Name: Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę charakteryzacji biomechanicznej pierwotnych ścian komórkowych w żywych tkankach roślinnych przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Technika ta umożliwia pomiar modułu Younga bez konieczności utrwalania próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Dmitrijowi Suslovowi (Uniwersytet Państwowy w Sankt Petersburgu, Sankt Petersburg, Rosja) i Prof. Mirze Ponomarevej (Tatarski Instytut Naukowo-Badawczy Rolnictwa, FRC KazSC RAS, Kazań, Rosja) za dostarczenie nasion kukurydzy i żyta. Prezentowana metoda została opracowana w ramach projektu Rosyjskiej Fundacji Nauki nr 18-14-00168 przyznanego LK. Część prac (uzyskanie prezentowanych wyników) została wykonana przez AP przy wsparciu finansowym z zadania rządowego dla FRC Kazańskie Centrum Naukowe RAS.

1. Przygotowanie próbki do pomiarów AFM
<ol>
	<li>Materiał roślinny: Nasiona kukurydzy (Zea mays L.) i żyta (Secale cereale L.) sterylizować 0,35% roztworem NaOCl przez 10 min, przemyć 3x wodą destylowaną, a następnie rosnąć hydroponicznie w ciemności w temperaturze 27 °C odpowiednio przez 4 dni i 2 dni. Do eksperymentu wykorzystano korzenie pierwotne.</li>
	<li>Przygotowanie roztworów i próbki do przekroju wibratomu
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór agarozy do zatapiania korzeni, rozpuszczając 3% (w/w) agarozy o niskiej temperaturze topnienia w wodzie za pomocą kuchenki mikrofalowej. 
		UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w wodzie. Jeśli do badania wymagany jest bufor lub jakikolwiek inny rodzaj pożywki, lepiej jest użyć tego samego podłoża do przygotowania agarozy, podczas sekcji oraz w płynnej komorze AFM, aby uniknąć uszkodzenia próbki.</li>
		<li>Wylać 4 mm warstwę stopionej 3% agarozy na dno szalki Petriego (średnica = 35 mm) i pozostawić do lekkiego ostygnięcia, aby zapobiec termicznemu uszkodzeniu próbki.</li>
		<li>Umieść trzy lub cztery małe kawałki (o długości około 5 mm) badanego organu roślinnego poziomo na agarozie. 
		UWAGA: Próbki powinny być do połowy zanurzone, ale nie zanurzone w warstwie agarozy. Jeśli próbka nie jest zanurzona, może wydostać się z agarozy podczas cięcia wibratomem. Jeśli próbka opadnie na dno, będzie zbyt blisko krawędzi sekcji i stanie się niewygodna dla dalszych kroków.</li>
		<li>Gdy na wierzchu pierwszej warstwy agarozy pojawi się cienki, półstały film (30-60 s), ostrożnie wylej drugą warstwę na wierzch. 
		UWAGA: Dolna warstwa agarozy nie powinna całkowicie zastygnąć. W przeciwnym razie obie warstwy mogą oddzielić się od siebie podczas dalszej pracy.</li>
		<li>Po całkowitym zestaleniu agarozy wytnij blok zawierający próbkę. Uformuj blok w sześciokątną ściętą ostrosłup, aby zapewnić jego stabilność podczas dalszego cięcia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
		UWAGA: Próbka może być zorientowana pionowo lub poziomo w tym bloku, w zależności od rodzaju wymaganego przekroju. Przygotowując blok, pozostaw 2-3 mm agarozy wokół próbki. W tym przypadku wycinek próbki zostanie zatrzymany przez warstwę 3% agarozy, co ułatwi jej dalsze unieruchomienie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzielenie próbki na sekcje za pomocą wibratomu
	<ol>
		<li>Przyklej blok do etapu wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Umieść stolik w wibratomie tak, aby jeden z rogów piramidy był skierowany w stronę ostrza wibratomu. Wlej wodę do wanny wibratomowej.</li>
		<li>Ustaw parametry przekroju (grubość przekroju, prędkość ostrza i częstotliwość drgań) i odetnij próbkę. 
		UWAGA: Należy stosować przekroje o grubości od 200 do 400 μm. Zbyt cienki przekrój może wprowadzać błędy w ocenie właściwości mechanicznych, natomiast zbyt gruby przekrój jest podatny na pękanie. Do korzeni żyta i kukurydzy zastosowano prędkość ostrza 1,3 mm·s-1 i częstotliwość oscylacji 90 Hz.</li>
		<li>Za pomocą cienkiej szczotki przenieś sekcję z łaźni wodnej na szklane szkiełko i umieść kroplę wody na sekcji, aby zapobiec jej wyschnięciu. Sprawdź jakość przekroju pod mikroskopem świetlnym. 
