypcji, wyniki elektroforezy w układzie eksperymentalnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Polimeryzacja L-RNA o przeciwnej chiralności za pomocą rybozymu. (A) Rybozym polimeraza D-RNA 27.3t, który katalizuje ligację L-RNA zależną od matrycy. (B) Produkt L-RNA syntetyzowany przez 27.3t tworzy część motywu endonukleazy typu hammerhead. (C) Polimeryzacja L-RNA katalizowana przez 27.3t z wykorzystaniem biotynylowanej matrycy L-RNA (brązowa), primera L-RNA z etykietą końcową (magenta) oraz czterech syntetycznie przygotowanych trynukleotydowych trifosforanów L-RNA (cyjan). (D) Analiza PAGE produktów elongacji z (B) po 4 h i 24 h, pokazująca wbudowanie każdego trynukleotydu aż do produktu o pełnej długości (czarna kropka). Niezreagowany primer L-RNA służy jako marker referencyjny. Skróty: PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym; M = marker referencyjny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Trifosforylacja jest wszechobecną modyfikacją 5' RNA w biologii i jest coraz częściej stosowana w zastosowaniach biotechnologicznych. Przedstawiony tutaj protokół umożliwia trifosforylację 5' dowolnego oligonukleotydu przygotowanego w drodze standardowej automatycznej syntezy. Trifosforylacja chemiczna działa na oligonukleotydy zawierające RNA, DNA lub nienaturalny kwas nukleinowy.Tutaj trifosforylowane lewoskrętne L-RNA, enancjomer biologicznego D-RNA, jest syntetyzowany, oczyszczony i stosowany w reakcji rybosomowej. Trifosforylację przeprowadza się po zautomatyzowanej syntezie oligonukleotydów i przed deprotekcją. Te kroki nie są tutaj pokazane, ale badacze powinni być zaznajomieni ze standardowymi metodami dla obu.Na początek upewnij się, że przestrzeń robocza do fosforylacji ma kolektor gazowy z co najmniej dwiema liniami i bełkotką podłączoną do suchego źródła argonu o regulowanym ciśnieniu, ponieważ reakcja trifosforylacji musi być przeprowadzana w argonie. Następnie przymocuj jednomililitrowe plastikowe strzykawki do przewodów, aby ułatwić podłączenie do aparatu reakcyjnego. Następnie zbierz sprzęt, w tym jedną mililitrową plastikową strzykawkę, trójdrożny polipropylenowy kurek, igły nierdzeniowe, 1,5-mililitrowe rurki polipropylenowe, małą metalową szpatułkę i przechowuj je w szczelnie zamkniętym pojemniku lub eksykatorze ze środkiem osuszającym w temperaturze pokojowej przez co najmniej jeden dzień przed użyciem.Pod ciśnieniem argonu pobrać 30 mililitrów bezwodnego 1,4-dioksanu z szczelnie zamkniętej butelki. Przełóż do wysuszonej szklanej butelki o pojemności 30 mililitrów i dodaj pułapkę suszącą. Uszczelnić gumowymi przegrodami i przechowywać w eksykatorze ze środkiem osuszającym.Podobnie przygotuj 30 mililitrów N, N-dimetyloformamidu, acetonitrylu i mieszaniny trzech części dioksanu i jednej części pirydyny objętościowo. Przygotować roztwór TBAP, mieszając stały pirofosforan tributyloamonu z dimetyloformamidem i tributyloaminą w szklanej butelce o pojemności 30 mililitrów, jak opisano w manuskrypcie. Dodaj trzy zalewki rysunkowe.Zamknij butelkę gumową przegrodą pod argonem i bąbelkuj argonem przez 30 minut. Po przygotowaniu oligonukleotydu z wolnym 5'hydroksylem na kolumnie syntezacyjnej przy użyciu automatycznego syntezatora DNA/RNA. Przygotować komorę, wyjmując tłok z suchej strzykawki o pojemności jednego mililitra.Odciąć górną część strzykawki za pomocą nożyczek lub żyletki i przymocować strzykawkę do kolumny syntezy. Do górnej części strzykawki przymocować trójdrożny zawór odcinający i przymocować boczny wlot kranu do źródła suchego argonu za pomocą bełkotki tak, aby górny wlot kranu działał jak port do wstrzykiwania odczynnika. Przymocuj ten napęd do stojaka za pomocą zacisków i uszczelnij wszystkie połączenia przed nim woskową folią