Indukcja stanu zapalnego powierzchni oka i gromadzenie zajętych tkanek
4 sierpnia 2022
Zapalenie powierzchni oka uszkadza tkanki powierzchni oka i zagraża funkcjom życiowym oka. Niniejszy protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia oka i zbierania uszkodzonych tkanek w mysim modelu dysfunkcji gruczołów Meiboma (MGD).
Protokół ten kolejno opisuje etapy związane z indukcją zapalenia powierzchni oka i pobraniem powiązanych dotkniętych chorobą narządów zaangażowanych w dysfunkcję gruczołów Meiboma. Ten nowy model MGD umożliwia badanie wrodzonego immunologicznego aspektu choroby, w szczególności tworzenia zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili zamykających gruczoł Meiboma. Technika przedstawiona w protokole może zostać rozszerzona o wprowadzenie miejscowych interwencji terapeutycznych w fazie przedklinicznej.
Co więcej, zbiór wysięków i narządów ocznych odzwierciedla skuteczność leczenia. Aby wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu immunogenu, przytrzymaj delikatnie za ogon siedmio- do dziewięciotygodniową czarną sześcioletnią samicę myszy C57 bez znieczulenia, chwytając siatkę klatki. Następnie mocno przytrzymaj skórę pleców i szyi między kciukiem a palcem wskazującym i przymocuj ogon i kończyny dolne między palcem serdecznym a małym do dłoni.
Trzymając mysz nieruchomo głową w dół, wstrzyknij 100 mikrolitrów przygotowanego roztworu immunogenowego w prawy lub lewy kwadrant dolnej jamy brzusznej. Aby wykonać prowokację powierzchni oka po szczepieniu, nałóż pięć mikrolitrów albuminy jaja kurzego lub komórek jajowych lub soli fizjologicznej na oko znieczulonej myszy i odczekaj pięć minut, aż kropla zostanie wchłonięta przez oko. Następnie zbierz wysięk z oka, nakładając 50 mikrolitrów sterylnej soli fizjologicznej na oko natychmiast po prowokacji.
W celu wycięcia tkanek powierzchni oka umieść mysz na równej powierzchni i zdezynfekuj obszar oczodołu wokół oka wacikiem o stężeniu 70% etanolu. Aby utworzyć nacięcie wokół oka, wykonaj nacięcie między uchem a zatoką zadoczodołową oraz wzdłuż powierzchni nad kością płaskonabłonkową pionowo, przedłużając nacięcie poziomo poniżej dolnej powieki wzdłuż kości szczęki i powyżej górnej powieki wzdłuż kości czołowej. Ostrożnie przytrzymaj wypreparowaną tkankę wokół oka za pomocą zakrzywionych kleszczy i wyciągnij tkankę i gałkę oczną.
Umieścić wycięte narządy w sterylnym PBS. Następnie za pomocą skalpela pod mikroskopem stereoskopowym przyciąć nadmiar tkanki mięśniowej twarzy wokół wyciętych górnych powiek. Aby zebrać spojówkę, umieść górną powiekę na suchej szalce Petriego.
Następnie za pomocą cienkiej pęsety i skalpela delikatnie zetrzyj białawą warstwę śluzu z wewnętrznej powierzchni powieki. Następnie, aby wypreparować rogówkę, umieść gałkę oczną na nowej suchej szalce Petriego na suchym lodzie. Po trzech minutach połóż naczynie na powierzchni ławki w stabilnej pozycji.
Użyj cienkich, ostrych nożyczek, aby wykonać małe nacięcie na granicy rogówki obok rąbka. Kontynuuj nacięcie skalpelem wokół gałki ocznej, oddzielając twardówkę od rogówki. Następnie usuń resztki tęczówki i soczewek z tyłu rogówki, obficie spłukując roztworem soli fizjologicznej.
Aby ocenić gruczoł Meiboma i jego otwory, umieść wycięte powieki w pozycji pionowej pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie, zgodnie z czasem naświetlania aparatu i ustawieniami ISO, rób zdjęcia w świetle białym. Aby ocenić obszar gruczołu Meiboma, umieść wycięte powieki w pozycji poziomej i włącz podświetlenie mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę na podczerwień.
Rób zdjęcia, dostosowując czas ekspozycji zgodnie z czułością ISO aparatu. Myszy, którym podawano sól fizjologiczną, wykazywały zdrowe powierzchnie oczu z szeroko otwartymi oczami. Dla porównania, podanie komórek jajowych wywołuje ciężkie zapalenie powierzchni oka, wąskie otwarcie oczu i objawy chemozy.
Wycięte powieki wykazywały duże okluzje zatykające ujścia gruczołu Meiboma i obrzęk, w przeciwieństwie do zdrowych powiek pokazujących małe zatyczki gruczołu wyściełającego powiekę. Dalsze badania transiluminacji gruczołu w podczerwieni ujawniają racemiczny wygląd acini gruczołu Meiboma. Powieki myszy z solą fizjologiczną wykazywały okrągłe acini.
Dla porównania, podanie komórek jajowych spowodowało zniszczenie i utratę niektórych gruczołów z alergiczną chorobą oczu lub AED. Analiza histologiczna powiek wykazała rozszerzone gruczoły Meiboma w porównaniu z myszami, którym podawano tylko sól fizjologiczną. Inkubacja gałki ocznej na suchym lodzie pozwoliła na nacięcie rogówki obok rąbka i oddzielenie rogówki od twardówki.