		UWAGA: Przekroje ukośne nie mogą być używane do pomiaru modułu sprężystości. Ściany komórkowe muszą być prostopadłe do płaszczyzny przekroju, w przeciwnym razie mogą się wyginać lub wyginać pod końcówką AFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Unieruchomienie sekcji do pomiarów AFM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
	<ol>
		<li>Wylej warstwę stopionej agarozy o stężeniu 1% (m/m) (~1 ml) na dno nasadki szalki Petriego za pomocą pipety. 
		UWAGA: Upewnij się, że boki nasadki szalki Petriego nie uniemożliwiają zbliżenia się końcówki do próbki. Warstwa agarozy powinna mieć grubość 1 mm i powinna pokrywać całe dno czapki.</li>
		<li>Po zestaleniu się 1% agarozy usuń nadmiar wody z sekcji, doprowadzając bibułę filtracyjną do jej krawędzi. 
		UWAGA: Nie dotykaj części roślinnej papierem, aby uniknąć uszkodzenia i całkowitego wyschnięcia próbki.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś sekcję od szkiełka do środka nasadki szalki Petriego za pomocą pędzla. Używając pipety o pojemności 20 μl, ostrożnie dodaj 1% agarozy wokół sekcji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: 1% agaroza nie powinna dostać się na samą próbkę. Powinien zakrywać tylko krawędzie 3% warstwy agarozy, która utrzymuje okaz rośliny. 1% agaroza powinna tworzyć małe pagórki na krawędziach tej 3% warstwy agarozy. Duże pagórki mogą uniemożliwić wspornikowi zbliżenie się do próbki.</li>
		<li>Wlać wodę lub inny roztwór, który ma być użyty do AFM, do nasadki szalki Petriego z unieruchomioną sekcją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i kalibracja AFM
UWAGA: Metoda siła-objętość AFM generuje przestrzennie rozdzielczą tablicę krzywych siła-odległość uzyskana w każdym punkcie badanego obszaru. Uzyskaj wszystkie parametry dla trybu siła-objętość (sztywność wspornika, IOS itp.) w trybie kontaktowym. Podobne procedury dla przyrządów innych producentów zostały opisane wcześniej10,20.
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni typ wspornika. 
	UWAGA: Sztywność wspornika musi być porównywalna ze sztywnością próbki21. Wspornik, który jest znacznie sztywniejszy niż próbka, nie będzie się zbytnio uginał, podczas gdy wspornik, który jest zbyt miękki, nie zdeformuje wystarczająco próbki. Typowa częstotliwość rezonansowa powinna być wystarczająca do kołysania wspornika w cieczy (tj. wynosić co najmniej kilkadziesiąt kHz). Powierzchnia kontaktu powinna być mała w porównaniu z rozmiarem ściany komórkowej, ponieważ zakłada się, że próbka badana w obliczeniach modułu Younga jest nieskończoną półprzestrzenią. Do korzeni żyta i kukurydzy stosowano następujące wsporniki: ostre wsporniki o typowej częstotliwości rezonansowej 60 kHz, średniej stałej sprężystości 1,5 N·m-1 i promieniu wierzchołka 10 nm lub wsporniki kuliste o typowej częstotliwości rezonansowej 75 kHz, średniej stałej sprężystości 2,8 N·m-1, i promieniu wierzchołka 150 nm.</li>
	<li>Włącz urządzenie AFM i związane z nim oprogramowanie (tabela materiałów). Zamontuj wspornik na uchwycie końcówki do kuwety cieczowej. Umieść kroplę płynu na końcówce, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza na końcówce podczas zanurzania jej w płynie. 
	UWAGA: W przypadku tworzenia się pęcherzyków, płyn można usunąć za pomocą precyzyjnej chusteczki, a następnie umieścić nową kroplę.</li>
	<li>Zamontuj uchwyt końcówki na głowicy skanującej.</li>
	<li>Umieścić twardą próbkę (świeże szkiełko podstawowe) w nasadce płytki Petriego. Wlej do niego płyn, upewniając się, że zakrywa szkiełko. Umieść głowicę skanującą na stoliku i podnieś próbkę tak, aby płyn zakrył wspornik.</li>
	<li>Wybierz zakładkę Głowice z rozwijanego menu Narzędzia. Upewnij się, że wybrano głowicę skanującą dla ogniwa cieczowego.</li>
	<li>Kliknij przycisk Celowanie, aby otworzyć okno Celowanie laserowe. Kliknij przycisk Kamera, aby otworzyć okno Mikroskop optyczny. Umieść laser na końcówce wspornika, używając na głowicy AFM i okienka mikroskopu optycznego w celu orientacji.</li>
	<li>Wybierz tryb Semicontact z menu rozwijanego w głównym oknie programu.</li>
	<li>Otwórz zakładkę Rezonans i wybierz typ używanego wspornika w menu Sondy. Kliknij przycisk Auto, aby określić częstotliwość rezonansową. 
