Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D
19 maja 2022
Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.
Nasz protokół pozwala naukowcom na generowanie hierarchicznych sieci naczyń krwionośnych w ramach w pełni zaprojektowanej i wszczepialnej klapy, co utorowało drogę do nowych badań nad zachowaniem naczyń krwionośnych w warunkach integracji in vivo. Technika ta połączyła wszechstronność dwóch technologii druku 3D w celu tworzenia i montażu naczyń w mikro i mezoskali, które można bezpośrednio zespolić z naczyniami gospodarza za pomocą mikrochirurgii. W pełni zmodyfikowane, unaczynione płaty mogą być stosowane do leczenia dużych ubytków tkanek, a także jako platforma do badania rozwoju i integracji tkanek.
Proponowane metody mogą zostać rozszerzone o badanie inkorporacji komórek specyficznych dla tkanki, a także o ocenę zastosowania różnych biotuszy i materiałów pomocniczych. Rozpocznij od napełnienia formy BVOH 30 mikrolitrami roztworu polimeru. Odwiruj formę z prędkością 100 razy g przez 2 minuty i uzupełnij formę kolejnymi 20 mikrolitrami roztworu polimeru, aby zapewnić całkowite napełnienie.
Zamroź napełnione formy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut, aby upewnić się, że cały roztwór polimeru zamarznie. Usuń rozpuszczalnik z foremek poprzez liofilizację przez noc. Aby usunąć protektorowy materiał formy, przenieś formy po procesie liofilizacji do 5-litrowej dejonizowanej łaźni wodnej pod delikatnym mieszaniem.
Wymień wodę w wannie, gdy zrobi się mętna. Gdy cały BVOH się rozpuści, wysusz rusztowania na powietrzu i przechowuj je w komorze próżniowej do czasu użycia. Przenieś około 4 mililitry przygotowanego, zagęszczonego materiału podporowego do każdego dołka 12-dołkowej płytki za pomocą pipety wyporowej.
Postukaj płytką studzienki o twardą powierzchnię, aby wymusić równomierne rozprowadzenie materiału podporowego w studzience. Przygotować zawiesinę zawierającą 2 miliony komórek macierzystych HAMEC-ZsGreen i 6 milionów komórek macierzystych miazgi zęba w 10 mililitrach pożywki z komórek śródbłonka. Odwirować zawiesinę komórkową 200 razy g przez 4 minuty, aby uzyskać osad komórkowy, następnie odessać pożywkę supernatantową i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 mililitrze biotuszu rhCollMA, aby uzyskać biotusz o całkowitym stężeniu komórek 8 milionów komórek na 1 mililitr biotuszu.
Dopasuj igłę o średnicy wewnętrznej 0,22 milimetra do 3-mililitrowego bursztynowego wkładu drukarskiego i umieść wkład w 50-mililitrowej stożkowej tubie. Przenieś 1 mililitr mieszaniny komórek-biotuszu do wkładu drukującego, napełniając go od góry za pomocą pipety wyporowej w celu zmniejszenia pęcherzyków. Zainstaluj kasetę drukującą w odpowiednim narzędziu przy biodrukarce.
Naszkicuj wzór 2D kwadratu o średnicy 4 milimetrów, w środku którego znajduje się okrągły kanał o średnicy 2 milimetrów. Wyciągnij szkic o 4 milimetry, aby uzyskać 4-milimetrowy sześcian z centralnym kanałem. Wyeksportuj ten obiekt jako plik STL.
Zaimportuj szablon STL 12-dołkowej płytki do zakładki modelowania brył w oprogramowaniu do krojenia biodrukarki i umieść go w wyznaczonym obszarze wirtualnego stołu roboczego. Zaimportuj plik STL kształtu sześcianu do zakładki modelowania brył w oprogramowaniu do krojenia biodrukarki. Kliknij pole wyboru Użyj zewnętrznego fragmentatora, a następnie skonfiguruj fragmentator w sekcji właściwości obiektu.
W wyskakującym oknie wybierz prostoliniowy wzór wzoru wypełnienia i wpisz 30%w polu Gęstość wypełnienia, kliknij przycisk Akceptuj. Kliknij sześcian i przesuń go za pomocą myszy, aby umieścić kopię kształtu sześcianu w każdej żądanej wirtualnej studni. Kliknij przycisk dodaj materiał w zakładce materiały w oprogramowaniu do krojenia bioprinter, aby utworzyć nowe ustawienia materiału dla biotuszu rhCollMA.