Badanie to ułatwiło pobranie rogówki. Ponadto podanie komórek jajowych spowodowało ciężkie zapalenie spojówki z przekrwieniem. Podwyższone poziomy chemokiny CXCL-1 ułatwiają wynaczynienie neutrofili, fagocytozę i degranulację, a interleukinę-6 pośredniczącą w odpowiedzi ostrej fazy i infiltracji neutrofili zaobserwowano w supernatantach myszy AED.
Z drugiej strony, stężenie interleukiny-10 nie wykazało znaczących zmian zarówno u myszy naiwnych, jak i myszy z AED. Ten nowy model umożliwia opracowanie i ocenę skuteczności leków, które są ukierunkowane na wrodzone szlaki odpornościowe i jest bardzo pomocny w eksploracji danych dotyczących sposobu podawania środków przeciwzapalnych. Po odpowiednim pobraniu narządów, metody o wysokim stopniu multipleksu, takie jak sekwencjonowanie pojedynczych komórek i obrazowa cytometria masowa, są zgodne z tym protokołem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia powierzchni oka i pobierania uszkodzonych tkanek w myszym modelu dysfunkcji gruczołów Meibomiusza (MGD). Technika ta umożliwia badanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w MGD, szczególnie koncentrując się na pozakomórkowych pułapkach neutrofili.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Oftalmologia
- Immunologia
Tło
- Zapalenie powierzchni oka może uszkodzić tkanki oka.
- Dysfunkcja gruczołów Meibomiusza jest częstą chorobą oka.
- Zrozumienie odpowiedzi immunologicznych w MGD jest kluczowe dla opracowania terapii.
- Pozakomórkowe pułapki neutrofili mogą odgrywać rolę w patologii MGD.
Cel badania
- Ustanowienie wiarygodnego modelu mysiego dla MGD.
- Zbadanie mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w zapaleniu powierzchni oka.
- Ocenienie skuteczności potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Stosowane metody
- Wywoływanie zapalenia powierzchni oka u myszy.
- Pobieranie wysięku okołorogówkowego i dotkniętych narządów.
- Wstrzyknięcie dootrzewnowe roztworu immunogennego.
- Ocena skuteczności leczenia poprzez zebrane próbki.
Główne wyniki
- Skuteczne wywołanie zapalenia oka w modelu mysim.
- Identyfikacja pozakomórkowych pułapek neutrofili w gruczołach Meibomiusza.
- Wykazane potencjalne zastosowania interwencji terapeutycznych.
- Metody pobierania okazały się skuteczne w ocenie wyników leczenia.
Wnioski
- Ustalony model jest wartościowy do badania MGD.
- Wgląd w odpowiedzi immunologiczne może przewodzić przyszłe terapie.
- Wymagane są dalsze badania w celu zbadania opcji leczenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Inducing ocular surface inflammation and collecting affected tissues in a mouse model enables mechanistic de-risking of Meibomian gland dysfunction (MGD) and innate immune pathways. This protocol supports predictive confidence in evaluating anti-inflammatory interventions at the preclinical stage, directly informing target validation and translational continuity for ocular surface disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of innate immune mechanisms, including neutrophil extracellular trap formation in MGD.
- Supports functional target validation for anti-inflammatory drug candidates in ocular surface disorders.
- Facilitates biological de-risking by clarifying the contribution of immune cell activity to gland dysfunction.
Screening & Assay Development
- Provides validated tissue collection and exudate sampling for downstream quantitative assays.
- Standardizes morphological and histopathological readouts for reproducible assessment of intervention efficacy.
- Prepares disease-relevant samples for multiplexed analytical platforms such as single cell sequencing and imaging mass cytometry.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant immune and morphological endpoints for translational biomarker development.
- Enables risk-adjusted advancement of anti-inflammatory agents targeting ocular surface inflammation.
- Supports continuity from mechanistic discovery through preclinical validation of therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through preclinical evaluation, supporting lead identification and translational research for ocular surface inflammation and MGD.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on immune-mediated gland dysfunction and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tissue and exudate outputs for assay development.
- Analytics: Enables measurement of chemokines, cytokines, and morphological changes to compare intervention effects.
- Translational Research: Provides disease-relevant endpoints for biomarker alignment and preclinical decision-making.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse anti-inflammatory strategies in ocular models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ocular inflammation research.
- Operational Value: Standardizes tissue collection and analysis for reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust preclinical evaluation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-inflammatory candidates for ocular surface diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine ocular tissue dissection and immunological techniques.
- Needs access to imaging, histopathology, and multiplexed analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization for tissue processing and quantitative readouts.
- Adaptable to various ocular surface disease models with protocol modifications.
- Limitations include model-specific immune responses and translation to human pathology.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Induction of Murine Ocular Surface Inflammation and Collection of Ocular Exudates
1:54
Excision of Ocular Surface Tissues from the Euthanized Mouse
3:30
Documentation of Meibomian Gland (MG) Obstruction and Trans-Illumination of Eyelids (MG Morphology)
4:08
Results: Morphological and Histopathological Features of MG Dysfunction and Investigation of Topical and Systemic Anti-Inflammatory Interventions
5:59
Conclusion