	UWAGA: Jeśli używanego wspornika nie ma na liście, otwórz Narzędzia > Paszport sondy. Utwórz nowy plik, wprowadź parametry wspornika i zapisz go. Następnie wybierz go z menu rozwijanego Sondy.</li>
	<li>Wybierz tryb kontaktu z menu rozwijanego w głównym oknie programu.</li>
	<li>Kliknij przycisk N_Force Cal, aby otworzyć okno kalibracji wspornika. Wybierz używany wspornik i kliknij przycisk Sweep, a następnie przycisk Spect Meas, aby określić stałą sprężystości wspornika za pomocą procedury strojenia termicznego. Zamknij okno.</li>
	<li>Ustaw wartość zadaną na 1 nA. Otwórz kartę Approach (Podejście) i kliknij przycisk Landing (Lądowanie), aby zbliżyć się do próbki.</li>
	<li>Otwórz kartę Skanowanie. Ustaw częstotliwość skanowania na 0,5 Hz. Kliknij przycisk Obszar i ustaw rozmiar skanowania na 10 μm x 10 μm, a punkt skanowania na 256 x 256. Kliknij przycisk Uruchom i zeskanuj około 20 linii, aby sprawdzić, czy na szkle nie ma zanieczyszczeń. Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć skanowanie bez utraty danych.</li>
	<li>Otwórz zakładkę Krzywe. Ustaw parametry wycofania i podejścia odpowiednio do 500 nm i -100 nm.</li>
	<li>Wybierz ostatni skan z menu rozwijanego Wybierz klatkę, aby obserwować powierzchnię.</li>
	<li>Znajdź czysty obszar na szkle i wskaż punkt, w którym należy wykonać krzywą siła-odkształcenie, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby uzyskać krzywą. Zapisz od trzech do pięciu krzywych siły w różnych miejscach na skanie.</li>
	<li>Kliknij przycisk Dane, aby otworzyć okno analizy i wybrać ramkę z krzywą siła-odkształcenie.</li>
	<li>Kliknij przycisk Pair Markers i wskaż liniową część krzywej retrakcji, aby obliczyć stosunek sygnału DFL do przemieszczenia, czyli odwrotnej czułości optycznej (IOS, nA nm-1) lub czułości ugięcia.</li>
	<li>Powtórz krok 2.17 dla wszystkich zarejestrowanych krzywych i zapisz wszystkie obliczone wartości stosunku sygnału DFL do przemieszczenia. Powinny być takie same.</li>
	<li>Zamknij okno analizy, kliknij kartę Podejście, a następnie przycisk Usuń, aby wycofać sondę z próbki.</li>
</ol>
3. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Przeprowadzić próbkę pod wspornikiem AFM za pomocą mikroskopu optycznego. Kliknij kartę Approach, a następnie przycisk Landing, aby zbliżyć się do próbki w trybie kontaktowym z wartością zadaną 1 nA.</li>
	<li>Kliknij kartę Skanowanie, a następnie przycisk Obszar. Wybierz rozmiar obszaru 70 μm x 70 μm do skanowania.</li>
	<li>Kliknij przycisk Przesuń sondę i sprawdź cały obszar skanowania, przesuwając po nim skaner. Na podstawie stopnia wysunięcia skanera znajdź najwyższy punkt.</li>
	<li>Otwórz kartę Approach, a następnie kliknij przycisk Usuń, aby wycofać się z próbki. Używając najwyższego punktu jako celu, kliknij przycisk Lądowanie, aby ponownie zbliżyć się do próbki. Następnie ponownie sprawdź powierzchnię, klikając przycisk Przesuń sondę i przesuwając po niej skaner. Żaden z punktów w obszarze nie powinien wymagać całkowitego podniesienia skanera. 
	UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby zakres z skanera przekraczał różnicę wysokości próbki. Dopuszczalne jest jednak, jeśli niektóre punkty w obszarze skanowania znajdują się poniżej pojemności skanera. Jednocześnie takich punktów nie powinno być wiele. Duże obszary, do których skaner nie może dotrzeć, mogą spowodować przerwanie skanowania.</li>
	<li>Ustaw częstotliwość skanowania na 0,5 Hz. Ustaw rozmiar skanowania na 70 μm x 70 μm, a punkt skanowania na 64 x 64. Kliknij przycisk Uruchom i zeskanuj, aby sprawdzić powierzchnię próbki i jej ewentualne zanieczyszczenie agarozą. 
	UWAGA: Jeśli próbka ma komórki o dużym prześwicie, rozmiar obszaru skanowania można zmniejszyć lub należy go przesunąć tak, aby na skanie było więcej ścian komórkowych.</li>
	<li>Kliknij przycisk Włącz w górnej części okna głównego, aby wyłączyć pętlę informacji zwrotnych.</li>
	<li>Wybierz tryb HDPlus (metoda wymuszonej głośności) z menu rozwijanego w głównym oknie programu. Pojawi się dodatkowe okno (okno HD).</li>
	<li>Ustaw wartość SetPoint na 0,1 nA w głównym oknie programu.</li>
	<li>W zakładce Main okna HD należy ustawić parametry skanowania (amplitudę i częstotliwość sinusoidalnego ruchu wspornika) odpowiednie dla badanej próbki. 