Wybierz ustawienia materiału do drukowania. Dla ciśnienia typu 2 psi, a dla prędkości typu 20 milimetrów na sekundę w odpowiednich skrzynkach. Przypisz wartości szerokości i wysokości linii do 0,24 milimetra, a wartość przyspieszenia do 400 milimetrów na sekundę kwadratową.
Na karcie modelowania bryłowego kliknij na obiekt sześcianu, a następnie kliknij na materiał rhCollMA w sekcji materiału, aby przypisać go do kształtu sześcianu. W zakładce biomontaż kliknij przycisk Wyślij zadanie drukowania, aby wysłać zadanie drukowania do biodrukarki. Załaduj wkład drukujący załadowany biotuszem komórkowym do 3-mililitrowego pneumatycznego narzędzia dozującego w temperaturze otoczenia biodrukarki opartej na wytłaczaniu 3D.
Kliknij przycisk Chłodzenie w zakładce Sterowanie ogrzewaniem lub chłodzeniem na ekranie interfejsu biodrukarki, aby ustawić temperaturę stołu roboczego na 4 stopnie Celsjusza. Załaduj płytę z wanną podporową na łożu drukarki. Na karcie Drukuj na ekranie interfejsu biodrukarki kliknij zadanie drukowania, a następnie kliknij Start, a następnie GO, aby rozpocząć zadanie drukowania.
Po wydrukowaniu wystaw płytkę studzienkową na działanie źródła światła o długości 405 nm i natężeniu 3 miliwatów na centymetr kwadratowy przez 30 sekund, aby zainicjować sieciowanie biotuszu rhCollMA. Po usieciowaniu inkubować płytkę studzienkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej 20 minut, aż cała kąpiel podporowa się rozpuści. Delikatnie odessać płynną kąpiel podporową i zastąpić ją pożywką z komórek śródbłonka.
Inkubuj konstrukty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Natychmiast po usunięciu materiału podporowego z biodrukowanej sieci mikronaczyniowej, umieść rusztowanie naczyniowe PLLA:PLGA pokryte fibronektyną obok struktury biodrukowanej. Umieść rusztowanie naczyniowe w głównym kanale struktury biodrukowanej.
Inkubuj zmontowane konstrukcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni. Przygotuj zawiesinę komórkową ludzkich komórek mikronaczyniowych tkanki tłuszczowej wykazujących ekspresję tdPomidor w stężeniu 10 milionów komórek na mililitr. Umieść 20-mikrolitrową kroplę tej zawiesiny komórkowej na hydrofobowej powierzchni.
Delikatnie umieść rusztowania naczyniowe na wierzchu kropli tak, aby światło rusztowania na jednym końcu stykało się z kroplą komórki. Zassać kroplę z przeciwległego końca rusztowania, wypełniając jego światło zawiesiną komórkową. Umieść osadzone rusztowanie w probówce mikrowirówki i umieść je w rotatorze w nawilżonym inkubatorze na 60 minut.
Na koniec przenieś rusztowanie na 12-dołkową płytkę i dodaj 2 mililitry pożywki z komórek śródbłonka. Widok z boku reprezentatywnego płata zaprojektowanego przez cztery dni po wyściółce śródbłonka rusztowania naczyniowego jest pokazany tutaj. Biodrukowana mikrokrążność jest pokazana na zielono, podczas gdy wyściółka śródbłonka jest pokazana na czerwono.
Reprezentatywny obraz przedstawia zespolenia między biodrukowanym układem naczyniowym a wyściółką śródbłonka. Barwienie immunologiczne aktyny mięśni gładkich, jąder i komórek śródbłonka po siedmiu dniach inkubacji pokazano tutaj. Reprezentatywny obraz przedstawia zakończone zespolenia zaprojektowanego płata z tętnicą udową szczura przed usunięciem klamry i po jej usunięciu.
Technika ta może być wykorzystana do badania dojrzewania i integracji naczyń krwionośnych wydrukowanych w 3D in vivo oraz monitorowania perfuzji implantu w kończynie tylnej w celu ustalenia potencjału i bezpieczeństwa jego stosowania w leczeniu wad tkanek.
Overview
Ten protokół opisuje metodę tworzenia 3D drukowanej klapki tkankowej z hierarchiczną siecią naczyń krwionośnych, umożliwiającą bezpośrednie mikrochirurgiczne anastomozy z tętnicą udowej szczura. Podejście łączy zaawansowane techniki druku 3D, aby umożliwić badania nad zachowaniem naczyń krwionośnych podczas integracji in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Biologia naczyń
- Druk 3D biologiczny
Tło
- Inżynieryzowane klapy wymagają funkcjonalnych sieci naczyń krwionośnych dla pomyślnej integracji.
