Name: Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania zaprojektowanych płatów naczyniowych z hierarchiczną siecią naczyń krwionośnych przy użyciu druku 3D. Technika ta umożliwia bezpośrednie połączenie mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach Programu Badań i Innowacji Unii Europejskiej Horyzont 2020 (umowa o grant nr 818808). rhCollMA została hojnie przekazana przez CollPlant (Rehovot, Izrael). Autorzy dziękują Urzędowi ds. Badań Przedklinicznych Technion za pomoc w opiece nad zwierzętami, a także Janette Zavin, Galii Ben David i Idanowi Redenskiemu.

<ol><li>Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+status%2C+evolution+and+future+of+facial+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Chang+Gung+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">The current status, evolution and future of facial reconstruction.</a> Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).</li>
<li>Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering complex tissues.</a> Science Translational Medicine. 4 (160), 12(2012).</li>
<li>Duan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+review+of+3D+bioprinting+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).</li>
<li>Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+three-dimensional+engineered+tissues+for+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications.</a> Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).</li>
<li>Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void-free+3D+bioprinting+for+in+situ+endothelialization+and+microfluidic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion.</a> Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349(2020).</li>
<li>Baltazar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+bioprinting+of+a+vascularized+and+perfusable+skin+graft+using+human+keratinocytes%2C+fibroblasts%2C+pericytes%2C+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells.</a> Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).</li>
<li>Chia, H. N., Wu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+3D+printing+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recent advances in 3D printing of biomaterials.</a> Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4(2015).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).</li>
<li>Guillotin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+assisted+bioprinting+of+engineered+tissue+with+high+cell+density+and+microscale+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization.</a> Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).</li>
<li>Catros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+bioprinting+for+creating+on-demand+patterns+of+human+osteoprogenitor+cells+and+nano-hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite.</a> Biofabrication. 3 (2), (2011).</li>
<li>Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+designed+poly%28d%2Cl-lactide%29%2Fnanosized+hydroxyapatite+composite+structures+by+stereolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography.</a> Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).</li>
<li>Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+PPF%2FDEF+scaffolds+using+micro-stereolithography+and+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Writing+in+the+granular+gel+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), 1500655(2015).</li>
<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+engineered+tissue+flaps+with+hierarchical+vessel+networks+%28VesselNet%29+for+direct+host-to-implant+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion.</a> Advanced Materials. 33 (42), 2102661(2021).</li>
<li>Schleimer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Training+a+sophisticated+microsurgical+technique%3A+interposition+of+external+jugular+vein+graft+in+the+common+carotid+artery+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).</li>
<li>Sucher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hind+limb+transplantation%3A+A+new+composite+tissue+allotransplantation+model+using+nonsuture+supermicrosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery.</a> Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).</li>
<li>Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cuff+design+to+facilitate+anastomosis+of+small+vessels+during+cervical+heterotopic+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats.</a> Comparative Medicine. 64 (4), (2014).</li>
<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).</li>
<li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li>
<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scaffold+system+for+studying+the+effect+of+local+geometry+and+topology+on+the+development+and+orientation+of+sprouting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels.</a> Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+transferrable+microvascular+meshes+for+subcutaneous+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+plotting+of+three-dimensional+hollow+fiber+scaffolds+based+on+concentrated+alginate+pastes+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).</li>
<li>Ying, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+emulsion+bioink-enabled+3D+bioprinting+of+porous+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels.</a> Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).</li>
<li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+and+angiogenesis+in+tissue+engineering%3A+beyond+creating+static+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li>
<li>Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-based+3D+cell+printing+for+next-generation+therapeutics+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics.</a> Biomaterials. 156, 88-106 (2018).</li>
<li>Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+support+materials+in+3D+bioprinting+-+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future.</a> International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).</li>
<li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+type+I+collagen+produced+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Human recombinant type I collagen produced in plants.</a> Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).</li>
<li>Stein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+bioactive%2C+post-translationally+modified%2C+heterotrimeric%2C+human+recombinant+type-I+collagen+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco.</a> Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).</li>