	UWAGA: Każdy rodzaj próbki i wspornika wymaga doboru parametrów skanowania. Konieczne są pewne wstępne eksperymenty. W przypadku korzeni kukurydzy lub żyta stosowano ostre i kuliste wsporniki o amplitudzie 400 nm i częstotliwości 300 Hz.</li>
	<li>Otwórz zakładkę Dźwięki w oknie HD i wprowadź częstotliwość rezonansową wspornika.</li>
	<li>Otwórz zakładkę Quant w oknie HD i wprowadź IOS, sztywność wspornika oraz promień i kąt końcówki. Wybierz model kontaktu, który będzie używany do obliczeń w zależności od geometrii końcówki. 
	UWAGA: Model DMT bierze pod uwagę siłę adhezji istniejącą między sondą a próbką i jest najczęściej stosowany w mechanobiologii21.</li>
	<li>Otwórz kartę Scan (Skanowanie) w oknie HD i wybierz sygnały, które mają być nagrywane. Wybierz kierunek, w którym nagrywany jest sygnał. Zaznacz pole Objętość siły, aby uzyskać zapis wszystkich krzywych siły. 
	UWAGA: Zapisz sygnał modułu sprężystości zarówno w kierunku do przodu, jak i do tyłu. Dostarczy to więcej punktów do obliczenia.</li>
	<li>Kliknij przycisk Wyłącz w górnej części głównego okna programu, aby włączyć pętlę sprzężenia zwrotnego.</li>
	<li>Kliknij przycisk PhaseCorr w głównym oknie HD, aby skorygować czułość układu optycznego.</li>
	<li>Zakładka vs Time w głównym oknie HD prezentuje funkcję sygnału DFL w funkcji czasu w czasie rzeczywistym; wybierz części tej funkcji, które będą używane do wyznaczania poziomu linii bazowej i dopasowania modelu kontaktowego do dalszych obliczeń.</li>
	<li>Ustaw wartość punktu skanowania na 256 x 256 w oknie głównym programu. Ustaw częstotliwość skanowania na 0,2 Hz i kliknij przycisk Uruchom, aby zeskanować próbkę.</li>
	<li>Po zatrzymaniu skanowania kliknij przycisk Włącz w górnej części okna głównego, aby wyłączyć pętlę sprzężenia zwrotnego.</li>
	<li>Wybierz tryb kontaktu z menu rozwijanego, otwórz kartę Podejście i kliknij przycisk Usuń, aby wycofać się z próbki.</li>
	<li>Kliknij przycisk Dane, aby otworzyć oprogramowanie analityczne i zapisać dane wyjściowe.</li>
	<li>Pod koniec dnia pomiaru zdejmij uchwyt końcówki wspornikowej z głowicy i ostrożnie spłucz go kilka razy ultraczystą wodą. Za każdym razem usuń wodę precyzyjnym ściereczką.</li>
</ol>
4. Ocena danych i przetwarzanie końcowe
UWAGA: Nie polegaj na wartościach modułu sprężystości obliczanych automatycznie. Ponieważ powierzchnia jest bardzo zróżnicowana pod względem wysokości, wiele krzywych artefaktów powinno zostać usuniętych.
<ol>
	<li>Otwórz zapisany plik w oprogramowaniu do analizy.</li>
	<li>Zaznacz ramkę HDForceVolume.</li>
	<li>Przytrzymaj naciśnięty Ctrl i wybierz jedną klatkę wizualną uzyskaną w tym samym kierunku skanowania. Kliknij przycisk Załaduj mapę zewnętrzną, aby zobaczyć, gdzie znajdują się ściany komórkowe. 
	UWAGA: Każda mapa sygnału może być używana jako ramka wizualna, ale najłatwiejszym sposobem może być użycie mapy sygnału DFL (różne instrumenty mogą odnosić się do niej jako sygnału odchylenia lub sygnału błędu).</li>
	<li>Sprawdź wartości sztywności InvOptSens (IOS) i wspornika w zakładce Główne.</li>
	<li>Otwórz zakładkę Dodatkowe i sprawdź parametry końcówki oraz model kontaktu.</li>
	<li>Kliknij różne punkty na ścianach komórkowych w ramce wizualnej i wybierz tylko te krzywe, które są dobrze opisane przez model. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki.</li>
	<li>Zapisz uzyskane wartości.</li>
</ol>

<ol><li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813(2013).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li>
<li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161(2018).</li>
<li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li>
<li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li>
<li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9%2C+IRX9L%2C+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83(2013).</li>
<li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li>
<li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li>
<li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls%3A+at+tissue%2C+cellular%2C+and+subcellular+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317(2014).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li>
<li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li>
<li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li>
<li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li>
<li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+%28Helianthus+annuus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li>
<li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls%3A+implications+for+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li>
<li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope%3A+methods%2C+theory+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li>
<li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plants-Basel%22%5BJournal%5D)">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172(2019).</li>
<li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674(2019).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Physics%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li>
<li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Note%3A+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Właściwości mechaniczne pierwotnych ścian komórkowych określają kierunek i tempo wzrostu komórek roślinnych, a tym samym przyszłą wielkość i kształt rośliny. Przedstawiona tu metoda oparta na AFM uzupełnia istniejące techniki, które są wykorzystywane do badania właściwości ścian komórkowych roślin. Pozwala na zbadanie elastyczności ścian komórkowych, które należą do wewnętrznych tkanek rośliny. Za pomocą przedstawionej metody zmapowano właściwości mechaniczne ścian komórkowych w różnych tkankach rosnącego korzenia kukury...