- Obecne metody nie mają efektywnych technik tworzenia unieruchomionych konstrukcji tkankowych.
- To badanie ma na celu rozwiązanie tych ograniczeń poprzez innowacyjne metody druku 3D.
- Zrozumienie zachowania naczyń krwionośnych jest kluczowe dla opracowywania efektywnych strategii inżynierii tkankowej.
Cel badania
- Wytworzenie 3D drukowanej klapki tkankowej z hierarchiczną siecią naczyń krwionośnych.
- Umożliwienie bezpośredniej anastomozy z naczyniami krwionośnymi gospodarza.
- Udostępnienie platformy do badania rozwoju i integracji tkanki.
Zastosowane metody
- Kombinacja mikro i mezo skalowych technik druku 3D.
- Przygotowanie roztworów polimerów i zawiesin komórkowych do biodruku.
- Zastosowanie liofilizy i usuwania rozpuszczalników do stworzenia szkieletów.
- Techniki mikrochirurgiczne do anastomozy inżynieryzowanych klapek z naczyniami krwionośnymi gospodarza.
Główne wyniki
- Sukces w wytworzeniu unieruchomionych klapek tkankowych z hierarchicznymi sieciami naczyń krwionośnych.
- Wykazano wykonalność bezpośredniej anastomozy z tętnicą udowej szczura.
- Dostarczono wglądu w zachowanie naczyń krwionośnych podczas integracji in vivo.
- Ustanowiono podstawę dla przyszłych badań nad inkorporacją komórek specyficznych dla tkanki.
Wnioski
- Opracowany metoda zwiększa potencjał leczenia dużych defektów tkankowych.
- Otwiera drogi dla dalszych badań nad unieruchomionymi konstrukcjami tkankowymi.
- To podejście może być dostosowane dla różnych ewaluacji bioatynt i materiałów wspierających.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Engineering hierarchical vascular networks using 3D bioprinting addresses a critical bottleneck in creating functional, implantable tissues for regenerative medicine and reconstructive applications. This approach enables the fabrication of complex, perfusable tissue constructs that can be directly integrated with host vasculature, supporting translational research and preclinical model development. The method enhances predictive confidence in tissue integration and vascularization, informing risk-adjusted portfolio decisions in advanced tissue engineering pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of vascular integration and tissue perfusion in engineered constructs.
- Supports biological de-risking by modeling vessel anastomosis and network maturation.
- Facilitates predictive assessment of tissue viability and integration potential.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible vascularized tissue platforms for compound evaluation.
- Enables quantitative assessment of endothelial and support cell behavior in 3D environments.
- Supports scalability and platform reuse for diverse bioink and cell type screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered tissue models with disease-relevant vascularization and integration endpoints.
- Enables continuity from in vitro tissue development to in vivo implantation and perfusion studies.
- Supports risk-adjusted advancement of tissue constructs for reconstructive and regenerative applications.
Pipeline & Workflow Integration
This combined 3D bioprinting and sacrificial mold approach integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling iterative optimization of vascularized tissue constructs for downstream translational studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vessel formation, anastomosis, and tissue integration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs on vascular network assembly and cell viability.
- Analytics: Provides imaging and immunostaining readouts for network connectivity and maturation.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue engineering with in vivo perfusion and integration models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various tissue types and vascularization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tissue integration and vascular function.
- Operational Value: Standardizes fabrication and assessment of vascularized constructs for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for tissue engineering programs targeting clinical translation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue constructs for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D bioprinting, cell culture, and microsurgical techniques.
- Demands access to extrusion-based bioprinters, imaging, and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of bioink formulations and scaffold fabrication.
- Adaptable to different cell types and support materials for diverse tissue models.
- Limited by the need for precise control of vascular network architecture and integration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Vascular Scaffold Fabrication
1:54
Granular Support Bath Preparation and Incorporation of Endothelial Cells and Support Cells with the Bioink
3:09
Bioprinting Microvascular Networks Using rhCollMA Bioink
6:00
Assembling the Bioprinted Microvascular Network with the Vascular Scaffold to Obtain the Engineered Vascularized Flap
7:12
Results: Representative Images of the Assembled Vascularized Flap
7:59
Conclusion