uszczelniającą.Następnie wyreguluj zawór odcinający tak, aby otwór wtryskowy był zamknięty, a aparat był otwarty na źródło argonu. Zamknij bełkotkę i pozwól, aby argon pod niskim ciśnieniem przepływał przez komorę działania przez pięć minut. Po ponownym otwarciu bełkotki przymocuj strzykawkę do dna kolumny syntezy, która będzie strzykawką na odpady.Następnie kilkakrotnie przeciągnąć argon przez kolumnę za pomocą strzykawki na odpady, a następnie ponownie założyć strzykawkę z całkowicie wciśniętym tłokiem. Aby dodać odczynnik lub rozpuszczalnik, przymocuj igłę do źródła suchego argonu i włóż ją do przegrody butelki z odczynnikiem lub rozpuszczalnikiem, uważając, aby nie zanurzyć igły w zawartości butelki. Następnie zmontować suchą strzykawkę z igłą i włożyć ją do przegrody butelki z odczynnikiem lub rozpuszczalnikiem, nie zanurzając jej w zawartości butelki.Następnie napełnić strzykawkę argonem, wyjąć igłę z przegrody i usunąć argon. Po napełnieniu strzykawki argonem i ponownym wydaleniu, należy napełnić strzykawkę wymaganą objętością rozpuszczalnika lub odczynnika pod ciśnieniem argonu. Wyreguluj zawór odcinający tak, aby źródło argonu było zamknięte, a otwór wtryskowy otwarty.Po szybkim wyregulowaniu ogranicznika na aparacie, wyjmij napełnioną strzykawkę i igłę z butelki źródłowej, zetrzyj rozpuszczalnik przyklejony do boku lub końcówki igły, a następnie włóż igłę do portu iniekcyjnego. Po wyrzuceniu odczynnika do antykomory operatorów, wyjmij igłę i zamknij port iniekcyjny, jednocześnie ponownie otwierając aparat do źródła argonu. Delikatnie pobrać ciecz z antykomory przez całą drogę przez kolumnę syntezy za pomocą strzykawki na odpady, tak aby cały płyn został teraz zatrzymany w strzykawce na odpady.Teraz powoli wepchnij roztwór z powrotem do kolumny syntezy, upewniając się, że w kolumnie nie ma pęcherzyków gazu. Aby wymieszać lub wymieszać, delikatnie przeciągnąć roztwór w górę i w dół po kolumnie za pomocą strzykawki na odpady. Aby usunąć odczynnik lub rozpuszczalnik z kolumny, powoli wciągnąć roztwór do strzykawki z odpadami.Po tym, jak większość roztworu przejdzie do strzykawki na odpady, należy przeciągnąć przez nią argon, aby wypłukać pozostały rozpuszczalnik z kolumny. Następnie usuń woskową folię uszczelniającą wokół złącza strzykawki na odpady. Następnie wyjąć strzykawkę i wyrzucić roztwór odpadu.Następnie wymienić strzykawkę na zużytą strzykawkę na nową suchą strzykawkę i ponownie uszczelnić złącze. Po zmontowaniu aparatu do trifosforylacji należy rozpocząć reakcję trifosforylacji od dodania 200 mikrolitrów dioksanu pirydyny do antykomory, jak wykazano wcześniej. Ale nie ciągnij jeszcze próbki do kolumny syntezowej.Po rozpuszczeniu SalPCl w dioksanie zgodnie z opisem w manuskrypcie, dodać go do antykomory i załadować do kolumny syntezatora za pomocą suchej strzykawki. Następnie pozwól mu reagować przez 15 minut, a następnie usuń i wyrzuć roztwór SalPCl za pomocą strzykawki na odpady, jak pokazano powyżej. Natychmiast po usunięciu roztworu SalPCl dodać 250 mikrolitrów roztworu TBAP do antykomory i załadować do kolumny syntezacyjnej.Pozwól mu reagować przez 20 minut mieszaniem i wyrzuć, jak opisano wcześniej. Następnie przepłukać kolumnę 0,5 mililitra N, N-dimetyloformamidu, a następnie 0,5 mililitra acetonitrylu, usuwając rozpuszczalnik po każdym dodaniu. Po dodaniu roztworu utleniacza, usunięciu go i ponownym umyciu kolumny acetonitrylem przy użyciu tej samej procedury, którą pokazano, zdemontować aparat i umyć kolumnę pięcioma mililitrami acetonitrylu.Następnie wysusz kolumnę. Rozszczepić trifosforylowany oligonukleotyd od stałego podłoża i zdetektować przy użyciu standardowych protokołów opisanych w manuskrypcie. Następnie rozpuszczono wysuszony odchroniony oligonukleotyd w buforze ładującym mocznik, podgrzano do 80 stopni Celsjusza, a następnie załadowano na żel poliakrylamidowy i uruchomiono przez jedną do dwóch godzin z mocą od 25 do 35 watów.Na zakończenie elektroforezy żelowej, po wyjęciu płytki żelowej, należy ją zdemontować i owinąć żel folią z polichlorku winylu. Następnie zidentyfikuj pasma produktu poprzez cieniowanie wsteczne światłem UV o długości 254 nanometrów i wytnij główne pasmo produktu za pomocą żyletki. Zmiażdżyć wycięty żel, wytłaczając go przez plastikową strzykawkę lub mechanicznie.W przypadku oligonukleotydów krótszych niż 15 nukleotydów należy eluować w trzykrotności objętości żelu wolnej od nukleazy przez co najmniej 12 godzin, mieszając lub wstrząsając. Następnie usunąć stałe kawałki żelu, przepuszczając roztwór przez strzykawkę wyposażoną w filtr 0,2 mikrometra i zagęścić przez liofilizację. Po zagęszczeniu usunąć pozostałości soli i saluty za pomocą jednorazowej kolumny wykluczającej rozmiar i zagęścić przez liofilizację, jak pokazano wcześniej.Po przygotowaniu 10 mikrolitrów roztworu RNA zawierającego rybozym polimerazy i matrycę startera L-RNA oraz trinukleotydy trifosforanowe, jak opisano w manuskrypcie, wyżarzaj go, podgrzewając do 90 stopni Celsjusza przez jedną minutę i schładzając do 23 stopni Celsjusza w temperaturze 0,2 stopnia Celsjusza na sekundę w termocyklerze PCR. Po inkubacji roztworu RNA w temperaturze 17 stopni Celsjusza, zatrzymaj reakcję, dodając 10 mikrolitrów o podwójnym stężeniu buforu startowego w miarę postępu reakcji, weź 10 mikrolitrów podwielokrotności i schładzaj pięcioma mikrolitrami 0,5 molowego EDTA przy pH 8 i przetwarzaj każdą próbkę w celu wyizolowania RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie. Rozpuść wytrącony RNA w 10 mikrolitrach sformalizowanego żelowego buforu ładującego i przygotuj nieprzereagowany starter znakowany na końcu, jak opisano w tekście.Po przygotowaniu próbek podgrzej je do 80 stopni Celsjusza. Załaduj pięć mikrolitrów próbki do każdej studzienki i uruchom żel z mocą 40 watów przez około 40 minut. Po wyjęciu płytki żelowej ze stojaka zeskanuj za pomocą skanera żelowego fluorescencyjnego lub fosforyzującego, aby uwidocznić krzyżowe chiralne produkty przedłużania L-RNA.Po oczyszczeniu żelu, cieniowanie wsteczne UV ujawnia obecność 5'trifosforanu jako pojedynczego głównego produktu, jak pokazano dla trimerów DNA AAA i CCC oraz trimera GAA L-RNA. Produkt boczny 5'hydroksylu jest często widoczny jako wolniej migrujące prążko, które zostało wyizolowane i zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas dla trimerów DNA. Dodatkowe prążki podczas oczyszczania żelu korelują z produktami ubocznymi 5'difosforanu, monofosforanu i H-fosfonianów w spektrometrii mas nieoczyszczonych produktów reakcji.Produkty 5'trifosforanowe wykazują pierwotny pik masy odpowiadający 5'trifosforanowi wraz z masami 5'di i monofosforanowymi. Chemicznie trinukleotydy L-RNA związane z trifosforanem zastosowano ze starterem L-RNA i matrycą L-RNA w reakcji polimeryzacji RNA analizowanej przez PAGE i obrazowanej za pomocą skanera fluorescencyjnego żelu. Rozszerzony produkt oznaczony czarnymi kółkami wykazał syntezę wersji L-RNA rybozymu młota kodowanego przez matrycę.Wystawienie na działanie wody podczas trifosforylacji zmniejszy plon. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby przygotować suche odczynniki i ostrożnie zmontować aparaturę reakcyjną. Płyny należy powoli przepuszczać przez urządzenie, aby uniknąć pęknięcia uszczelek.Trifosforylacja chemiczna jest niezbędna do wytwarzania niebiologicznych trifosforanów oligonukleotydów, w tym lewoskrętnego RNA. Umożliwiło to krzyżową syntezę rybozymu chiralnego w lustrzanych odbiciach cząsteczek RNA znalezionych w biologii.

chemical-triphosphorylation-of-oligonucleotides

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Raportujemy protokoły syntezy i oczyszczania oligomerów peptydowych kwasów nukleinowych (PNA) zawierających zmodyfikowane pozostałości. Opisano biochemiczne i biofizyczne metody charakterystyki rozpoznawania dupleksów RNA przez zmodyfikowane PNA.

Specyficzne dla sekwencji i selektywne rozpoznawanie dwuniciowych RNA na jednoniciowych RNA za pomocą chemicznie modyfikowanych peptydowych kwasów nukleinowych

Białka, które wiążą określone sekwencje RNA, odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Szczegółowa charakterystyka tych miejsc wiązania ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisano jednoetapowe podejście do mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA. Podejście to jest istotne dla wszystkich miejsc wiązania białek w RNA.

Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Opisano trójwymiarowy (3D) system hodowli dla hematopoezy z wykorzystaniem ludzkiej krwi pępowinowej oraz komórek szpiku kostnego z białaczką. Metoda opiera się na zastosowaniu porowatego syntetycznego rusztowania z poliuretanu pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej. Rusztowanie to można dostosować do hodowli szerokiego zakresu komórek.

Ex vivo naśladowanie prawidłowej i nieprawidłowej hematopoezy u ludzi

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Urządzenia milifluidyczne są wykorzystywane do kontrolowanej syntezy nanomateriałów, czasowo-rozdzielczej analizy mechanizmów reakcji i katalizy ciągłego przepływu.

Millifluidyka do syntezy chemicznej i czasowo-rozdzielczych badań mechanistycznych

Poznaj metodę chemicznej trifosforylacji oligonukleotydów 5' przy użyciu salicylofosforochloridytu i pirofosforanu. Protokół umożliwia syntezę trifosforylowanych oligonukleotydów o dowolnej sekwencji, w tym niestandardowego L-RNA.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

Przeglądaj więcej filmów