Właściwości mechaniczne ściany komórkowej rośliny decydują o kształcie komórki i jej zdolności do wzrostu. Na przykład, rosnąca końcówka łagiewki pyłkowej jest bardziej miękka niż nierosnące części tej samej łagiewki1. Powstawanie zawiązków na merystemie Arabidopsis jest poprzedzone miejscowym spadkiem sztywności ścian komórkowych w miejscu przyszłego primordium2,3. Ściany komórkowe hipokotylu Arabidopsis, które są równoległe do głównej osi wzrostu i rosną szybciej, są bardziej miękkie niż te, które są prostopadłe do tej osi i rosną wolniej4,5. W korzeniu kukurydzy przejściu komórek od podziału do wydłużenia towarzyszył spadek modułów sprężystości we wszystkich tkankach korzenia. Moduły pozostały niskie w strefie wydłużenia i wzrosły w strefie późnego wydłużenia6.
Pomimo dostępności różnych metod, duże ilości informacji biochemicznych i genetycznych na temat biologii ściany komórkowej uzyskiwane corocznie są rzadko porównywane z mechanicznymi właściwościami ścian komórkowych. Na przykład mutanty w genach związanych ze ścianą komórkową często mają zmieniony wzrost i rozwój4,7,8, ale rzadko są opisywane w kategoriach biomechaniki. Jedną z przyczyn takiego stanu rzeczy jest trudność w przeprowadzaniu pomiarów na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Mikroskopia sił atomowych (AFM) jest obecnie podstawowym podejściem do takich analiz9.
W ostatnich latach przeprowadzono liczne badania nad biomechaniką ściany komórkowej roślin oparte na AFM. Właściwości mechaniczne ścian komórkowych tkanek zewnętrznych rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis2,3,4,5,10,11 and onion12, a także hodowanych komórek13,14,15, zostały objęte dochodzeniem. Jednak powierzchowne komórki rośliny mogą mieć ściany komórkowe, których właściwości mechaniczne różnią się od właściwości tkanek wewnętrznych6. Ponadto komórki roślinne są poddawane ciśnieniu przez turgor, co czyni je sztywniejszymi. Aby pozbyć się wpływu ciśnienia turgoru, badacze muszą użyć roztworów plazmolizujących2,3,4,5,10,11 lub zdekomponować uzyskane wartości na wkład turgoru i ściany komórkowej12. Pierwsze podejście prowadzi do odwodnienia próbki i zmienia grubość oraz właściwości ściany komórkowej16, podczas gdy drugie podejście wymaga dodatkowych pomiarów i skomplikowanej matematyki i dotyczy tylko komórek o stosunkowo prostym kształcie12. Właściwości ściany komórkowej tkanek wewnętrznych można ocenić na kriosekcjach17 lub skrawkach materiału roślinnego nasączonego żywicą8. Obie metody wiążą się jednak z odwodnieniem i/lub impregnacją próbek, co nieuchronnie prowadzi do zmian właściwości. Właściwości izolowanych lub hodowanych komórek są trudne do odniesienia do fizjologii całej rośliny. Zarówno uprawa, jak i izolacja komórek roślinnych może wpływać na właściwości mechaniczne ich ścian komórkowych.
Przedstawiona tutaj metoda uzupełnia wyżej wymienione podejścia. Za jego pomocą można badać pierwotne ściany komórkowe dowolnej tkanki i na każdym etapie rozwoju rośliny. Przekroje i obserwacje AFM przeprowadzono w cieczy, co pozwala uniknąć odwodnienia próbki. Problem turgoru został rozwiązany w miarę cięcia komórek. W protokole opisano pracę z korzeniami kukurydzy i żyta, ale każda inna próbka może być zbadana, jeśli nadaje się do cięcia wibratomowego.
Opisane tutaj badania AFM zostały przeprowadzone przy użyciu techniki siły-objętości. Różne instrumenty używają różnych nazw dla tej metody. Jednak podstawowa zasada jest taka sama; Mapę siły i objętości próbki uzyskuje się za pomocą sinusoidalnego lub trójkątnego ruchu wspornika (lub próbki) w celu osiągnięcia określonej siły obciążenia w każdym analizowanym punkcie, przy jednoczesnym rejestrowaniu ugięcia wspornika18. Wynik łączy w sobie obraz topograficzny powierzchni i układ krzywych siła-odległość. Każda krzywa służy do obliczania odkształcenia, sztywności, modułu Younga, przyczepności i rozpraszania energii w określonym punkcie. Podobne dane można uzyskać za pomocą spektroskopii siłowej punkt po punkcie po skanowaniu w trybie kontaktowym19, chociaż jest to bardziej czasochłonne.