<li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+fabrication+of+precision+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , 120062(2020).</li>
<li>Karakurt, I., Lin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+technologies%3A+techniques%2C+materials%2C+and+post-processing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Inżynieria unaczynionych tkanek jest jednym z głównych wyzwań inżynierii tkankowej20. Obecne metody tworzenia zmodyfikowanej tkanki naczyniowej koncentrują się na tworzeniu samoorganizującej się mikrokrążenia 21,22,23 lub wytwarzaniu mezoskalowych rusztowań naczyniowych 24,25, a nie na odtwarzaniu systemu hierarchicznego unaczynienia, które może być ukrwione natychmiast i bezpośrednio po implantacji26. W tej pracy opisujemy protokół, który wykorzystuje dwie modalności drukowania 3D do wytworzenia hierarchicznej sieci naczyń składającej się z naczyń krwionośnych w mikroskali i mezoskali. Protokół łączy biodrukowaną w 3D, samodzielnie zmontowaną sieć mikronaczyniową z mezoskalowym rusztowaniem naczyniowym, uzyskując wszczepialny, unaczyniony płat. Ponadto w pracy przedstawiono protokół bezpośredniego zespolenia tego płata z tętnicą udową szczura.
Biodruk 3D zyskał zainteresowanie w ostatnich latach ze względu na jego wszechstronność w porównaniu z tradycyjnymi technikami inżynierii tkankowej. Chociaż protokół ten opisuje generowanie sieci mikronaczyniowej w biotuszu rhCollMA, stosowane metody można stosować z niewielkimi modyfikacjami do wielu innych biotuszów z mnóstwa badanych i nowatorskich biotuszów i kąpieli wspomagających27,28. Zdecydowaliśmy się użyć rhCollMA jako biotuszu ze względu na obfitość kolagenu typu I w ludzkim ECM, zapewniając odpowiednie środowisko do przyczepiania komórek. Ponadto jest wytwarzany rekombinacyjnie w roślinach i dalej modyfikowany grupami metakrylanowymi, co pozwala na fotopolimeryzację i tworzenie stabilnych hydrożeli 3D29,30. Fotosieciowanie osiągnięto poprzez dodanie fotoinicjatora LAP, który, jak wykazano, jest nietoksyczny i jest aktywowany przez ekspozycję na niebieskie światło 405 nm, zmniejszając możliwą fototoksyczność światła UV. Jednak stosowanie światłoczułych biotuszów wymaga użycia pożywki hodowlanej niezawierającej czerwieni fenolowej do przygotowania biotuszu i materiału podporowego. Ponadto w protokole opisano zastosowanie żelatynowego materiału nośnego, który umożliwia wytłaczanie biotuszów z zachowaniem wysokiej wierności, takich jak rhCollMA. Dlatego tak ważne jest, aby zapewnić użycie zimnego medium podczas jego przygotowania i chłodzenia stołu drukarki. Nadmierne nagrzewanie może wystąpić z powodu źródła światła używanego do sieciowania lub z powodu podwyższonych temperatur otoczenia.
Do stworzenia biodrukowanej sieci mikronaczyniowej wykorzystano tutaj biodrukowaną biodrukarkę, a obecnie dostępnych na rynku jest wiele biodrukarek, które mogą generować podobne konstrukty. Co więcej, proponowane metody można łatwo modyfikować i stosować do badania różnych geometrii, rozmiarów i wzorów wypełnień. W tej pracy wybrano prostoliniowy wzór wypełnienia, aby utworzyć połączone ze sobą pory, które można wydrukować stosunkowo szybko z dużą dokładnością.
Pęcherzyki powietrza stanowią poważne wyzwanie w biodruku ekstruzyjnym, zwłaszcza wewnątrz materiałów podporowych. Dlatego tak ważne jest, aby zminimalizować obecność i powstawanie tych pęcherzyków poprzez stosowanie pipet wyporowych do przenoszenia materiału podporowego, przygotowania zawiesiny biotuszu-komórek i ich transferu do wkładów drukarskich.
W tej pracy ludzkie komórki śródbłonka pochodzące z tkanki tłuszczowej i komórki macierzyste miazgi zębowej zostały wykorzystane jako komórki podporowe ze względu na ich stosunkowo łatwą izolację od pacjentów. Ponadto wybrano całkowite stężenie komórek 8 x 106 komórek/ml, ponieważ wykazano, że stężenie to tworzy najbardziej rozwinięte sieci naczyniowe16. Chociaż protokół ten może być stosowany do generowania mikrokrążenia przy użyciu różnych typów komórek i źródeł, a także różnych biotuszów, należy przeprowadzić kalibrację stężenia komórek, aby stworzyć najlepsze warunki do rozwoju sieci mikrokrążenia. Co więcej, komórki specyficzne tkankowo (tj. mioblasty lub osteoblasty) mogą być włączone do biotuszu w celu uzyskania specyficznych dla tkanki unaczynionych płatów.
Forma do porowatego rusztowania naczyniowego została wykonana przy użyciu drukowanego w 3D materiału rozpuszczalnego w wodzie na dostępnej na rynku drukarce 3D do wytłaczania. W ten sposób powstała opłacalna technika oparta na platformach szybkiego prototypowania, dzięki której można szybko badać i badać wiele różnych geometrii i rozmiarów rusztowań naczyniowych31. Niemniej jednak ograniczeniem tej metody jest limit rozdzielczości większości drukarek3D 32. Jednak wraz z szybko rozwijającą się branżą związaną z produkcją addytywną oczekuje się, że limity te z czasem ulegną poprawie. Stosowanie rozpuszczalników organicznych w procesie wytwarzania jest kolejnym ograniczeniem protokołu, ponieważ większość rozpuszczalników organicznych jest toksyczna dla komórek, uniemożliwiając połączenie procedury biodruku z procesem wytwarzania rusztowania naczyniowego.
Opisana metoda wysiewu światła rusztowania za pomocą aspiracji, a nie wypychania zawiesiny komórkowej, ma duży wpływ na lokalizację wysiewanych komórek. Zastosowanie podciśnienia pozwala na endotelizację wewnętrznego światła rusztowania przy jednoczesnej minimalizacji rozlewania się zawiesiny komórkowej przez perforacje na ścianie rusztowania16.
Opisana metoda "mankietowa" dla zespoleń mikrochirurgicznych może być łatwo modyfikowana i dostosowywana do różnych materiałów lub rozmiarów rusztowań naczyniowych, a także do różnych tętnic i żył w szerokiej skali modeli zwierzęcych. Adaptacje do protokołu obejmowałyby różne rozmiary rurek poliimidowych i rozmiary szwów. Metoda ta nie wymaga perforacji ściany rusztowania, co może prowadzić do powstania wad. W tej pracy przedstawiono protokół, który można rozszerzyć na wiele zastosowań. Krytyczne aspekty tego protokołu, które obejmują wytwarzanie naczyń krwionośnych w skali mezo- i mikro oraz ich montaż i implantację, reprezentują krytyczne aspekty zaprojektowanych płatów zarówno do zastosowań rekonstrukcyjnych, jak i do badań naczyniowych i innych badań inżynierii tkankowej.

Poważne wady tkanek są spowodowane urazami, wadami wrodzonymi lub chorobami, a obecnym złotym standardem leczenia tych wad jest stosowanie autologicznych przeszczepów, unaczynionych płatów tkankowych i mikronaczyniowych wolnych płatów jako substytutów tkanek. Jednak te opcje mają wady w postaci ograniczonej tkanki miejsca dawczego i zachorowalności na miejsce dawcze1. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na alternatywne substytuty tkanek, które można zastosować do korygowania tych wad2. Grubość inżynieryjnych konstruktów tkankowych jest ograniczona przez dyfuzję składników odżywczych i gazów w kierunku komórek, a zatem odpowiednia sieć naczyniowa jest niezbędna do generowania dużych, grubych i odpowiednio odżywionych rusztowań.
Zastosowano kilka podejść do promowania unaczynienia implantów inżynieryjnych3, w tym rekrutacja in vivo wsparcia naczyniowego od gospodarza, dostarczanie czynników wzrostu i cytokin w obrębie rusztowań, prewaskularyzacja implantów, generowanie przepuszczalnego, rozgałęziającego się łoża mikronaczyń za pomocą technik mikrowzorcowania4, wykorzystanie materiałów protektorowych do tworzenia kanałów naczyniowych/sieci5, a także tworzenie kanałów w 3D bioprinted constructs5,6. Unaczynienie grubych tkanek wymaga włączenia hierarchicznej sieci naczyniowej składającej się z naczyń w skali makro i mikrokapilarnej. Naczynia w skali makro skutecznie rozprowadzają krew w całym konstrukcie i pozwalają na mikrochirurgiczne zespolenia z naczyniami krwionośnymi gospodarza, podczas gdy naczynia w skali mikrokapilarnej umożliwiają dyfuzję składników odżywczych.
Bioprinting zyskał dużą uwagę w ostatnich latach ze względu na przewagę, jaką oferuje w porównaniu z konwencjonalnymi metodami inżynierii tkankowej. Tkanki i narządy to złożone i skomplikowane obiekty 3D o określonej architekturze. Biodruk 3D, dzięki zdolności do osadzania warstw biomateriałów w wysokiej rozdzielczości, umożliwia tworzenie złożonych substytutów tkanek i narządów (np. nerki, płuca, wątroba)7. Kilka technologii druku zostało dostosowanych do biodruku, w tym oparte na wytłaczaniu, inkjet8, deposition wspomagane laserowo9,10 i stereolitografia11,12 bioprinting. Technologie oparte na wytłaczaniu polegają na wytłaczaniu materiału przez dyszę poprzez wywieranie nacisku na powierzchnię masową materiału po przeciwnej stronie dyszy.
Free-form, odwracalne zatapianie zawieszonych hydrożeli (FRESH) to technika biodruku13,14, która wykorzystuje granulowany materiał podporowy, w którym wytłaczany materiał jest osadzany i mocowany na miejscu przez kąpiel podporową. Kąpiel podporowa zapewnia mechaniczne podparcie dla wytłaczanego, wstępnie usieciowanego biotuszu aż do jego usieciowania. Główną zaletą tej techniki jest to, że kąpiel podporowa pozwala na wytłaczanie materiałów o niskiej lepkości, które nie mogą zachować swojego kształtu po wytłaczeniu i przed usieciowaniem15. Rozszerza to pulę dostępnych materiałów, które można wykorzystać jako biotusze.
Ten artykuł przedstawia protokół generowania płata unaczynionego, który łączy w sobie mikroskalowe i mezoskalowe naczynia. Aby to osiągnąć, w rekombinowanym hydrożelu z metakrylanu ludzkiego kolagenu (rhCollMA) generowane są biodrukowane, samoorganizujące się sieci mikronaczyniowe, które następnie łączą się z wnętrzem większego, wszczepialnego, naczyniowego rusztowania, w wyniku czego powstaje w pełni zmodyfikowana tkanka flap16. Aby zapewnić szybką i bezpośrednią perfuzję tkanek inżynieryjnych, wymagane jest bezpośrednie zespolenie mikrochirurgiczne z naczyniami gospodarza. Rusztowanie naczyniowe nie ma wystarczającej wytrzymałości na utrzymanie szwów, aby można je było zespoleć przy użyciu tradycyjnego mikrochirurgicznego szycia ścian naczyń. Dlatego opisujemy metodę "mankiet"17,18,19 w celu uzyskania zespolenia ze wspólną tętnicą udową szczura. W tej metodzie końce naczyń zabezpiecza się szwami obwodowymi, bez konieczności perforacji ściany naczynia.
Chociaż proponowany protokół został przygotowany do badania hierarchicznego unaczynienia w środowisku rhCollMA, to podejście może być rozszerzone i zastosowane do wielu nowych zastosowań. Protokół można zastosować do biodrukowania różnych komórek specyficznych dla tkanek w różnych biotuszach. Co więcej, geometrię i rozmiar konstruktów można łatwo modyfikować w celu dopasowania do określonych wymagań, takich jak rekonstrukcja dużych tkanek lub badania biologiczne.

<table><tbody><tr><td>1,4-dioksan</td><td>Biosolve Chemical</td><td>42405</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0,5 "igły dozujące z końcówką</td><td>Dostawa CML</td><td>901-27-050</td><td></td></tr><tr><td>3cc bursztynowy zestaw cylindrów i tłoków strzykawek</td> Strzykawki <td>Nordson EFD</td><td>7012085</td><td>Amber używane do blokowania światła i zapobiegania przedwczesnemu sieciowaniu</td></tr><tr><td>5-0 AssuCryl PGA Szew absorbalny</td><td>Assut Szwy</td><td></td><td>Nici wchłanialne stosowane do zamykania ran skóry</td></tr><tr><td>6-0 nici polipropylenowe</td><td>Assut Sutures</td><td>9351</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski Acland</td><td>S& T</td><td>B-1V</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Adventitia</td><td>S& T</td><td>SAS-15</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki jubilerskie kątowe nr 3</td><td>S& T</td><td>JFAL-3-18</td><td></td></tr><tr><td>BioAssemblyBot 400 Biodrukarka 3D</td><td>Zaawansowane rozwiązania</td><td></td><td>6-osiowa biodrukarka 3D</td></tr><tr><td>Surowica albuminy bydlęcej Probumin</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; 82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>Filament BVOH</td><td>Verbatim</td><td>55903</td><td>rozpuszczalny w wodzie filament o średnicy 1,75 mm</td></tr><tr><td>Zacisk do kleszczy</td><td>S& T</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>Komórki macierzyste miazgi zęba</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski Dietrich Bulldog</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan di-sodu (Na2HPO4)</td><td>Carlo Erba Odczynniki</td><td>480141</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>S& T</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Wysoka glukoza, bez czerwieni fenolowej</td><td>Sartorius</td><td>01-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>ECM media + zestaw pocisków</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Grupa Gadot</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>substytut glutaminy</td></tr><tr><td>Koza anty-mysz Przeciwciało Cy3</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa&nbsp; 5,000 I.U./mL</td><td>Panpharma-Ludzkie</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>komórki mikronaczyniowe tkanki tłuszczowej</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>Stężenie podstawowe 1 mg / ml</td></tr><tr><td>izofluranu, USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-011-25</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244</td><td>żelatynowa zawiesina wspomagająca do biodruku FRESH 3D</td></tr><tr><td>Lithium phenyl-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td></td></tr><tr><td>Low-glucose DMEM</td><td>Biological Industries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E M1000E, 100-1,000 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-SMA</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu 4% w PBS</td><td>ChemCruz</td><td>&nbsp; SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny-nystatyny</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Poli(tlenek etylenu), MW250,000 do 400,000</td><td>Acros Organics</td><td>178602500</td><td></td></tr><tr><td>Poli(kwas L-mlekowy), IV 5,0 dl/g (PLLA)</td><td>Polysciencse, Inc.</td><td>18582-10</td><td></td></tr><tr><td>Rurka poliimidowa, ID: 0.0249", OD: 0.0273"</td><td>Cole-Parmer</td><td>95820-05</td><td>Cienkościenna rurka używana do produkcji mankietów do zespoleń mikrochirurgicznych</td></tr><tr><td>Drukarka 3D Prusa I3 MK2.5</td><td>Prusa Research</td><td>http://www.prusa3d.com/</td> <td>popularna komercyjna drukarka 3D</td></tr><tr><td>Resomer&nbsp; RG 503 H, poli(D,L-laktyd-ko-glikolid) (PLGA)</td><td>Evonik Industries</td><td>719870</td><td></td></tr><tr><td>rhCollMA</td><td>CollPlant</td><td>https://collplant.com/</td> <td>hojnie dostarczony przez CollPlant (Rehovot, Izrael)</td></tr><tr><td>uchwyt na igły z okrągłą rękojeścią</td><td>S& T</td><td>B-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela - #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>małe cienkie proste nożyczki</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Biosolve Chemiczny</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (NaH2PO4)</td><td>Riedel-de Haen</td><td>4276</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Oprogramowanie CAD Dassault Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze jubilerskie proste nr 3</td><td>S& T</td><td>JF-3-18</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste ząbkowane</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela chirurgicznego nr 15</td><td>Swann-Morton Limited</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>57836</td><td></td></tr><tr><td>TSIM</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>Oprogramowanie do krojenia i projektowania 3D dla BioAssembly Bot</td></tr><tr><td>Rozszerzacz naczyń</td><td>S& T</td><td>D-5a.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny Zeiss Tivato 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3d

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Inżynieria wszczepialnych, funkcjonalnych, grubych tkanek wymaga zaprojektowania hierarchicznej network. 3D naczyniowej bioprinting to technologia używana do tworzenia tkanek poprzez dodawanie warstwa po warstwie drukowalnych biomateriałów, zwanych biotuszami, oraz komórek w uporządkowany i automatyczny sposób, co pozwala na tworzenie bardzo skomplikowanych struktur, których tradycyjne techniki inżynierii tkankowej nie są w stanie osiągnąć. Tak więc biodruk 3D jest atrakcyjnym podejściem in vitro, które naśladuje natywną strukturę kompleksu naczyniowego, od naczyń milimetrowych po sieci mikronaczyniowe. 
Postępy w biodruku 3D w granulowanych hydrożelach umożliwiły wytłaczanie w wysokiej rozdzielczości biotuszów na bazie matrycy zewnątrzkomórkowej o niskiej lepkości. Ta praca przedstawia połączone biodrukowanie 3D i podejście do drukowania 3D opartego na formach ofiarnych do wytwarzania zaprojektowanych unaczynionych płatów tkankowych. Biodrukowanie 3D komórek śródbłonka i komórek podporowych przy użyciu rekombinowanego biotuszu kolagenowo-metakrylanowego w kąpieli żelatynowej jest wykorzystywane do wytwarzania samoorganizującej się sieci kapilarnej. Ta wydrukowana mikrokrążność jest złożona wokół mezoskalowego, przypominającego naczynie porowatego rusztowania, wytwarzanego przy użyciu ofiarnej formy wydrukowanej w 3D i jest obsadzana komórkami śródbłonka. 
Ten zespół indukuje śródbłonek naczynia mezoskalowego do zespolenia z otaczającą siecią naczyń włosowatych, tworząc hierarchiczną sieć naczyniową w obrębie zmodyfikowanego płata tkankowego. Zmodyfikowany płat jest następnie bezpośrednio wszczepiany przez zespolenie chirurgiczne do tętnicy udowej szczura przy użyciu techniki mankietowej. Opisane metody mogą być rozszerzone o wytwarzanie różnych unaczynionych płatów tkankowych do stosowania w chirurgii rekonstrukcyjnej i badaniach unaczynienia.

Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie zaprojektowanej łapy składającej się z rusztowania naczyniowego (Rycina 1Ai) oraz biodrukowanego mikro-układu naczyniowego (Rycina 1Aii), które zostały zmontowane w celu uzyskania unaczynienia w skali mezo i mikro (Rycina 1Aiii). Zgodnie z protokołem zaprojektowano i wydrukowano w technologii 3D formy z BVOH dla rusztowania naczyniowego (Rycina 1B,C). Otrzymane wydrukowane struktury poddano inspekcji wizualnej w celu wykrycia małych nici BVOH, które mogą występować w pustych przestrzeniach form (Rycina 1D). Nici te zazwyczaj wskazują na nieprawidłowe ustawienia materiału lub na to, że BVOH pochłonął wilgoć. Nici te należy usunąć, ponieważ mogą one prowadzić do niepełnego wypełnienia formy i wad strukturalnych w powstałym rusztowaniu naczyniowym. Następnie formy wypełniono roztworem PLLA:PLGA, po czym przeprowadzono proces liofilizacji oraz etapy płukania, zgodnie z opisem w protokole. Otrzymane rusztowanie naczyniowe z PLLA:PLGA poddano inspekcji wizualnej w celu weryfikacji integralności ścian naczyń oraz drożności światła (Rycina 1E).
Przygotowano zneutralizowany bioatrament rhCollMA o stężeniu 10 mg/mL i połączono go w stosunku 1:1 z roztworem PEO:LAP. Ludzkie mikrovascularne komórki śródbłonka tkanki tłuszczowej znakowane Zs-Green1 oraz mezenchymalne komórki macierzyste miazgi zębowej resuspendowano w bioatramencie rhCollMA, a następnie roztwór wprowadzono do wkładu drukującego i umieszczono w drukarce. Wewnątrz kąpieli wspierającej z żelatyny wydrukowano biostruktury w kształcie pudełek z centralnym kanałem o wzorze prostoliniowym (Rycina 1D). Po drukowaniu konstrukty poddano sieciowaniu, a kąpiel wspierającą rozpuszczono i wypłukano. Po 4 dniach hodowli wykonano obrazowanie żywych komórek w celu sprawdzenia samoorganizacji sieci mikrovascularnej. Rycina 1D przedstawia przykład wysoce rozwiniętej sieci mikrovascularnej HAMEC-ZsGreen1 w wydrukowanym biokonstrukcie.
Następnie do kanału centralnego wydrukowanej konstrukcji wprowadzono rusztowanie naczyniowe powlekane fibronektyną (Rycyna 2A). Złożone konstrukcje hodowano przez 2 dni, podczas których komórki kurczyły żel, mocno przytwierdzając go do rusztowania naczyniowego. Następnie, zgodnie z protokołem, rusztowanie naczyniowe wyściełano komórkami HAMECs wykazującymi ekspresję tdTomato. Po 7 dniach hodowli konstrukcje utrwalono i obrazowano. Rycina 2B przedstawia widok z boku złożonych konstrukcji, w których komórki śródbłonka w biodrukowanym mikrokrwiobiegu są zaznaczone na zielono, natomiast wyściółka śródbłonkowa rusztowania naczyniowego jest zaznaczona na czerwono. Obraz pokazuje zieloną samoorganizację mikro naczyniową w biodrukowanym żelu, podczas gdy rusztowanie naczyniowe jest wyściełane czerwonymi komórkami śródbłonka. Przy większym powiększeniu widoczne są wypustki pochodzące z czerwonej wyściółki śródbłonkowej, które kiełkują i anastomozyją z biodrukowaną siecią mikronaczyniową (Rycina 2C). Następnie konstrukcje barwiono na α-smooth muscle actin (SMA) jako marker dla mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba. Po immunobarwieniu konstrukcje obrazowano przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego (Rycina 2D).
Na koniec, po 7 dniach hodowli, zmodyfikowane płaty zostały poddane mikrochirurgicznemu zespoleniu z tętnicą udową szczura, zgodnie z opisem w protokole. Nagranie reprezentatywnej procedury można obejrzeć w Film uzupełniający S1. Rycyna 2E przedstawia reprezentacyjne zdjęcie wykonanych anastomoz przed usunięciem zacisków, a Rycina 2F przedstawia reprezentacyjne zdjęcie miejsca anastomozy po usunięciu zacisków i uzyskaniu hemostazy. Przed zamknięciem rany nie powinno być widocznych żadnych krwawień.
<img alt="Schemat procesu biodruku 3D dla rusztowań naczyniowych; obrazy przedstawiają projekt rusztowania, jego strukturę oraz komórki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy wytworzonych naczyń w skali mezo- i mikroskopowej. (A) Schematyczny przegląd etapów protokołu. Powielono za zgodą16. (B) Projekt CAD dla formy poświęcalnej rusztowania naczyniowego. (C) Widok z boku reprezentatywnej formy poświęcalnej wydrukowanej w 3D (pasek skali = 0,5 mm). (D) Widok z góry formy poświęcalnej (pasek skali = 0,5 mm) (E) Reprezentatywne rusztowanie naczyniowe wytworzone zgodnie z opisanym protokołem (pasek skali = 5 mm). (F) Projekt CAD dla biodrukowanej w 3D sieci mikrovascularnej rhCollMA. Linie siatki = 1 mm. (G) Reprezentatywny obraz wysoce rozwiniętej biodrukowanej sieci naczyniowej wykazujący HAMEC-ZsGreen1 na zielono. Pasek skali = 200 µm. Skróty: CAD = projektowanie wspomagane komputerowo; rhCollMA = rekombinowany ludzki kolagen metakrylowy; HAMEC = ludzkie komórki śródbłonka mikrovascularnego tkanki tłuszczowej; PLLA = kwas poli-L-mlekowy; PLGA = kopolimer kwasu polimlekowego i glikolowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Badanie perfuzji tkanki inżynieryjnej; HAMVEC-diTomato, HAMVEC-ZsGreen; mikroskopia, unaczynienie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy złożonego unaczynionego płata. (A) Zdjęcie reprezentatywnego zestawu biodrukowanego mikro-unaczynienia i rusztowania naczyniowego. Pasek skali = 1 mm. (B) Widok z boku reprezentatywnego inżynieryjnego płata obrazowanego 4 dni po wyścieleniu rusztowania naczyniowego komórkami endotelialnymi. Biodrukowane mikro-unaczynienie pokazano na zielono (HAMEC-ZsGreen1), natomiast wyściółkę endotelialną pokazano na czerwono (HAMEC-tdTomato). Pasek skali = 1 mm. (C) Reprezentatywny obraz anastomioz pomiędzy biodrukowanym unaczynieniem (kolor zielony) a wyściółką endotelialną (kolor czerwony). Pasek skali = 200 µm. (D) Reprezentatywny obraz immunobarwienia na aktynę mięśni gładkich (czerwony), jądra komórkowe (niebieski) i komórki endotelialne (zielony) po 7 dniach inkubacji. Pasek skali = 0.1 mm. (E) Reprezentatywny obraz ukończonej anastomiozy inżynieryjnego płata z tętnicą udową szczura przed zdjęciem zacisku i (F) po zdjęciu zacisku. Skróty: HAMEC = ludzkie mikro naczyniowe komórki endotelialne z tkanki tłuszczowej; SMA = aktyna mięśni gładkich; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo uzupełniające S1: Reprezentatywna procedura mikrosurgicalna anastomozy rusztowania naczyniowego z tętnicą udową szczura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/supplementary%20video%201%20(1).mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Nasz protokół pozwala naukowcom na generowanie hierarchicznych sieci naczyń krwionośnych w ramach w pełni zaprojektowanej i wszczepialnej klapy, co utorowało drogę do nowych badań nad zachowaniem naczyń krwionośnych w warunkach integracji in vivo. Technika ta połączyła wszechstronność dwóch technologii druku 3D w celu tworzenia i montażu naczyń w mikro i mezoskali, które można bezpośrednio zespolić z