Name: Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Protokół ten zapewnia wysoką wydajność izolacji z minimalnym współwzbogaceniem białek niebędących pęcherzykami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie ze strony College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award i College Research Council Shared Research Program dla NKG oraz finansowanie przez ATCC (nagroda # 2016-0550-0002) dla KMD. Chcielibyśmy również podziękować Anne Simpson za wsparcie techniczne i BEI Resources, NIAID, NIH za następujące odczynniki: Monoklonalny Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763), IT-54 (produkowany in vitro), NR-13792, Monoklonalny Anti-My-Mybacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Klon IT-3 (SA-12) (produkowany in vitro), NR-49223 i Monoklonalny Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Klon CS-35 (produkowany in vitro), NR-13811.

Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Stanowego Kolorado zatwierdził niniejsze badanie (19-046B). Hodowla prątków gruźlicy i zbiór supernatantów z kultur bogatych w EV przeprowadzono przez przeszkolony personel w laboratorium o wysokim stopniu hermetyzacji. Materiały zostały wyprowadzone z obszaru o wysokim stopniu hermetyczności po przeprowadzeniu, potwierdzeniu i zatwierdzeniu prawidłowej metody inaktywacji przez instytucjonalne polityki bezpieczeństwa biologicznego. Podczas powielania protokołu, jeśli zwalidowana metoda inaktywacji lub sterylnej filtracji nie jest wykonalna, należy wykonać następujące procedury w laboratorium o wysokim stopniu hermetyzacji.
1. Przygotowanie surowego koncentratu Mtb EV
UWAGA: Szczegółowe procedury dotyczące uprawy Mtb i przygotowania białka filtratu kulturowego (CFP) można znaleźć w Bibliografii11,12. Zaleca się, aby pożywki do hodowli bakteryjnych były wolne od suplementów wzrostu zawierających EV lub składników białkowych, takich jak albumina oleinowa i katalaza dekstrozy (OADC) oraz detergentów, takich jak Tween. Zaleca się również, aby jakość kultury bakteryjnej i zebrany CFP były badane przesiewowo, aby zapewnić ograniczoną śmierć komórek i lizę13,14.
<ol>
	<li>Przygotować filtr odśrodkowy o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO) (patrz tabela materiałów), dodając pełną objętość soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (1x PBS). Wirować przez 5 minut w temperaturze 2.800 x g w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z filtra bez martwej objętości należy zadbać o to, aby objętość próbki nie zmniejszyła się poniżej poziomu filtra, co spowodowałoby całkowite wysuszenie filtra podczas wirowania.</li>
	<li>Odrzucić przepływowy i pozostały PBS przed napełnieniem komory na próbkę Mtb CFP do maksymalnej pojemności. Odwirować przy 2 800 x g w temperaturze 4 °C do momentu, gdy objętość zmniejszy się do minimalnej objętości urządzenia do ultrafiltracji. Powtórz w razie potrzeby, dodając więcej CFP do urządzenia, aż cała próbka zostanie wystarczająco zredukowana. 
	UWAGA: W razie potrzeby zachowaj część materiału przepływowego 100 kDa (100F) do dalszej kwalifikacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1x PBS do jednostki filtrującej zawierającej koncentrat do całkowitej pojemności urządzenia. Zmniejsz głośność zgodnie z opisem w 1.2. Powtórz ten krok pięć razy, aby zapewnić całkowite umycie i wymianę bufora.</li>
	<li>Odzyskać skoncentrowany retentat CFP o stężeniu 100 kDa (100R) zgodnie ze specyfikacją urządzenia do ultrafiltracji (patrz tabela materiałów). Po odzyskaniu 100R umyj filtr minimalną objętością 1x PBS co najmniej trzy razy i połącz płukanie z 100R, aby zmaksymalizować odzysk.</li>
	<li>Określić ilościowo materiał 100R za pomocą testu bicynkonicznego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Aby wykonać test, użyj kilku rozcieńczeń próbek 1:2, 1:5 i 1:10 w PBS. Zbadać próbkę w trzech egzemplarzach. 
	UWAGA: W razie potrzeby zachowaj część materiału 100R do dalszej kwalifikacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Chromatografia wykluczania wielkości do wzbogacania Mtb EV z CFP
UWAGA: Poniższa procedura jest specyficzna dla użycia 3 mg 100R Mtb CFP z kolumną SEC i automatycznym kolektorem frakcji (AFC, patrz Tabela Materiałów). Można go dostosować do innych stężeń początkowych i typów kolumn, postępując zgodnie ze specyfikacjami producenta. Dodatkowo użytkownikom zaleca się przeczytanie i zrozumienie instrukcji obsługi automatycznego kolektora frakcji.
<ol>
	<li>Pozwól, aby kolumna SEC zrównoważyła się do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Włącz AFC za pomocą wyłącznika zasilania z tyłu jednostki wieżowej i w razie potrzeby dostosuj ustawienia ogniwa obciążnikowego, naciskając przycisk SETUP na ekranie dotykowym menu głównego. Czujnik wagowy należy kalibrować tylko przy pierwszym użyciu, po każdej aktualizacji oprogramowania i w przypadku zauważenia niespójności w objętościach zbierania frakcji.</li>
	<li>Na ekranie SETUP (Konfiguracja) wyrównaj karuzelę, wybierając opcję KARUZELA > KALIBRUJ. Włóż karuzelę z 13 małymi otworami skierowanymi do góry do wieży AFC i wyreguluj karuzelę tak, aby dysza płynu znajdowała się bezpośrednio nad pozycją spłukiwania, naciskając przyciski - i/lub +.</li>
	<li>Usuń zaślepki z zrównoważonej kolumny SEC. Wsuń kolumnę SEC do odpowiedniego uchwytu kolumny i ostrożnie zainstaluj ją na wieży AFC. Upewnij się, że znacznik identyfikacji radiowej (RFID) na kolumnie jest skierowany w stronę AFC i sprawdź, czy połączenie między kolumną a zaworem jest bezpieczne. Umieść rurkę odprowadzającą odpady w pojemniku zbiorczym.</li>
	<li>Na ekranie SETUP wybierz Harmonogram odbioru i ustaw liczbę na 13, a rozmiar na 0.5 ml, naciskając przyciski - i/lub +. Pozostaw ustawienie "Objętość bufora" jako domyślne 2,7 ml, a następnie zamknij okno "Harmonogram odbioru", naciskając X.</li>
	<li>Wybierz ROZPOCZNIJ KOLEKCJĘ na ekranie głównym i potwierdź parametry zbierania, wybierając TAK. Załaduj 13 oznaczonych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml z otwartymi pokrywkami i skierowanymi w stronę środka karuzeli.</li>
	<li>Przesuń AFC, wybierając OK, a następnie zamontuj zbiornik kolumny i ponownie przejdź, naciskając OK. Wybierz opcję opróżnienia kolumny, naciskając przycisk TAK, a następnie dodaj jeden wolumin kolumny PBS filtrowanego przez 0,2 μm, aby usunąć bufor magazynu. Po zakończeniu spłukiwania przesuń AFC, naciskając OK.</li>
	<li>Umieść pokrywę karuzeli na AFC i naciśnij OK. Przygotować jedną objętość jednej kolumny z filtrowanym PBS 0,2 μm. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar buforu z kolumny.</li>