<table><tbody><tr><td>Agaroza, niska temperatura topnienia</td><td>Helikon</td><td>B-5000-0.1</td><td>do utrwalania próbki</td></tr><tr><td>Szczotka</td> <td>-</td><td></td> <td>do sekcji ruchomych</td></tr><tr><td>Wsporniki</td><td>NanoTools, Niemcy</td><td>NT_B150_v0020-5</td><td>Model: Biosfera B150-FM</td></tr><tr><td>Wsporniki</td><td>NT-MDT, Rosja</td><td>FMG01/50</td><td>Model: FMG01</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td> <td>-</td><td></td> <td>do wibratomia</td></tr><tr><td>Szkiełka szkiełkowe</td><td>Heinz Herenz</td><td>1042000</td><td>do kalibracji wibratomii i AFM</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageAnalysis P9</td><td>NT-MDT, Rosja</td> <td>-</td> <td>do analizy danych</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny Leica DM1000</td><td>Leica Biosystems, Niemcy</td><td>11591301</td><td>do kontroli przekrojów</td></tr><tr><td>NaOCl</td> <td>-</td><td></td> <td>do sterylizacji nasion</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Nova PX 3.4.1</td><td>NT-MDT, Rosja</td> <td>-</td> <td>do eksperymentów prowadzonych Mikroskop</td></tr><tr><td>NTEGRA Prima ze sterownikiem HD</td><td>NT-MDT, Rosja</td> <td>-</td> <td>do AFM i akwizycji danych szalka</td></tr><tr><td>Petriego 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>do utrwalania próbek</td></tr><tr><td>Pipeta z końcówką 1000 i mikro; L</td><td>Pipeta Thermo Fisher Scientific</td><td></td> <td>4642092-Tip</td></tr> <tr><td>2-20 &mikro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>4642062-Ultraczysta woda</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Vibratome Leica VT 1000S</td><td>Leica Biosystems, Niemcy</td><td>1404723512</td><td>do cięcia próbek</td></tr></tbody></table>

charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Właściwości mechaniczne pierwotnych ścian komórkowych decydują o kierunku i tempie wzrostu komórek roślinnych, a tym samym o przyszłym rozmiarze i kształcie rośliny. Opracowano wiele wyrafinowanych technik pomiaru tych właściwości; jednak mikroskopia sił atomowych (AFM) pozostaje najwygodniejsza do badania elastyczności ściany komórkowej na poziomie komórkowym. Jednym z najważniejszych ograniczeń tej techniki jest to, że można badać tylko powierzchowne lub izolowane żywe komórki. W tym artykule przedstawiono zastosowanie mikroskopii sił atomowych do badania właściwości mechanicznych pierwotnych ścian komórkowych należących do tkanek wewnętrznych ciała roślinnego. Protokół ten opisuje pomiary pozornego modułu Younga ścian komórkowych w korzeniach, ale metoda może być również stosowana do innych organów roślinnych. Pomiary są wykonywane na skrawkach materiału roślinnego pochodzącego z wibratomu w płynnej komórce, co pozwala (i) uniknąć stosowania roztworów plazmolizujących lub impregnacji próbki woskiem lub żywicą, (ii) przyspieszyć eksperymenty oraz (iii) zapobiec odwodnieniu próbki. Można badać zarówno antyklinalne, jak i peryklinalne ściany komórkowe, w zależności od tego, jak próbka została podzielona na sekcje. Różnice we właściwościach mechanicznych różnych tkanek można zbadać w jednej sekcji. W protokole opisano zasady planowania badań, zagadnienia związane z przygotowaniem próbek i pomiarami, a także sposób doboru krzywych siła-odkształcenie w celu uniknięcia wpływu topografii terenu na uzyskiwane wartości modułu sprężystości. Metoda nie jest ograniczona wielkością próby, ale jest wrażliwa na wielkość komórek (tj. komórki o dużym świetle są trudne do zbadania).

Typowe mapy modułu sprężystości i DFL, a także krzywe siły uzyskane dla korzeni żyta i kukurydzy za pomocą opisanego sposobu, przedstawiono na Rysunku 2. Rysunek 2A przedstawia mapy modułu sprężystości i DFL uzyskane w przekroju poprzecznym korzenia głównego żyta. Białe obszary na mapie modułu (Rysunek 2A, po lewej) odpowiadają błędnemu zawyżeniu modułu Younga wynikającemu z osiągnięcia przez skaner limitu w kierunku z. Obraz ten ni...