naczyniami gospodarza za pomocą mikrochirurgii. W pełni zmodyfikowane, unaczynione płaty mogą być stosowane do leczenia dużych ubytków tkanek, a także jako platforma do badania rozwoju i integracji tkanek.Proponowane metody mogą zostać rozszerzone o badanie inkorporacji komórek specyficznych dla tkanki, a także o ocenę zastosowania różnych biotuszy i materiałów pomocniczych. Rozpocznij od napełnienia formy BVOH 30 mikrolitrami roztworu polimeru. Odwiruj formę z prędkością 100 razy g przez 2 minuty i uzupełnij formę kolejnymi 20 mikrolitrami roztworu polimeru, aby zapewnić całkowite napełnienie.Zamroź napełnione formy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut, aby upewnić się, że cały roztwór polimeru zamarznie. Usuń rozpuszczalnik z foremek poprzez liofilizację przez noc. Aby usunąć protektorowy materiał formy, przenieś formy po procesie liofilizacji do 5-litrowej dejonizowanej łaźni wodnej pod delikatnym mieszaniem.Wymień wodę w wannie, gdy zrobi się mętna. Gdy cały BVOH się rozpuści, wysusz rusztowania na powietrzu i przechowuj je w komorze próżniowej do czasu użycia. Przenieś około 4 mililitry przygotowanego, zagęszczonego materiału podporowego do każdego dołka 12-dołkowej płytki za pomocą pipety wyporowej.Postukaj płytką studzienki o twardą powierzchnię, aby wymusić równomierne rozprowadzenie materiału podporowego w studzience. Przygotować zawiesinę zawierającą 2 miliony komórek macierzystych HAMEC-ZsGreen i 6 milionów komórek macierzystych miazgi zęba w 10 mililitrach pożywki z komórek śródbłonka. Odwirować zawiesinę komórkową 200 razy g przez 4 minuty, aby uzyskać osad komórkowy, następnie odessać pożywkę supernatantową i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 mililitrze biotuszu rhCollMA, aby uzyskać biotusz o całkowitym stężeniu komórek 8 milionów komórek na 1 mililitr biotuszu.Dopasuj igłę o średnicy wewnętrznej 0,22 milimetra do 3-mililitrowego bursztynowego wkładu drukarskiego i umieść wkład w 50-mililitrowej stożkowej tubie. Przenieś 1 mililitr mieszaniny komórek-biotuszu do wkładu drukującego, napełniając go od góry za pomocą pipety wyporowej w celu zmniejszenia pęcherzyków. Zainstaluj kasetę drukującą w odpowiednim narzędziu przy biodrukarce.Naszkicuj wzór 2D kwadratu o średnicy 4 milimetrów, w środku którego znajduje się okrągły kanał o średnicy 2 milimetrów. Wyciągnij szkic o 4 milimetry, aby uzyskać 4-milimetrowy sześcian z centralnym kanałem. Wyeksportuj ten obiekt jako plik STL.Zaimportuj szablon STL 12-dołkowej płytki do zakładki modelowania brył w oprogramowaniu do krojenia biodrukarki i umieść go w wyznaczonym obszarze wirtualnego stołu roboczego. Zaimportuj plik STL kształtu sześcianu do zakładki modelowania brył w oprogramowaniu do krojenia biodrukarki. Kliknij pole wyboru Użyj zewnętrznego fragmentatora, a następnie skonfiguruj fragmentator w sekcji właściwości obiektu.W wyskakującym oknie wybierz prostoliniowy wzór wzoru wypełnienia i wpisz 30%w polu Gęstość wypełnienia, kliknij przycisk Akceptuj. Kliknij sześcian i przesuń go za pomocą myszy, aby umieścić kopię kształtu sześcianu w każdej żądanej wirtualnej studni. Kliknij przycisk dodaj materiał w zakładce materiały w oprogramowaniu do krojenia bioprinter, aby utworzyć nowe ustawienia materiału dla biotuszu rhCollMA.Wybierz ustawienia materiału do drukowania. Dla ciśnienia typu 2 psi, a dla prędkości typu 20 milimetrów na sekundę w odpowiednich skrzynkach. Przypisz wartości szerokości i wysokości linii do 0,24 milimetra, a wartość przyspieszenia do 400 milimetrów na sekundę kwadratową.Na karcie modelowania bryłowego kliknij na obiekt sześcianu, a następnie kliknij na materiał rhCollMA w sekcji materiału, aby przypisać go do kształtu sześcianu. W zakładce biomontaż kliknij przycisk Wyślij zadanie drukowania, aby wysłać zadanie drukowania do biodrukarki. Załaduj wkład drukujący załadowany biotuszem komórkowym do 3-mililitrowego pneumatycznego narzędzia dozującego w temperaturze otoczenia biodrukarki opartej na wytłaczaniu 3D.Kliknij przycisk Chłodzenie w zakładce Sterowanie ogrzewaniem lub chłodzeniem na ekranie interfejsu biodrukarki, aby ustawić temperaturę stołu roboczego na 4 stopnie Celsjusza. Załaduj płytę z wanną podporową na łożu drukarki. Na karcie Drukuj na ekranie interfejsu biodrukarki kliknij zadanie drukowania, a następnie kliknij Start, a następnie GO, aby rozpocząć zadanie drukowania.Po wydrukowaniu wystaw płytkę studzienkową na działanie źródła światła o długości 405 nm i natężeniu 3 miliwatów na centymetr kwadratowy przez 30 sekund, aby zainicjować sieciowanie biotuszu rhCollMA. Po usieciowaniu inkubować płytkę studzienkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez co najmniej 20 minut, aż cała kąpiel podporowa się rozpuści. Delikatnie odessać płynną kąpiel podporową i zastąpić ją pożywką z komórek śródbłonka.Inkubuj konstrukty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Natychmiast po usunięciu materiału podporowego z biodrukowanej sieci mikronaczyniowej, umieść rusztowanie naczyniowe PLLA:PLGA pokryte fibronektyną obok struktury biodrukowanej. Umieść rusztowanie naczyniowe w głównym kanale struktury biodrukowanej.Inkubuj zmontowane konstrukcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni. Przygotuj zawiesinę komórkową ludzkich komórek mikronaczyniowych tkanki tłuszczowej wykazujących ekspresję tdPomidor w stężeniu 10 milionów komórek na mililitr. Umieść 20-mikrolitrową kroplę tej zawiesiny komórkowej na hydrofobowej powierzchni.Delikatnie umieść rusztowania naczyniowe na wierzchu kropli tak, aby światło rusztowania na jednym końcu stykało się z kroplą komórki. Zassać kroplę z przeciwległego końca rusztowania, wypełniając jego światło zawiesiną komórkową. Umieść osadzone rusztowanie w probówce mikrowirówki i umieść je w rotatorze w nawilżonym inkubatorze na 60 minut.Na koniec przenieś rusztowanie na 12-dołkową płytkę i dodaj 2 mililitry pożywki z komórek śródbłonka. Widok z boku reprezentatywnego płata zaprojektowanego przez cztery dni po wyściółce śródbłonka rusztowania naczyniowego jest pokazany tutaj. Biodrukowana mikrokrążność jest pokazana na zielono, podczas gdy wyściółka śródbłonka jest pokazana na czerwono.Reprezentatywny obraz przedstawia zespolenia między biodrukowanym układem naczyniowym a wyściółką śródbłonka. Barwienie immunologiczne aktyny mięśni gładkich, jąder i komórek śródbłonka po siedmiu dniach inkubacji pokazano tutaj. Reprezentatywny obraz przedstawia zakończone zespolenia zaprojektowanego płata z tętnicą udową szczura przed usunięciem klamry i po jej usunięciu.Technika ta może być wykorzystana do badania dojrzewania i integracji naczyń krwionośnych wydrukowanych w 3D in vivo oraz monitorowania perfuzji implantu w kończynie tylnej w celu ustalenia potencjału i bezpieczeństwa jego stosowania w leczeniu wad tkanek.

fabrication-engineered-vascular-flaps-using-3d-printing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Do tej pory, grube ubytki tkanek są zazwyczaj rekonstruowane za pomocą autologicznych płatów tkankowych lub tkanek zmodyfikowanych. W niniejszym protokole przedstawiamy nową metodę inżynierii unaczynionego płata tkankowego z autologiczną szypułką, która ma służyć jako substytut płatów autologicznych.

Zaprojektowana unaczyniona płat mięśniowa

Skalowalne naczynia krwionośne poprawiłyby możliwości zastosowania klinicznego. Korzystając z łatwo zwymiarowanych prowadnic drukowanych w 3D, stworzono pierścienie mięśni gładkich naczyń krwionośnych i ułożono je w formę rurkową, tworząc przeszczep naczyniowy. Przeszczepy można dobrać tak, aby spełniały zakres wymiarów ludzkich tętnic wieńcowych, po prostu zmieniając rozmiar prowadnicy wydrukowanej w 3D.

Skalowanie zaprojektowanych przeszczepów naczyniowych przy użyciu prowadnic drukowanych w 3D i metody układania pierścieni

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Tutaj prezentujemy protokół korzystania z trójwymiarowych drukowanych modeli do planowania przedoperacyjnego i śródoperacyjnej reorganizacji skomplikowanych lokalizacji naczyniowych podczas obsługi wrodzonej anomalii aorty.

Trójwymiarowy wydruk złożonej anomalii aorty

Ten protokół opisuje produkcję filamentu polikaprolaktonu (PCL) z wbudowanymi mikrosferami kwasu polimlekowego (PLA), które zawierają matryce decelularyzowane (DM) do druku 3D strukturalnych konstrukcji inżynierii tkankowej.

Nowatorski proces druku 3D matryc bezkomórkowych

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Obecny protokół opisuje model płata powięziowo-skórnego świń i jego potencjalne zastosowanie w badaniach nad unaczynionymi tkankami kompozytowymi.

Niezawodny model płata powięziowo-skórnego świni do badań bioinżynieryjnych unaczynionych kompozytowych przeszczepów allogenicznych

Protokół opisuje chirurgiczne pobieranie i późniejszą decelularyzację unaczynionych płatów świńskich poprzez perfuzję detergentu z dodecylosiarczanu sodu przez unaczynienie płata w dostosowanym bioreaktorze perfuzyjnym.

Pobieranie i perfuzja-decelularyzacja unaczynionych płatów świń w niestandardowym bioreaktorze perfuzyjnym

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Prezentujemy protokół do wysokoprzepustowej produkcji kanałów naczyniowych o elastycznych rozmiarach i pożądanych wzorach na standardowej sześciodołkowej płytce przy użyciu technologii biodruku 3D, określanej jako naczynia na płytce (VOP). Platforma ta ma potencjał, aby przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń związanych z upośledzonym śródbłonkiem.

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

Poznaj metodę wytwarzania zaprojektowanych płatów naczyniowych z hierarchiczną siecią naczyń krwionośnych przy użyciu druku 3D. Technika ta umożliwia bezpośrednie połączenie mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Przeglądaj więcej filmów