	<li>Przynieś 3 mg próbki 100R, jak określono ilościowo w kroku 1.5, do 500 μL z 1x PBS. Dodać próbkę 3 mg na górze kolumny. Przesunąć AFC i pozwolić, aby próbka spłynęła do fryty. Gdy próbka całkowicie wprowadzi się do kolumny, dodać PBS przygotowany w kroku 2.6 do zbiornika.</li>
	<li>Monitoruj przebieg AFC, gdy zbiera on najpierw wolumin pustek, a następnie określone frakcje. Po zakończeniu przebiegu i powrocie karuzeli do pozycji odpadu zdejmij pokrywę i wyjmij rurki z frakcjami z karuzeli. Frakcje należy przechowywać w temperaturze 4 °C przed oznaczaniem ilościowym (etap 3) i kwalifikacją (etap 4).</li>
	<li>Jeśli kolumna ma być ponownie użyta, wybierz opcję czyszczenia kolumny, naciskając przycisk TAK; w przeciwnym razie naciśnij przycisk NIE. Postępuj zgodnie z instrukcjami na AFC. 
	UWAGA: Po umyciu kolumny i przepuszczeniu bufora magazynowego można ją wyjąć, zakryć i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja pojazdów elektrycznych Mtb
<ol>
	<li>Zmierz stężenie białka dla każdej frakcji za pomocą BCA i mikro BCA12.
	<ol>
		<li>W przypadku frakcji o wielkości 0,5 ml pobranych z 3 mg 100R Mtb CFP należy użyć mikro BCA z rozcieńczeniem 1:3 dla frakcji o numerach 1-7 każdej próbki w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>W przypadku frakcji o objętości 0,5 ml o numerach 5-13 należy użyć BCA bez rozcieńczania dla każdej próbki w trzech egzemplarzach. 
		UWAGA: Nakładanie się testów dla frakcji 5-7 pomoże zapewnić, że wszystkie frakcje będą miały czytelne dane wyjściowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie cząstek dla każdej frakcji za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbki w 1 ml 1x PBS, stosując następujące sugerowane proporcje początkowe; dla frakcji 1-3 należy użyć 1:100, a następnie dla pozostałych frakcji użyć rozcieńczenia 1:10.</li>
		<li>Rozcieńczone roztwory należy przemieszać wirowo, a następnie pobrać próbkę do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml. Umieścić strzykawkę w automatycznej pompie strzykawkowej, jeśli jest dostępna.</li>
		<li>Ustaw pompę strzykawkową na 30 μl/min i użyj ustawień przechwytywania wideo z wzmocnieniem ekranu 10-12 i poziomem kamery 10-12. Dostosuj ostrość dla każdej próbki.</li>
		<li>Zbierz co najmniej trzy filmy w ciągu 30 sekund każdy, używając stałego przepływu.</li>
		<li>Wykonaj analizę z progiem wykrywania oprogramowania ustawionym na pięć. 
		UWAGA: Uzyskanie danych NTA dla najnowszych frakcji (>7) bez poświęcenia znacznej objętości próbki może nie być możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kwalifikacja Mtb EV
<ol>
	<li>Wizualizacja ogólnego profilu białkowego każdej frakcji za pomocą żelu białkowego barwionego srebrem. 
	UWAGA: Szczegółowe procedury dla SDS-PAGE i srebrnej plamy można znaleźć w Reference15.
	<ol>
		<li>Dodać bufor próbki SDS do 10 μl każdej frakcji i 5 μg CFP, 100R i 100F. Gotować przez 5 minut w temperaturze 100 °C, a następnie załadować 4%-12% żel Bis-Tris z drabinką masy cząsteczkowej do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (STRONA) (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Uruchomić żel za pomocą 1x buforu do pracy kwasu 2-[N-morfolino]etanosulfonowego (MES) (patrz tabela materiałów) i prądu 200 V przez 35 minut.</li>
		<li>Wyjmij żel z kasety i kontynuuj barwienie srebrem15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń obecność lub brak markerów EV w każdej frakcji za pomocą Western blot. 
	UWAGA: Szczegółowe procedury dotyczące Western blotting można znaleźć w Reference15.
	<ol>
		<li>Uruchom żel SDS-PAGE zgodnie z opisem w krokach 4.1.1-4.1.2.</li>
		<li>Wyjąć żel z kasety i przenieść rozwiązane białka na membranę nitrocelulozową o wielkości 0,2 μm (patrz tabela materiałów), przykładając prąd o napięciu 50 V przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Wykonaj analizę Western blot, aby ocenić interesujące Cię białka. Zaleca się pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko LpqH, lipoarabinomannanowi (LAM) i GroES (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Frakcje pulowe na podstawie obecności lub braku markerów, w zależności od zastosowania w dalszej części łańcucha dostaw.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź obecność nienaruszonych pęcherzyków za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
	<ol>
		<li>Utrwalić 15 μl próbki pęcherzyka, dodając 15 μl 4% paraformaldehydu klasy EM i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Przygotuj siatkę TEM o siatce 200 mesh z miedzi powlekanej węglem, oczyszczając powierzchnię i tworząc hydrofilowe podłoże. 
		UWAGA: Zaleca się czyszczenie plazmowe 95% argonem, 5% tlenem i 30% mocą plazmy przez 1 minutę.</li>
		<li>Upuść 10 μl utrwalonej próbki na siatkę i pozwól próbce przylegać przez 10 minut, a następnie zetrzyj nadmiar cieczy bibułą filtracyjną.</li>
		<li>Unosić siatkę na kropli ultraczystej wody przez 30 s, a następnie zetrzyj nadmiar płynu.</li>
		<li>Unosić siatkę na kropli octanu uranylu klasy d% EM przez 2 minuty, a następnie zetrzeć nadmiar płynu.</li>
		<li>Pozostaw ruszt do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Obraz za pomocą TEM (patrz tabela materiałów) przy napięciu 100 kV lub podobnym. 
		UWAGA: Inne metody oznaczania ilościowego i charakterystyki EV powinny być stosowane w oparciu o dalsze zastosowania. Należy zapoznać się z Minimalnymi informacjami do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych18 w celu uzyskania wytycznych zapewniających rygor i odtwarzalność wszystkich badań EV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921(2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111(2014).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li>
<li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li>
<li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li>
<li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208(1996).</li>
<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022).</li>
<li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li>
<li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans%3A+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li>
<li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe Mycobacterium tuberculosis są wysoce antygenowymi rezerwuarami, co czyni je atrakcyjną drogą do opracowywania narzędzi diagnostycznych i przyszłych szczepionek 4,19,20. Historycznie rzecz biorąc, ultrawirowanie w gradiencie gęstości było stosowane do oddzielania Mtb EV od innych rozpuszczalnych, wydzielanych materiałów8. Chociaż proces ten jest skuteczny, jest również...

Uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) przez patogeny może być kluczem do odblokowania nowych technologii do kontroli chorób zakaźnych1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) jest patogenem o poważnych konsekwencjach, zaraża około jednej trzeciej światowej populacji i odbiera życie milionom ludzi każdego roku2. Produkcja EV przez Mtb jest dobrze udokumentowana, ale nieuchwytna w biogenezie i różnych rolach (tj. immunostymulacyjnych, immunosupresyjnych, pozyskiwania żelaza i składników odżywczych) tych EV w kontekście infekcji3,4,5. Wysiłki mające na celu zrozumienie składu Mtb EV ujawniły kule zamknięte błoną lipidową o długości 50-150 nm, pochodzące z błony plazmatycznej zawierającej lipidy i białka o znaczeniu immunologicznym3,6. Badania nad rolą Mtb EV w fizjologii bakterii ujawniły znaczenie modulacji bakteryjnej EV w odpowiedzi na stres środowiskowy dla przeżycia5. Badania interakcji gospodarz-patogen były bardziej skomplikowane do interpretacji, ale dowody wskazują, że Mtb EV mogą wpływać na odpowiedź immunologiczną gospodarza i mogą potencjalnie służyć jako skuteczny składnik szczepienia3,4,7.
Większość dotychczasowych badań nad pojazdami elektrycznymi Mtb opierała się na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wzbogacenia pęcherzyków8. Okazało się to skuteczne w przypadku badań na małą skalę; Technika ta wiąże się jednak z kilkoma wyzwaniami technicznymi i logistycznymi. Alternatywne przepływy pracy łączą wieloetapowe wirowanie w celu usunięcia całych komórek i dużych zanieczyszczeń, z końcowym etapem ultrawirowania w celu granulowania pojazdów elektrycznych. Metodologia ta może różnić się wydajnością i często skutkuje niską wydajnością i współoczyszczaniem rozpuszczalnych biomolekuł niezwiązanych z pęcherzykami, wpływając jednocześnie na integralność pęcherzyków9. Ponadto proces ten jest czasochłonny, wymaga ręcznej pracy i jest bardzo ograniczony pod względem przepustowości ze względu na ograniczenia sprzętowe.
Obecny protokół opisuje technikę alternatywną dla ultrawirowania gradientu gęstości: chromatografię wykluczającą rozmiar (SEC). Metoda ta została zademonstrowana dla prątków środowiskowych, a w obecnej pracy została ekstrapolowana do Mtb10. Dostępna na rynku kolumna i automatyczny kolektor frakcji mogą poprawić spójność przygotowania pęcherzowego i zmniejszyć konieczność stosowania specjalistycznego, drogiego sprzętu. Możliwe jest również wykonanie tego protokołu w ułamku czasu w porównaniu z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości, co zwiększa przepustowość. Technika ta jest mniej wymagająca technicznie, dzięki czemu jest łatwiejsza do opanowania i może zwiększyć odtwarzalność między i wewnątrz laboratorium. Wreszcie, SEC ma wysoką skuteczność separacji i jest delikatny, zachowując integralność pęcherzyków.

<table><tbody><tr><td>20x bufor do biegania MES SDS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny kolektor frakcji</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Wstępnie barwiona drabinka białkowa</td><td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - 70 Filtr odśrodkowy, odcięcie 100 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>Urządzenie do ultrafiltracji używane w kroku 1.1</td></tr><tr><td>System elektroblottingu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa</td> klasy EM <td>Sciences 15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>FCF200H-Cu-TA</td><td></td></tr><tr><td>Kozia Anty-Mysia IgG H& L (fosfataza alkaliczna), cała cząsteczka, 1 ml</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>JEM-1400 Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Zestaw</td> do oznaczania białek JOEL <td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Czytnik mikropłytek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalny anty-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3814c)</td><td>Zasoby BEI</td><td>NR-49223</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało anty-Mycobacterium tuberculosis LpqH (gen Rv3763)</td><td>Zasoby BEI</td><td>NR-13792</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Mono-Mycobacterium tuberculosis LAM, klon CS-35</td><td>Zasoby BEI</td><td>NR-13811</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Fischione Instruments</td><td></td><td>Do plazmowego czyszczenia siatki TEM</td></tr><tr><td>Nanosight wyposażony w pompę strzykawkową i komputer z oprogramowaniem NanoSight NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa, rolka, 0,2 &mu; m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV Oryginalny 35 nm 5/pk</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>SEC kolumna SDS</td></tr><tr><td>bufor próbki</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>Autorska receptura używana w tej procedurze, jednak ten produkt jest odpowiednikiem</td></tr><tr><td>komory żelowej SDS-PAGE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>Wewnętrzny protokół używany w tej procedurze, jednak ten zestaw jest równoważny</td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

Rola pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w kontekście infekcji bakteryjnej pojawiła się jako nowa droga do zrozumienia fizjologii mikrobiologicznej. W szczególności Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV odgrywają rolę w interakcji gospodarz-patogen i odpowiedzi na stres środowiskowy. Mtb EV są również wysoce antygenowe i wykazują potencjał jako składniki szczepionek. Najpopularniejszą metodą oczyszczania Mtb EV jest ultrawirowanie w gradieniu gęstości. Proces ten ma kilka ograniczeń, w tym niską przepustowość, niską wydajność, zależność od drogiego sprzętu, wyzwania techniczne i może negatywnie wpłynąć na powstałe przygotowanie. Chromatografia wykluczania wielkości (SEC) jest łagodniejszą metodą alternatywną, która zwalcza wiele ograniczeń ultrawirowania. Protokół ten pokazuje, że SEC jest skuteczny w wzbogacaniu Mtb EV i wytwarza wysokiej jakości preparaty Mtb EV o zwiększonej wydajności w szybki i skalowalny sposób. Ponadto porównanie z ultrawirowaniem w gradiencie gęstości za pomocą procedur kwantyfikacji i kwalifikacji pokazuje korzyści płynące z SEC. Podczas gdy ocena ilości EV (analiza śledzenia nanocząstek), fenotypu (transmisyjna mikroskopia elektronowa) i zawartości (Western blotting) jest dostosowana do Mtb EV, zapewniony przepływ pracy można zastosować do innych prątków.

Białko z filtratu hodowli (CFP) z Mycobacterium tuberculosis (Mtb) zostało skoncentrowane, poddane ilościowemu oznaczeniu, a następnie 3 mg materiału naniesiono na kolumnę do chromatografii wykluczania cząsteczkowego (SEC). Stężenia białek oraz cząstek wyznaczono odpowiednio metodą BCA i NTA. Przewidywane zakresy odzysku białek i cząstek oraz dokładne wartości uzyskane w tych wynikach przedstawiono w Tabeli 1. Wartości znacznie przekraczające te zakresy mogą wskazywać na zanieczyszczenie lub pro...

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Protokół ten zmniejsza złożoność techniczną i czas potrzebny do wzbogacenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Mycobacterium tuberculosis, Mtb EVs. Stanowi delikatną alternatywę dla tradycyjnego ultrawirowania i technik opartych na gęstości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do wykonania, dzięki czemu jest bardziej powtarzalna.Zapewnia wysoką wydajność Mtb EV przy minimalnym współwzbogacaniu białek innych niż EV. Procedurę zademonstruje Joanie Ryan, była doktorantka naszego laboratorium. Na początek przygotuj filtr odśrodkowy o masie cząsteczkowej 100 kilodaltonów, dodając pełną objętość PBS.Wirować przez pięć minut w temperaturze 2 800 razy G w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Odrzucić przepływowy i pozostały PBS, a następnie napełnić komorę na próbkę Mtb CFP do jej maksymalnej pojemności. Odwirować przy 2 800 razy G w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż objętość zmniejszy się do minimalnej objętości urządzenia do ultrafiltracji.W razie potrzeby powtarzać czynność, aż cała próbka zostanie wystarczająco zredukowana. Dodać 1X PBS do jednostki filtrującej zawierającej koncentrat do całkowitej pojemności urządzenia. Zmniejsz objętość zgodnie z wcześniejszym opisem i powtórz ten krok pięć razy, aby zapewnić całkowite umycie i wymianę bufora.Następnie odzyskaj 100-kilodaltonowy skoncentrowany retentat CFP lub 100R, zgodnie ze specyfikacją urządzenia do ultrafiltracji. Umyj filtr minimalną objętością 1X PBS co najmniej trzy razy i pociągnij płukanie za pomocą 100R, aby zmaksymalizować odzysk. Użyć kilku rozcieńczeń próbek w PBS i oznaczyć ilościowo materiał 100R za pomocą testu bicynkowego.Zbadać próbkę w trzech egzemplarzach. Pozwolić, aby chromatografia wykluczająca wielkość lub kolumna SEC zrównoważyła się do temperatury pokojowej. Włącz AFC za pomocą wyłącznika zasilania z tyłu jednostki wieżowej i w razie potrzeby naciśnij Setup na ekranie dotykowym menu głównego, aby dostosować ustawienia ogniwa obciążnikowego.Na ekranie konfiguracji wyrównaj karuzelę, wybierając Karuzela, a następnie Kalibruj. Włóż karuzelę z 13 małymi otworami skierowanymi do góry do wieży AFC i wyreguluj karuzelę, naciskając przyciski minus lub plus tak, aby dysza płynu znajdowała się bezpośrednio nad pozycją spłukiwania. Zdejmij zaślepki ze zrównoważonej kolumny SEC i wsuń kolumnę SEC do odpowiedniego mocowania kolumny.Ostrożnie zainstaluj go na wieży AFC. Upewnij się, że znacznik identyfikacji radiowej na kolumnie jest skierowany w stronę AFC i sprawdź, czy połączenie między kolumną a zaworem jest bezpieczne. Umieść rurkę odprowadzającą odpady w pojemniku zbiorczym.Na ekranie konfiguracji wybierz Harmonogram odbioru i ustaw liczbę na 13, a rozmiar na 0,5 mililitra, naciskając przyciski minus lub plus. Pozostaw ustawienie woluminu buforu jako domyślne 2,7 mililitra, a następnie zamknij okno harmonogramu zbierania. Wybierz pozycję Rozpocznij kolekcję na ekranie głównym i potwierdź parametry kolekcji, wybierając pozycję Tak.Załaduj 13 oznaczonych 1.7 mililitrowych probówek wirówkowych z otwartymi pokrywkami i skierowanymi w stronę środka karuzeli. Przesuń AFC, wybierając OK, a następnie zamontuj zbiornik kolumny i ponownie przejdź, naciskając OK. Wybierz opcję opróżnienia kolumny, naciskając przycisk Tak, a następnie dodaj jeden wolumin kolumny PBS filtrowany przez 0,2 mikrometra, aby usunąć bufor magazynowania. Po zakończeniu spłukiwania przesuń AFC, naciskając OK. Umieść osłonę karuzeli na AFC i naciśnij OK. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar buforu z kolumny.Przynieś trzy miligramy próbki 100R do 500 mikrolitrów za pomocą 1X PBS i dodaj próbkę na górze kolumny. Przygotować jedną objętość jednej kolumny z przefiltrowanym PBS o grubości 0,2 mikrometra. Przesuń AFC i pozwól, aby próbka wpadła do progu.Gdy próbka całkowicie wprowadzi się do kolumny, należy dodać przygotowany wcześniej PBS do zbiornika. Monitoruj przebieg AFC, gdy zbiera on najpierw wolumin pustek, a następnie określone frakcje. Po zakończeniu cyklu i powrocie karuzeli do pozycji odpadu zdejmij pokrywę i rurki z frakcjami z karuzeli.W przypadku frakcji o wielkości 0,5 milimetra pobranych z trzech miligramów 100R Mtb CFP należy zmierzyć stężenie białka za pomocą mikro-BCA z rozcieńczeniem 1:3 dla frakcji o numerach od 1 do 7 każdej próbki w trzech egzemplarzach. W przypadku frakcji o wielkości 0,5 mililitra ponumerowanych od 5 do 13 należy użyć BCA bez rozcieńczania dla każdej próbki w trzech egzemplarzach. Dodać bufor próbki SDS do 10 mikrolitrów każdej frakcji i pięciu mikrogramów CFP i 100R.Gotować przez pięć minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Następnie załaduj 4 do 12% żel Bis-Tris z drabinką masy cząsteczkowej do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym lub PAGE. Uruchom żel SDS-PAGE za pomocą bufora do pracy 1X MES i prądu 200 V przez 35 minut.Wyjmij żel z kasety i przyłóż prąd o napięciu 50 V przez co najmniej godzinę, aby przenieść rozwiązane białka do membrany nitrocelulozowej o średnicy 0,2 mikrometra. Na koniec wykonaj analizę Western blot, aby ocenić białka. Żel SDS-PAGE barwiony srebrem pokazuje ogólny profil białkowy dla każdej frakcji.Z danych wynika, że późniejsze frakcje zawierają więcej białka i przypominają materiał 100R. Western blot wykrywający LAM, LpqH i GroES pokazuje, że marker białkowy zmienia się we frakcjach. Pokazano tutaj transmisyjną mikroskopię elektronową lub obrazy TEM frakcji SEC od 1 do 3 pobranych przed utrwaleniem.Ultrawirowanie w gradiencie gęstości Mtb EV było barwione ujemnie do obrazowania TEM. Analiza śledzenia nanocząstek, czyli rozkład NTA, frakcji SEC od 1 do 3 jest pokazana tutaj. Ultrawirowanie Mtb EV w gradimencie gęstości przeanalizowano za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, a rozkład wielkości jest wyświetlany tutaj.Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem oczyszczania EV z trzech miligramów 100R. Jeśli ładunek białka jest zróżnicowany, zalecana strategia rozcieńczania i BCA dla otrzymanych frakcji może wymagać dostosowania. Mtb EV przygotowane tą techniką mogą być wykorzystywane do dalszych badań kompozycyjnych i omicznych.Nadają się również do eksperymentów in vitro i in vivo. Technika ta zapewnia łatwy i wydajny sposób wytwarzania wysokiej jakości preparatów Mtb EV, torując drogę do zwiększenia powtarzalności w przyszłych eksperymentach Mtb EV.

mycobacterium-tuberculosis-extracellular-vesicle-enrichment-through

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki z ograniczoną ilością żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje stopniową izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Mycobacterium tuberculosis hodowanych w warunkach ograniczających żelazo, które naśladują środowisko gospodarza. Przedstawiono w nim zastosowanie ultrafiltracji, wirowania różnicowego i separacji gradientu gęstości w celu wzbogacenia i...

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających syderofory z Mycobacterium tuberculosis

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

W tym filmie demonstrujemy technikę - chromatografię wykluczania wielkości - do oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej lub OMV pochodzących od bakterii. Pęcherzyki te są sferycznymi strukturami o rozmiarach nano i są dzielone na duże i małe subpopulacje na podstawie ich wielkości za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Chromatografia wykluczania wielkości Separacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii: technika oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych na podstawie ich wielkości

Ten film demonstruje izolację i koncentrację białek filtratu kultur bakteryjnych, w tym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii, przy użyciu ultrafiltracji. Skoncentrowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe służą jako markery diagnostyczne do wykrywania choroby.

Zagęszczenie białka filtratu kultur bakteryjnych za pomocą urządzenia do ultrafiltracji

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Mycobacterium tuberculosis wykazuje zwiększoną produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na warunki niskiego poziomu żelaza. Praca ta szczegółowo opisuje protokół generowania warunków o niskiej zawartości żelaza oraz metody oczyszczania i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków uwalnianych w odpowiedzi na niedobór żelaza.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj metodę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis za pomocą chromatografii wykluczania wielkości. Protokół ten zapewnia wysoką wydajność izolacji z minimalnym współwzbogaceniem białek niebędących pęcherzykami.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (Wideo) | JoVE Journal

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Przeglądaj więcej filmów