Badania biomechaniki ściany komórkowej są niezbędne do zrozumienia wzrostu i morfogenezy roślin. Zaproponowano następujący protokół do zbadania cienkich pierwotnych ścian komórkowych w tkankach wewnętrznych młodych organów roślinnych za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Wzrost komórek roślinnych jest kontrolowany przez właściwości mechaniczne ich ścian komórkowych. Dlatego ważne jest, aby znać te właściwości w różnych narządach i tkankach roślin. Przedstawiona metoda pozwala na biomechaniczną charakterystykę nieutrwalonych i nieodwodnionych ścian komórkowych w tkankach wewnętrznych młodych roślin.Zacznij od przygotowania roztworów i próbki do przekroju wibratomem. Wylej czteromilimetrową warstwę stopionej 3% agarozy na dno szalki Petriego i pozwól jej lekko ostygnąć, aby zapobiec termicznemu uszkodzeniu próbki. Umieść trzy lub cztery kawałki organu roślinnego o długości około pięciu milimetrów poziomo na agarozie.Około 30 do 60 sekund później na wierzchu pierwszej warstwy agarozy pojawi się cienki, półstały film. Następnie ostrożnie wylej drugą warstwę na wierzch. Po całkowitym zestaleniu agarozy wytnij blok zawierający próbkę.Uformuj blok w sześciokątną ściętą ostrosłup, aby zapewnić jego stabilność podczas dalszego cięcia. Przed rozpoczęciem cięcia próbki za pomocą wibratomu, przyklej blok do stolika wibratomu za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Umieść stolik w wibratomie, tak aby jeden z rogów piramidy był skierowany w stronę ostrza wibratomu i wlej wodę do kąpieli wibratomu.Ustaw parametry przekroju, takie jak grubość przekroju, prędkość ostrza i częstotliwość drgań, a następnie przetnij próbkę. Za pomocą cienkiej szczotki przenieś sekcję z łaźni wodnej na szklane szkiełko i umieść kroplę wody na sekcji, aby zapobiec jej wyschnięciu. Po sprawdzeniu jakości przekroju pod mikroskopem świetlnym należy wybrać odpowiedni przekrój o ścianie komórkowej prostopadłej do płaszczyzny przekroju.Następnie unieruchomić sekcję do pomiarów mikroskopii sił atomowych, wylewając warstwę jednego mililitra 1% stopionej agarozy na dno nasadki szalki Petriego za pomocą pipety. Po zestaleniu się agarozy usuń nadmiar wody z sekcji, przysuwając bibułę filtracyjną do jej krawędzi. Ostrożnie przenieś sekcję od szkiełka do środka nasadki szalki Petriego za pomocą pędzla.Następnie ostrożnie dodać 1% agarozy wokół przekroju za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów i wlać wodę lub inny roztwór do mikroskopii sił atomowych do nasadki szalki Petriego z unieruchomionym przekrojem. Przeprowadzić próbkę pod mikroskopem sił atomowych za pomocą mikroskopu optycznego. Kliknij przycisk Podejść, a następnie przycisk Lądowanie, aby zbliżyć się do próbki w trybie kontaktowym z nastawą jednego nanoampera.Kliknij przycisk Skanowanie, a następnie przycisk Obszar. Wybierz rozmiar obszaru 50 mikrometrów na 50 mikrometrów do skanowania. Kliknij przycisk Przesuń sondę i sprawdź cały obszar skanowania, przesuwając po nim skaner i znajdując najwyższy punkt w zależności od stopnia wysunięcia skanera.Otwórz kartę Podejście. Następnie kliknij przycisk Usuń, aby wycofać się z próbki. Używając najwyższego punktu jako celu, kliknij przycisk Lądowanie, aby ponownie zbliżyć się do próbki.Następnie ponownie sprawdź powierzchnię, klikając przycisk Przesuń sondę i przesuwając po niej skaner. Ustaw częstotliwość skanowania na 0,5 herca i ustaw rozmiar skanowania na 50 mikrometrów na 50 mikrometrów, a punkt skanowania na 64 na 64. Kliknij przycisk Uruchom i zeskanuj, aby sprawdzić powierzchnię próbki i jej ewentualne zanieczyszczenie agarozą.Po kliknięciu przycisku Włącz wybierz tryb HDPlus z menu rozwijanego w oknie głównym programu i ustaw wartość zadaną na 0,1 nanoampera w głównym oknie programu. W głównej zakładce okna HD należy ustawić parametry skanowania odpowiednie dla badanej próbki. Następnie otwórz zakładkę Szumy w oknie HD i wprowadź częstotliwość rezonansową wspornika.Otwórz kartę Quant w oknie HD i wprowadź IOS, sztywność wspornika, promień końcówki i kąt. Wybierz model kontaktu, który będzie używany do obliczeń w zależności od geometrii końcówki. Następnie otwórz zakładkę Skanowanie w oknie HD i wybierz sygnały, a także kierunek, w którym sygnał jest nagrywany.Zaznacz pole Force Volume, aby uzyskać zapis wszystkich krzywych siły i kliknij przycisk Off w górnej części głównego okna programu, aby włączyć pętlę sprzężenia zwrotnego Kliknij przycisk Phase Core w głównym oknie HD, aby skorygować czułość układu optycznego. Zakładka Versus Time w głównym oknie HD prezentuje funkcję sygnału DFL w funkcji czasu w czasie rzeczywistym. Należy wybrać części tej funkcji, które będą używane do określania poziomu linii bazowej i do dopasowania modelu kontaktowego do dalszych obliczeń.Teraz ustaw wartość punktu skanowania na 256 na 256 w głównym oknie programu. Następnie ustaw częstotliwość skanowania na 0,2 Hz i kliknij przycisk Uruchom, aby zeskanować próbkę. Po zatrzymaniu skanowania kliknij przycisk Włącz w górnej części okna głównego, aby wyłączyć pętlę sprzężenia zwrotnego.Wybierz Tryb kontaktu z menu rozwijanego, otwórz kartę Podejście i kliknij przycisk Usuń, aby wycofać się z próbki. Kliknij przycisk Dane, aby otworzyć oprogramowanie analityczne i zapisać dane wyjściowe. Otwórz zapisany plik w oprogramowaniu do analizy.Wybierz klatkę głośności HD Force. Przytrzymaj Control i wybierz jedną klatkę wizualną uzyskaną w tym samym kierunku skanowania. Kliknij przycisk Załaduj mapę zewnętrzną, aby zobaczyć, gdzie znajdują się ściany komórkowe.Sprawdź wartości InvOptSens i sztywności wspornika w zakładce głównej. Otwórz zakładkę Dodatkowe i sprawdź parametry końcówki oraz model kontaktowy. Kliknij różne punkty na ścianach komórkowych w ramce wizualnej i wybierz tylko te krzywe, które są dobrze opisane przez model.Białe obszary na mapie modułu odpowiadają błędnemu przeszacowaniu modułu Younga z powodu osiągnięcia przez skaner jego granicy w kierunku Z. Obraz ten nie jest wygodny do wykorzystania jako mapa zewnętrzna do dalszego wyboru zadowalających krzywych siły. Jednak mapa sygnału DFL przedstawiona po prawej stronie jest tutaj lepiej dopasowana.Różne przyrządy mogą odnosić się do sygnałów DFL jako sygnałów odchylenia lub błędu. Skaner, który został w pełni wysunięty podczas próby dotarcia do dna próbki, może skutkować błędnymi pomiarami, a nawet przerwanymi skanami. Obecność agarozy można sprawdzić podczas wykonywania pierwszego skanu w trybie kontaktowym, ponieważ na takich skanach widoczne są ściany komórkowe i niektóre dna komórek.Jednak w przypadku niedokładnego unieruchomienia powierzchnia może być pokryta agarozą, która maskuje topografię próbki. Spośród czterech różnych krzywych siły zarejestrowanych w różnych punktach tej samej ściany komórkowej, krzywa zarejestrowana przy 0,1 nie pokazuje linii podstawowej, co oznacza brak oddzielenia końcówki wspornika od ściany komórkowej. Krzywa zarejestrowana na poziomie 0,3 pokazuje pobocze na zbliżającej się części, co wskazuje na zgięcie ściany komórki.Punkty drugi i czwarty pokazują zadowalające krzywe sił o podobnych wartościach modułów. Przygotowanie i badanie próbki wymaga praktyki, ale można ją opanować. Kluczową częścią tego protokołu jest filtrowanie wynikowych krzywych.Nie należy polegać na modułach, które zostały obliczone automatycznie. Tę samą technikę można zastosować do pomiaru sił adhezji lub rozpraszania energii. Może to być również ważne dla opisu zachowania wiskozy lub lepkosprężystości niektórych materiałów.

characterizing-mechanical-properties-primary-cell-wall-living-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Opisujemy metodę mapowania właściwości mechanicznych tkanek roślinnych za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Skupiamy się na tym, jak rejestrować zmiany mechaniczne, które zachodzą w ścianach komórkowych podczas rozwoju roślin w mezoskali szerokopolowej, umożliwiając skorelowanie tych zmian ze wzrostem i morfogenezą.

Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

Tutaj prezentujemy mikroskopię sił atomowych (AFM), działającą jako narzędzie do nano- i mikro-indentacji komórek i tkanek. Przyrząd pozwala na jednoczesne pozyskiwanie topografii powierzchni 3D próbki i jej właściwości mechanicznych, w tym modułu Younga ściany komórkowej oraz ciśnienia turgoru.

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Wczesny rozwój muszki owocówki, Drosophila melanogaster, charakteryzuje się szeregiem zmian kształtu komórek, które są bardzo odpowiednie dla metod obrazowania. Niniejszy artykuł opisze podstawowe narzędzia i metody niezbędne do konfokalnego obrazowania zarodków Drosophila na żywo, koncentrując się na procesie zmiany kształtu komórek zwanym cellularizacją.

Obrazowanie zmian kształtu komórek w żywych zarodkach Drosophila

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Poznaj metodę charakteryzacji biomechanicznej pierwotnych ścian komórkowych w żywych tkankach roślinnych przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Technika ta umożliwia pomiar modułu Younga bez konieczności utrwalania próbek.

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów