Name: Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj powtarzalny model zapalenia płuc u myszy do badania ostrego uszkodzenia płuc i jego ustępowania. Ta metoda umożliwia ocenę strategii terapeutycznych w chorobach zakaźnych i pulmonologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant HL131812 i R01HL163881 NIH.

Wszystkie protokoły dla zwierząt opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa, School of Medicine dla MO21M160 protokołu dla zwierząt. Ponadto eksperymenty przeprowadzono zgodnie z instytucjonalnymi, stanowymi i federalnymi przepisami dotyczącymi badań na zwierzętach.
UWAGA: Replikacja wszystkich opisanych poniżej protokołów musi być przeprowadzona w szafie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), zgodnie ze wszystkimi wytycznymi instytucjonalnymi BSL-2 w ramach szafy bezpieczeństwa biologicznego.
1. Posiewanie zapasów bakteryjnych z komercyjnych pętli
UWAGA: Ten protokół może być używany do hodowli zapasów bakteryjnych dla Spn (ATCC 49619) i Kpn (ATCC 43816), zaczynając od pętli kultu uzyskanych od dostawcy (szczegóły w Tabeli Materiałów).
<ol>
	<li>Ogrzewać płytkę z 5% agarem z krwią owczą przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. W tym celu można użyć inkubatora komórkowego.</li>
	<li>Pod maską zdejmij osłonkę z pętli do zaszczepiania bakterii i ostrożnie ją rozprowadz, wcierając smugi w płytkę agarową, zgodnie z zygzakowatym wzorem. Powtórz ten krok, używając oddzielnej płytki jako duplikatu. Za pomocą tej samej pętli można pokroić do pięciu talerzy.</li>
	<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w celu uzyskania optymalnego wzrostu bakterii. Przenikaj bakterie codziennie przez 3 dni. Ogrzewać płytki z agarem z krwią przez 15 minut w temperaturze 37 °C, pobrać od 15 do 20 kolonii z pierwszej płytki agarowej za pomocą jednorazowej pętli do zaszczepiania i rozprowadzić je na nowej, wstępnie podgrzanej płytce agarowej. Odpowiednio oznacz tabliczkę.</li>
</ol>
2. Rozwój i przechowywanie bakterii do wykorzystania w przyszłości
<ol>
	<li>Po 3 dniach zbierz do 30 kolonii z płytki z agarem z krwią za pomocą pętli smugowej i umieść je bezpośrednio w kolbie o pojemności 250 ml zawierającej bulion Todda Hewitta (bulion TH). Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 250 obr./min, z 5% CO2 przez około 4 godziny.</li>
	<li>Weź podwielokrotności co 15 minut, aby zmierzyć OD620 nm, aż osiągnie 0,3, co odpowiada około 3 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml.</li>
	<li>Natychmiast rozdzielić 1 ml nowych bakterii do fiolek kriogenicznych o pojemności 2 ml. Błyskawiczne zamrożenie świeżo porcjowanych fiolek w ciekłym azocie przez 5 minut. Porcje bakterii należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C (fiolki można używać do 6-8 miesięcy, zanim stracą swoją moc).</li>
	<li>Po 7 dniach zamrażania podwielokrotności można wykorzystać do badań na zwierzętach. Dlatego określ nowe stężenie bakterii.</li>
</ol>
3. Bakterie rozmrażające się do wkraplania dotchawiczego
<ol>
	<li>Ogrzewać płytkę z agarem z krwią przez 10 minut w temperaturze 37 °C w shakerze. Wyjąć jedną z nowych fiolek z wywarem z zamrażarki i rozmrozić ją delikatnie mieszając w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez około 2 minuty. Unikaj dotykania O-ringu lub nasadki ciepłą wodą.</li>
	<li>Płytka na płytce z agarem do krwi do ręcznego liczenia kolonii bakterii. Wykonać rozcieńczenie 1 x 10-6 i umieścić 200 μl z ostatniego rozcieńczenia na wstępnie podgrzanej płytce z agarem do krwi. Zrób to w duplikatach.</li>
	<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w celu optymalnego wzrostu bakterii. Następnego dnia zastosuj następujący wzór, aby określić stężenie nowej bakterii: CFU/ml = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia) / objętość posiewu</li>
</ol>
4. Wkraplanie dotchawicze żywych bakterii
UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany do wkraplania objętości 50 μL dotchawiczo. Zapasy bakteryjne można przechowywać do 6-9 miesięcy. Aby zapewnić obecność bakterii w każdej fiolce, należy ją umieścić na talerzu przed każdym eksperymentem, obliczyć zapas bakteryjny CFU zgodnie z powyższym opisem i użyć bulionu TH do kolejnych rozcieńczeń.
UWAGA: Pod szafką bezpieczeństwa biologicznego, przeprowadź procedurę przetrwania gryzoni przy użyciu sterylnych narzędzi chirurgicznych.
<ol>
	<li>Znieczulić mysz, wstrzykując dootrzewnowo 100 mg/kg ketaminy i 2,5 mg/kg acetylopromazyny. Powtórz te czynności dla liczby myszy, którym wstrzykuje się jednorazowo. 
	UWAGA: Myszy mogą być narażone na działanie izofluranu, aby ułatwić obchodzenie się ze zwierzętami. Jednak doświadczony opiekun, który jest w stanie wstrzykiwać dootrzewnowe środki znieczulające bez powodowania znacznego stresu u zwierząt, może uniknąć ekspozycji na izofluran. Liczba myszy do wstrzyknięcia zależy od wiedzy chirurga.</li>
	<li>Po tym, jak wszystkie myszy są pod odpowiednim znieczuleniem, potwierdź znieczulenie przez uszczypnięcie ogona. Umieść znieczuloną mysz na czystej i wysterylizowanej powierzchni, zawieś zwierzę za siekacze i delikatnie przyklej przednie kończyny taśmą (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Aby zapewnić dobre samopoczucie zwierząt, należy zapewnić smarowanie rogówki wszystkim znieczulonym zwierzętom. Można stosować krople do oczu z karboksymetylocelulozą, stosując jedną kroplę na oko.</li>
	<li>Ogol okolice szyi i zdezynfekuj obszar chlorheksydyną i 70% alkoholem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj 1 cm powierzchowne nacięcie szyi w linii środkowej, aby uwidocznić tchawicę (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1B). Jedno małe nacięcie powinno wystarczyć, ale jeśli zauważysz obfitość tkanki tłuszczowej, ostrożnie rozetnij tkankę tłuszczową pionowo, aby uwidocznić tchawicę. 
	UWAGA: Używaj sterylnych rękawiczek i sterylnych narzędzi techniką tylko końcówek. Ryzyko infekcji jest minimalne, jeśli zabieg jest wykonywany w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zaintubuj każdą mysz. Delikatnie wyciągnij język na zewnątrz i wprowadź przez usta cewnik angiologiczny o pojemności 20 G, wprowadzając cewnik do tchawicy. Delikatnie uciskaj tchawicę, aby ułatwić intubację. 
	UWAGA: Ponieważ tchawica znajduje się z przodu ciała myszy, lekko zegnij końcówkę cewnika, ponieważ pomoże to uzyskać kąt do pomyślnej intubacji myszy. Nacięcie szyi wykonuje się głównie w celach wizualizacyjnych; Alternatywnie operator może zaintubować tchawicę na ślepo.</li>
	<li>Po intubacji podłącz mysz do respiratora, aby potwierdzić intubację. Standardowe parametry respiratora stosowane w tej procedurze to 200 μl objętości wyrzutowej i 200 uderzeń na minutę. Zwiększyj i/lub zmniejsz na chwilę prędkość wentylatora, aby szybko i łatwo potwierdzić.</li>
	<li>Po potwierdzeniu intubacji odłącz mysz od respiratora i ostrożnie wkraplaj 50 μl czynnika bakteryjnego przez angiocewnik za pomocą końcówki ładującej żel do pipet o pojemności 200 μl. W przypadku myszy kontrolnych wstrzyknij 50 μl sterylnego bulionu TH.</li>
	<li>Po wkropleniu czynnika bakteryjnego ponownie podłącz mysz do respiratora, aby wznowić oddychanie. Pozostaw mysz na respiratorze na 30-60 sekund. Po wstrzyknięciu wszystkim myszom monitoruj ich oddech. Jeśli występuje powolny wzorzec oddychania, ponownie podłącz myszy do respiratora.</li>
	<li>Zamknij nacięcie, dodając jedną małą kroplę kleju na skórę. Zbliż do siebie fałdy skóry i delikatnie dociśnij, aż klej wyschnie.</li>
	<li>Umieść myszy na poduszce grzewczej w celu odzyskania sił i uważnie je monitoruj, aż odzyskają wystarczającą przytomność. Przenieś myszy z powrotem do klatki, gdy w pełni wyzdrowieją. W celu leczenia bólu pooperacyjnego/dystresu myszy można leczyć buprenorfiną w dawce 0,05-0,1 mg/kg podskórnie (SC). 
	UWAGA: Zwierzęta, u których utrata masy ciała jest większa niż 20% lub doświadczają znacznego stresu po zabiegu, takiego jak letarg, niemożność dotarcia do wody lub pożywienia, trudności w oddychaniu, upośledzona reakcja na bodźce zewnętrzne lub zmniejszona czujność umysłowa, powinny zostać poddane eutanazji.</li>
</ol>
5. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i pobieranie płuc
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji, umieszczając ją w zamkniętym pojemniku zawierającym 5% izofluranu. Kontynuuj ekspozycję na izofluran przez 1 minutę po tym, jak mysz przestanie oddychać. Wykonaj torakotomię, aby potwierdzić eutanazję. 
	UWAGA: Potwierdzić eutanazję za pomocą oględzin i badania fizykalnego. Serce musiało przestać bić, a myszy nie oddychały. Błony śluzowe powinny być białe lub blade.</li>
	<li>Połóż mysz w pozycji leżącej na czystej desce chirurgicznej i zawieś ją za siekacze. Spryskaj skórę myszy 70% etanolem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj małe powierzchowne nacięcie szyi w linii środkowej, aby uwidocznić tchawicę myszy.</li>
	<li>Kanulować tchawicę za pomocą cewnika 20 G. Ostrożnie dodać dotchawczo 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem bezwapniowym (PBS) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Pozwól na pełne rozszerzenie płuc, a następnie odessaj płyn za pomocą tej samej strzykawki. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie 2 ml.</li>
	<li>Przenieść BAL do podwielokrotności o pojemności 2 ml. Wykonaj ten krok dwukrotnie, aby uzyskać końcową objętość 2 ml. Nie należy płukać płuc więcej niż 1 ml na raz, ze względu na wysokie ryzyko przerwania przestrzeni pęcherzykowej.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową i odsłoń płuca, serce i tchawicę za pomocą nożyczek i kleszczy. Ostrożnie rozetnij membranę i wyjmij klatkę piersiową. Uważaj, aby nie uszczypnąć tkanki płucnej.</li>
	<li>Przeciąć aortę brzuszną, aby umożliwić wykrwawienie. Wykonaj perfuzję tkanki płucnej, wykonując małe nacięcie około 2 mm w prawej komorze za pomocą nożyczek i wstrzyknij 5 ml zimnego PBS za pomocą cewnika 20 G. PBS powinien wykonać perfuzję w płucach. Jeśli zostanie wykonana odpowiednia perfuzja, tkanka płucna zmieni kolor na biały i zblednie, a PBS opuści przedział wewnątrznaczyniowy przez aortę brzuszną.</li>
	<li>Ostrożnie wyekstrahuj płuca i wypreparuj je z tchawicy, aby przeprowadzić histologię lub dalsze przetwarzanie do zawiesiny pojedynczej komórki.</li>
	<li>W przypadku przetwarzania do badania histologicznego ostrożnie wprowadzić cewnik 20 G, aby napełnić płuca do 25 cm H2O roztworem formaliny (obojętny bufor 10%). Po wdmuchiwaniu płuc przełóż pod tchawicę sznurek do szycia 3,0 o długości około 5 cm i mocno go mocno zawiąż dwukrotnie, aby formalina pozostała w tkance płucnej. Delikatnie odetnij płuco od reszty tkanek i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml roztworu formaliny.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego
<ol>
	<li>Odwirować BAL przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć bezkomórkowy supernatant do oddzielnej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: W supernatancie BAL można przeprowadzić dalszą analizę, w tym kwantyfikację białek (np. test BCA13) lub pomiar określonych biomarkerów lub cytokin (testy ELISA i testy wielokrotne z platformami takimi jak MSD i Luminex).</li>
	<li>Lizować czerwone krwinki, dodając 100 μl buforu lizującego przez 1 minutę. Zneutralizować reakcję lizy, dodając 1 ml PBS. Odwirować BAL przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w PBS (100-300 μl; w zależności od wielkości osadu komórkowego). Wykonaj zliczanie komórek z 0,4% barwieniem błękitu trypanowego za pomocą ręcznego lub automatycznego zliczania komórek. Pozostałą osadkę należy użyć do barwienia cytometrią przepływową i/lub kriokonserwacji (poprzez ponowne zawieszenie w roztworze do kriokonserwacji) w ciekłym azocie do dalszych testów.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie płuc w celu zawieszenia pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Delikatnie odciąć płuco od reszty tkanek i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml zimnego PBS. Wyjmij płuco z PBS i osusz je ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Przygotuj koktajl trawienny, dodając 1 mg DNazy i 5 mg kolagenazy do 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) o niskiej zawartości glukozy. Przenieś płuco do rurki C zawierającej 1 ml koktajlu trawiennego.</li>
	<li>Przenieś rurkę C do dysocjatora tkanek i postępuj zgodnie ze standardowym protokołem przetwarzania tkanki płucnej14.</li>
	<li>Dodaj 10 ml zimnego PBS do rurki C i odpowiednio wymieszaj. Przefiltruj zawiesinę jednokomórkową za pomocą sitka o wielkości 70 μm umieszczonego na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wykonaj filtrację dwukrotnie.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ostrożnie zdekantować supernatant i dodawać 1 ml buforu lizującego przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Dodać 10 ml zimnego PBS, aby zatrzymać reakcję lizy i usunąć supernatant.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Ostrożnie zdekantować supernatant i dodać 10 ml zimnego PBS.</li>
	<li>Przeprowadź zliczanie komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym za pomocą ręcznego lub automatycznego zliczania komórek. Do barwienia metodą cytometrii przepływowej należy użyć osadu komórkowego i/lub kriokonserwacji w ciekłym azocie w celu przeprowadzenia dalszych badań.</li>
</ol>

<ol><li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+patterns+of+care%2C+and+mortality+for+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+in+intensive+care+units+in+50+countries%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries.</a> JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
<li>Hariri, L., Hardin, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covid-19%2C+angiogenesis%2C+and+ARDS+endotypes%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Covid-19, angiogenesis, and ARDS endotypes.</a> The New England Journal of Medicine. 383 (2), 182-183 (2020).</li>
<li>Ferguson, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berlin+definition+of+ARDS%3A+an+expanded+rationale%2C+justification%2C+and+supplementary+material%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Berlin definition of ARDS: an expanded rationale, justification, and supplementary material.</a> Intensive Care Medicine. 38 (10), 1573-1582 (2012).</li>
<li>Tomashefski Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+pathology+of+the+adult+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Chest+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary pathology of the adult respiratory distress syndrome.</a> Clinics in Chest Medicine. 11 (4), 593-619 (1990).</li>
<li>Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cytokines+and+ARDS%3A+Roger+S.+Mitchell+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Lung cytokines and ARDS: Roger S. Mitchell lecture.</a> Chest. 116 (1 Suppl), 2S-8S (1999).</li>
<li>Colletti, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor-alpha+in+the+pathophysiologic+alterations+after+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor-alpha in the pathophysiologic alterations after hepatic ischemia/reperfusion injury in the rat.</a> The Journal of Clinical Investigation. 85 (6), 1936-1943 (1990).</li>
<li>Donnelly, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+mortality+rates+and+decreased+concentrations+of+interleukin-10+and+interleukin-1+receptor+antagonist+in+the+lung+fluids+of+patients+with+the+adult+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The association between mortality rates and decreased concentrations of interleukin-10 and interleukin-1 receptor antagonist in the lung fluids of patients with the adult respiratory distress syndrome.</a> Annals of Internal Medicine. 125 (3), 191-196 (1996).</li>
<li>Miller, E. J., Cohen, A. B., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+interleukin-8+concentrations+in+the+pulmonary+edema+fluid+of+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+from+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased interleukin-8 concentrations in the pulmonary edema fluid of patients with acute respiratory distress syndrome from sepsis.</a> Critical Care Medicine. 24 (9), 1448-1454 (1996).</li>
<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (5), 725-738 (2011).</li>
<li>Kulkarni, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%3A+an+official+American+Thoracic+Society+Workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: an official American Thoracic Society Workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), e1-e14 (2022).</li>
<li>Borsa, N., Pasquale, M. D., Restrepo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animal models of pneumococcal pneumonia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4220(2019).</li>
<li>Rubins, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+pneumolysin+in+the+early+pathogenesis+of+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Dual function of pneumolysin in the early pathogenesis of murine pneumococcal pneumonia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 95 (1), 142-150 (1995).</li>
<li>Thermo Scientific, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pierce+BCA+Protein+Assay+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pierce BCA Protein Assay Kit.</a> , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23225 Forthcoming.</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1266(2009).</li>
<li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+an+official+American+Thoracic+Society+Workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. an official American Thoracic Society Workshop report.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).</li>
<li>Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+acute+respiratory+distress+syndrome%3A+a+review+of+analytical+approaches%2C+pathologic+features%2C+and+common+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of acute respiratory distress syndrome: a review of analytical approaches, pathologic features, and common measurements.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1074-1092 (2015).</li>
<li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Pneumonia.</a> Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 25(2021).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+resolves+pneumonia+via+ER%CE%B2+in+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Estradiol resolves pneumonia via ERβ in regulatory T cells.</a> JCI Insight. 6 (3), e133251(2021).</li>
<li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resolution+of+experimental+ARDS+through+IL-4-mediated+lung+macrophage+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced resolution of experimental ARDS through IL-4-mediated lung macrophage reprogramming.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (8), L733-L746 (2016).</li>
<li>D'Alessio, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+acute+lung+injury+and+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of acute lung injury and ARDS.</a> Methods in Molecular Biology. 1809, 341-350 (2018).</li>
<li>Gotts, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+model+of+pneumococcal+pneumonia%2C+ARDS%2C+and+nonpulmonary+organ+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), L717-L736 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Eksperymentalne mysie modele PNA stanowią platformę do oceny mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw uszkodzenia i ustąpienia ARDS. Składniki patofizjologiczne, które można ocenić, obejmują wczesne szlaki zapalne, usuwanie bakterii, dynamiczne zmiany krajobrazu immunologicznego, ustąpienie stanu zapalnego, fibroproliferację oraz naprawę nabłonka i naczyńkrwionośnych 16. Jednak planując powtórzenie tego modelu uszkodzenia płuc wywołanego zapaleniem płuc, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów, w tym wiek, płeć, szczep myszy, wewnętrzne czynniki gospodarza (np. stan obniżonej odporności), specyficzny patogen i obciążenie bakteryjne oraz doświadczenie personelu wykonującego zabieg.
PNA jest jedną z głównych przyczyn ARDS. Zdecydowaliśmy się użyć żywych Spn i Kpn, które są najczęstszymi przyczynami PNA nabytego przez społeczność i szpital odpowiedniou ludzi17. Sugerujemy optymalizację modeli bakteryjnych PNA poprzez miareczkowanie dawek żywych bakterii w celu osiągnięcia pożądanego profilu śmiertelności i ustępowania urazów, który najlepiej pasuje do hipotezy badacza. Zoptymalizowaliśmy inokulację bakteriami dotchawiczymi 3 x 106 CFU dla Spn i 200 CFU dla Kpn u myszy, co spowodowało zapalenie pęcherzyków płucnych, przerwanie bariery pęcherzykowo-raśnikowatej i dysfunkcję narządów (ryc. 2). Jednak partie bakterii z różnych źródeł, a nawet w obrębie zduplikowanych pętli, mogą wykazywać różne stopnie zapalenia i urazu, nawet przy użyciu tego samego szczepu i CFU.
Dlatego, aby powtórzyć wyniki przedstawione w tym manuskrypcie, naukowcy powinni zacząć od opisanego tutaj stężenia bakterii; Może być jednak konieczne zwiększenie lub zmniejszenie dawki w celu uzyskania podobnego profilu modelu. W związku z tym każda nowa partia wykorzystywanych bakterii musi być zoptymalizowana pod kątem potencjalnego efektu rozwiązania urazu. Przedstawiamy solidny model PNA z dwoma różnymi wynikami rozdzielczości, jednym samorozwiązującym się (Spn) i drugim wolnorozdzielczym/nierozwiązującym (Kpn), które mogą służyć jako platformy dla badaczy do oceny mechanizmów immunologicznych i testowania interwencji terapeutycznych, szczególnie w szczycie lub po szczycie infekcji (np. 2 dni po zakażeniu).
Wiek, płeć, szczep i czynniki genetyczne wpływają na kinetykę wzorców rozwiązywania urazów16. Na przykład płeć powoduje przyspieszoną rozdzielczość u kobiet w porównaniu z mężczyznami18; Dlatego wzrost obciążenia bakteryjnego prowadzi do zwiększonej śmiertelności i opóźnionego ustąpienia u mężczyzn w porównaniu z samicami. Starzenie się jest kolejnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę przy miareczkowaniu CFU wykorzystywanych bakterii. Starzejące się myszy wykazywały 100% śmiertelność, gdy użyliśmy określonej dawki Spn (nie pokazanej tutaj). Młode myszy są najczęściej wykorzystywane w pneumokokowych modelach PNA (w okresie od 6 do 14 tygodni), podczas gdy myszy w wieku 19-26 miesięcy) wykazują zmienioną odpowiedź immunologiczną i są wykorzystywane do badania roli starzenia się w PNA11 . Musieliśmy zmniejszyć CFU do 300%, aby osiągnąć przeżycie u starzejących się zwierząt (nie pokazane tutaj). W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 (w wieku 8-12 tygodni) i obserwowano je przez 6 do 10 dni po zakażeniu. Znaczące różnice w wrażliwości można również znaleźć między szczepami; Szczepy wsobne, takie jak BALB/C i C57BL6/J, mają różną odpowiedź na zakażenie11,19.
Bezpośrednia inokulacja bakterii dotchawiczo pozwala na bardziej precyzyjne dostarczenie inokulum (do 99%) do płuc12, co stanowi alternatywę dla mniej zjadliwych serotypów i zmniejsza aerozolizację bakterii11. Można jednak argumentować, że jest to procedura inwazyjna. Intubacja może być trudna, wymaga znieczulenia ogólnoustrojowego i może prowadzić do urazu tchawicy, a następnie obrzęku dróg oddechowych i stridoru. Myszy mogą rozwinąć odruch wazowagalny, który prowadzi do bezdechu, w przypadku którego wymagane jest posiadanie małego respiratora myszy, aby w razie potrzeby zapewnić dodatkowe wsparcie respiratora. Wiedza specjalistyczna chirurga wykonującego zabieg jest kluczowym elementem gwarantującym udaną intubację11. W naszym badaniu żadne myszy nie musiały być poddawane eutanazji ze względu na odpowiednie leczenie bólu i nie większą niż 20% utratę masy ciała. Nie zaobserwowano żadnych oznak bólu i niepokoju, takich jak letarg, niemożność dotarcia do wody lub jedzenia, trudności w oddychaniu lub zmniejszona czujność umysłowa. Alternatywną metodą bezpośredniego dostarczania bakterii do płuc jest aspiracja ustno-gardłowa, chociaż ustąpienie uszkodzenia płuc wydaje się następować szybciej, a niektóre bakterie mogą trafić do żołądka i przewodu pokarmowego20.
Modele przedkliniczne PNA umożliwiają badaczom ocenę krajobrazu immunologicznego. Przedziały oskrzelowo-pęcherzykowe i śródmiąższowe można ocenić pod kątem dynamicznych zmian w komórkach odpornościowych16. Co więcej, komórki mogą być hodowane i stymulowane ex vivo w celu określenia ich specyficznej produkcji cytokin i chemokin. Tutaj skupiamy się na badaniu krajobrazu komórek odpornościowych w płucach i BAL za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej. Można również przeprowadzić sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, aby zrozumieć sygnatury transkryptomiczne specyficzne dla komórki na różnych etapach ustępowania urazu.
Modele PNA-ARDS generują efekty ogólnoustrojowe, które można wcześnie wykryć, mierząc masę ciała w trakcie choroby10. Chociaż nie mierzymy bezpośrednio ogólnoustrojowych skutków ARDS, dysfunkcję narządów można również ocenić za pomocą pomiaru profili chemicznych krwi oraz poprzez pobieranie różnych tkanek, takich jak śledziona, nerki i wątroba do badania histologicznego. Ogólnoustrojowe działanie pneumokokowe PNA-ARDS zostało wcześniej opisane przez inne grupy wykorzystujące ten sam szczep bakterii21.
W tym miejscu opisano model eksperymentalnego PNA, który przypomina niektóre z kluczowych zmian patofizjologicznych leżących u podstaw ludzkiego ARDS. Chociaż nie ma idealnych modeli, które w pełni oddają złożoność i niejednorodność ludzkiego ARDS9, modele te są istotne i powtarzalne dla badania mechanizmów uszkodzenia i naprawy płuc, służąc również jako platforma do identyfikacji nowych potencjalnych celów farmakologicznych, które koncentrują się na przyspieszeniu ustąpienia zapalenia płuc i promowaniu naprawy płuc.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63925">Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Host infection response graphs; body weight, protein, cell counts vs. days; infection comparison." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">
to:
<img alt="Body weight and immune cell count graphs; infection time course; statistical analysis; infection study." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63925">Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia</a>. A figure was updated.

Erratum: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) pozostaje powszechnym zespołem śmiertelnym i powodującym niepełnosprawność, który dotyka około 10% pacjentów na oddziale intensywnej terapii (OIOM) i do 23% osób pod wentylacją mechaniczną, prowadząc do śmiertelności szpitalnej na poziomie 35%-46%1. Co więcej, niedawna pandemia COVID-19 ponownie podkreśliła znaczenie studiowania ARDS. Pozytywne przypadki COVID-19 przyczyniły się do wzrostu śmiertelności z powodu ARDS, podkreślając ograniczenia terapii farmakologicznych2.
U ludzi ARDS charakteryzuje się szybkim początkiem hipoksemii (PaO2/FiO2 < 300) i dowodami na niehydrostatyczny obustronny obrzęk płuc spowodowany nadmierną przepuszczalnością pęcherzyków płucnych i zapaleniem pęcherzyków płucnych3. Chociaż ARDS jest tradycyjnie opisywany jako wzorzec ostrego uszkodzenia płuc (ALI) wtórnego do różnych urazów, bakteryjne i wirusowe zapalenie płuc (PNA) pozostaje jedną z najczęstszych przyczyn. Opisano trzy główne etapy patofizjologiczne, a mianowicie etapy wysiękowe, proliferacyjne i zwłóknieniowe, podczas gdy dwie główne cechy kardynalne ARDS to rozregulowane zapalenie i rozerwanie pęcherzyków płucnych4. Podczas tych procesów uszkodzenie pęcherzyków płucnych jest spowodowane uwalnianiem cytokin zapalnych (np. czynnika martwicy nowotworu [TNF-α], interleukiny [IL-1β, IL-6, IL-8 itp.]), napływem neutrofili i makrofagów zapalnych oraz zalaniem płynu bogatego w białko. Ostatecznie zdarzenia te prowadzą do niejednolitych i obustronnych uszkodzeń wyrostka zębodołowego5,6,7,8.
Chociaż poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu wczesnych uszkodzeń płuc i stanów zapalnych, mechanizmy leżące u podstaw rozwiązywania PNA są mniej znane i powinny być przedmiotem przyszłych badań mechanistycznych. Głównym celem tej pracy metodologicznej jest dostarczenie badaczom modelu zakaźnego zapalenia płuc w celu rozwiązania urazu, który może odtworzyć główne cechy patofizjologiczne ARDS. Sugerujemy, że model ten pomoże lepiej zrozumieć mechanizmy biologiczne leżące u podstaw ustąpienia zapalenia płuc i naprawy, służąc w ten sposób jako platforma dla terapii ratunkowej.
Główne etapy fizjopatologii występujące podczas ARDS mogą być odtworzone w przedklinicznych modelach zwierzęcych ALI, które powinny zawierać histologiczne dowody reakcji zapalnej, uszkodzenia tkanek, dysfunkcji fizjologicznych, zapalenia pęcherzyków płucnych i zmiany bariery pęcherzykowo-kapilarnej9. Model myszy, który indukuje PNA i ALI, jest korzystny ze względu na wysoką odtwarzalność, szybką hodowlę i dostępność wielu narzędzi do wykonywania badań mechanistycznych i molekularnych. Nie ma jednego modelu, który w pełni podsumowywałby wszystkie cechy ludzkiego ARDS9.
Modele PNA u myszy pozwalają na replikację kluczowych mechanizmów patofizjologicznych wytwarzanych przez zakaźne ARDS u ludzi, takich jak szybki początek, dowody uszkodzenia tkanek w histologii, uszkodzenie bariery pęcherzykowo-kapilarnej, dowody reakcji zapalnej i dysfunkcja fizjologiczna, powodując przy tym niewielką śmiertelność10 . Modele zakaźne mogą być indukowane przez miejscowe lub ogólnoustrojowe dostarczanie patogenu, przy czym najczęstszymi drogami podawania są podanie donosowe, dotchawicze i dożylne. Droga dotchawicza umożliwia bezpośrednie wprowadzenie czynnika zakaźnego do płuc, zmniejszając aerozolowanie i optymalizując dostarczanie11,12.
Metodologia przedklinicznego mysiego modelu PNA poprzez dotchawcze wkroplenie żywych Streptococcus pneumoniae (Spn) lub Klebsiella pneumoniae (Kp) jest opisana tutaj. Modele te stanowią dobry substytut ARDS wytwarzanego przez bakteryjne PNA, posiadając kilka zalet, w tym: powszechne przyczyny ludzkiego PNA-ARDS (nabyte przez społeczność i szpital); wysoka powtarzalność; śmiertelność i urazy można łatwo miareczkować (modelując różne stopnie zapalenia płuc), aby wykazać silną odpowiedź zapalną, prowadzącą do zapalenia pęcherzyków płucnych i dysfunkcji pęcherzyków włosowatych; ocenę wczesnych i późnych faz uszkodzenia płuc oraz ustąpienie objawów; oraz ocena strategii terapeutycznych na różnych etapach PNA-ARDS.

<table><tbody><tr><td>1-200 i mikro; L Okrągłe końcówki do pipet o grubości 0,5 mm</td><td>Corning</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Fiolki kriogeniczne</td><td>Corning Incorporated</td><td>431420</td><td>2 mL wolnostojące, okrągłe dno, czerwona nakrętka, polipropylen</td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf&nbsp; Mikrowirówka zatrzaskowa Biopur Safe-Lock Probówki</td><td>Fisherscientific</td><td>05-402-24C</td><td>Kształt:&nbsp; Okrągły, Długość (metryczna):&nbsp; 38mm, Średnica (metryczna) Zewnętrzna:&nbsp; 10mm, Pojemność (metryczna):&nbsp; 2 ml</td></tr><tr><td>70 i mikro; m Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Białe, sterylne, pakowane pojedynczo</td></tr><tr><td>96-dołkowe przezroczyste okrągłe dno</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td>&nbsp; Mikropłytka do hodowli komórkowych traktowana TC, z pokrywką, indywidualnie pakowana, sterylny</td></tr><tr><td>maleinian acepromizyny do wstrzykiwań, USP 500 mg/50 ml (10 mg/ml)</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-604-04</td><td>KAŻDY ml ZAWIERA: maleinian acepromazyny 10 mg, cytrynian sodu 0,36%, kwas cytrynowy 0,075%, alkohol benzylowy 1% i wodę do wstrzykiwań.</td></tr><tr><td>Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>118-156-721</td><td>4 x 100 ml</td></tr><tr><td>Anty-mysi I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107628</td><td>APC/Cyjanina7 anty-mysie I-A/I-E [M5/114.15.2]; Izotyp:</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>IgG2b Szczur Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BD Tryptykaza Agar sojowy&nbsp;</td><td>BD-Biosciences</td><td>90001-276</td><td>5% Płytki układacza z krwią owczą przygotowaną do krwi, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>Jednorazowe zbiorniki na odczynniki Biotix</td><td>Biotix</td><td>89511-194</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Invitrogen</td><td>509723</td><td>Integryna alfa E) Chomik ormiański anty-Mysz, FITC, klon: 2E7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Invitrogen</td><td>RM2817</td><td>PE-Texas Red, Klon: M1/70.15, Invitrogen</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>565872</td><td>Chomik anty-Mysz, APC-R700, Klon: N418, BD Horizon</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td><td>APC anty-mysz CD19 [1D3/CD19]; Izotyp: Szczur IgG2a, &kappa;</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>563450</td><td>Szczurzy anty-Mysz, Brilliant Violet 711, Klon: M1/69</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>563790</td><td>BUV395; Klon: GK1.5</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td>103157</td><td>Brilliant Violet 750 anty-mysz CD45 [30-F11]; Izotyp: Szczur IgG2b, &kappa;;</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>612759</td><td>Szczur anty-mysi, genialny ultrafiolet 737, klon: 53-6,7</td></tr><tr><td>Szkiełka do liczenia komórek&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1450017</td><td>Do licznika komórek TC20</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 70 i mikro; L Nylon</td><td>Falcon</td><td>198718</td><td>REF 352350</td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ1&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus pneumoniae&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>R4609015</td><td>ATCC 4961</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pętle/igły do zaszczepiania</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-603</td><td>Kolor niebieski; Tom 1 & L</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium)</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>CD16/CD32 Szczurzy anty-mysz, nieoznakowany, klon: 2.4G2</td></tr><tr><td>Roztwór formaliny</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>HT501640</td><td>Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10%</td></tr> <tr><td>gąbki z gazy, Covidien</td><td>Curity</td><td>2146-gentleMACS</td><td></td></tr> <tr><td>C Rurki</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Dysocjator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>SN: 4715</td></tr><tr><td>Ręczny system barwienia Hema 3 i pakiet statystyk</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>23123869</tr><tr><td>Izofluran Płynna inhalacja</td><td>Henry Schein</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>CEWNIK DOŻYLNY JELCO 20GX1.25"</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc</td><td>405611</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl Injection</td><td>Henry</td><td>Schein 1049007</td><td>Ketamina HCl Injection MDV 100mg/mL 10mL 10/pudełko</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td>subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan</td></tr><tr><td>Loctite 409</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>7257009</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128036</td><td>Brilliant Violet 605 anty-mysie Ly-6C [HK1.4]; Izotyp: Szczur IgG2c</td></tr><tr><td>Ly-6G</td><td>BD Biosciences</td><td>740157</td><td>Szczur anty-mysz, Brilliant Violet 510, Klon: 1A8, BD Optibuild</td></tr><tr><td>MiniVent Typ 845</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>4694</td><td>D-79232 March (Niemcy)</td></tr><tr><td>NK-1.1</td><td>BD Biosciences</td><td>553165</td><td>Mysz anty-mysz, PE, Klon: PK136,</td></tr><tr><td>BD Hemacytometr fazowy</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>1X bez wapnia i magnezu,</td></tr> <tr><td>probówki do polistyrenu okrągłodennego</td><td>Sarstedt</td><td>55.476.305</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>z zatrzaskowym sitkiem do komórek, 5 ml</td></tr><tr><td>SealRite 1,5 ml Naturalna probówka do mikrowirówek</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Nie zawiera wykrywalnych rnaz, DNazy, DNA i pirogenów.</td></tr><tr><td>Shandon EZ Pojedynczy cytolejek</td><td>Epredia</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Siglec-F</td><td>BD Biosciences</td><td>562681</td><td>Anti-Mouse, Brilliant Violet 421, Klon: E50-2440</td></tr><tr><td>Jedwabny pleciony 30 "(75 cm) Sterylny, niewchłanialny szew chirurgiczny U.S.P.</td><td>Ethicon</td><td>K-834 0</td><td>(3,5 metra)</td></tr> <tr><td>Klips do suwaka ze stali nierdzewnej</td><td>Epredia</td><td>59910052</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe filtry próżniowe</td><td></td><td></td> Strzykawka Thermo Scientific 1660045 <td></td></tr><tr><td>sterylna, jednorazowego użytku, 1 ml</td><td>BD-Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>508BR05740</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 200 ul żółta pipeta wkład do końcówki</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>TODD HEWITT ROSÓŁ</td><td>RPI</td><td>T47500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Komora na próbki TPX</td><td>Epredia</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>Pojedyncza komora na próbki TPX, nasadki i karty filtracyjne</td><td>Epredia</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Bio-rad</td><td>1450022</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Strzykawki do insuliny</td><td>BD-Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Odporna na wilgoć elektryczna poduszka grzewcza Multi-Heat</td><td>Cullus</td><td>Model PR7791AB</td><td>120 obj. AC; 45 Watów; Wymieniono 562B/E26869</td></tr></tbody></table>

eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) powoduje ostre uszkodzenie płuc, charakteryzujące się szybkim uszkodzeniem pęcherzyków płucnych i ciężką hipoksemią. To z kolei prowadzi do wysokiej zachorowalności i śmiertelności. Obecnie nie ma modeli przedklinicznych, które podsumowywałyby złożoność ludzkich ARDS. Jednak zakaźne modele zapalenia płuc (PNA) mogą odtworzyć główne cechy patofizjologiczne ARDS. Tutaj opisujemy model PNA indukowanego przez wkroplenie dotchawicze żywych Streptococcus pneumoniae i Klebsiella pneumoniae u myszy C57BL6. W celu oceny i scharakteryzowania modelu, po wywołaniu urazu, przeprowadziliśmy seryjne pomiary masy ciała i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) w celu pomiaru markerów uszkodzenia płuc. Dodatkowo pobraliśmy płuca pod kątem liczby komórek i różnic, kwantyfikacji białka BAL, cytospiny, liczby jednostek tworzących kolonie bakteryjne i histologii. Na koniec wykonano wysokowymiarową cytometrię przepływową. Proponujemy ten model jako narzędzie do zrozumienia krajobrazu immunologicznego we wczesnej i późnej fazie ustąpienia uszkodzenia płuc.

Opisane powyżej procedury pozwoliły na wymodelowanie mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw uszkodzenia płuc indukowanego bakteryjnym zapaleniem płuc u myszy. W celu rozpoczęcia modelowania, myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego (WT) pozyskano z Jackson Laboratory i hodowano w zwierzęcej pracowni instytutu. Samce myszy WT C57BL/6 w wieku 8 tygodni poddano inokulacji dotchawiczej bulionem TH (kontrola), 3 x 106 CFU żywych Spn lub 200 CFU żywych Kpn. Po infekcji myszy monitorowano odpowiednio przez 6 i 10 dni w przypadku Spn i Kpn. Choć grupy zainfekowane wykazywały niższą masę ciała w porównaniu do niezinfekowanej grupy kontrolnej, grupa Spn odzyskała masę ciała zbliżoną do poziomu wyjściowego, natomiast myszy zainfekowane Kpn wykazały powolny powrót do normy po 6 dniach od infekcji (Rycina 2A). W trakcie trwania badania żadna z myszy nie wymagała eutanazji z powodu spadku masy ciała o ponad 20% i nie stwierdzono oznak bólu ani stresu.
Mierzyliśmy uszkodzenie płuc w różnych odstępach czasu. Stężenie białka w BAL oraz całkowita liczba komórek zarówno w BAL, jak i w płucach były wyraźnie wyższe w grupach zainfekowanych (Rysunek 2). Reprezentatywne przekroje histologiczne ukazujące proces zapalny w obu modelach pobrano w 2., 4. i 6. dobie po inokulacji (Rycina 3), co wskazuje na utrzymujący się stan zapalny pęcherzyków płucnych w Kpnmyszy zainfekowane (Rysunek 4), nawet w 10. dniu. Kpnu myszy zakażonych utrzymywały się urazy do 10. dnia (Rycina 2 i Rycina 4), podczas gdy Spnu myszy zakażonych zapalenie płuc ustąpiło do 6. dnia (Rycina 2 i Rycina 3).
Zawiesiny pojedynczych komórek płuc wykorzystano do analizy profilu odpornościowego za pomocą wielowymiarowej cytometrii przepływowej w 6. dniu po zakażeniu w modelu Spn , stosując 18-kolorowy panel w sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Dzięki zastosowaniu t-rozkładu stochastycznego zanurzenia sąsiadów (t-SNE) można zwizualizować ogólne różnice w składzie komórek odpornościowych, wśród których zauważalny jest zwiększony udział granulocytów (CD45+, CD11b+, CD24+, MHC-II-), makrofagów śródmiąższowych (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-), monocytów (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-, CD64-), limfocytów B (CD45+, CD19+) oraz limfocytów T (CD45+, CD3+), w tym komórek natural killer (CD45+, CD3+, NK1.1+), co przedstawiono na Rysunku 5. Strategie bramkowania pokazano na Rysunku 6.
<img alt="Schemat przygotowania myszy do zabiegu: etapy znieczulenia, pozycjonowania i intubacji w procedurze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Procedura chirurgiczna w celu intratrachealnego podania żywych bakterii. (A) Pozycja myszy w sterylnym polu operacyjnym, zawieszonej za siekacze. (B) Obszar nacięcia i odsłonięcie tchawicy. (C) Proces intubacji z wprowadzeniem cewnika 20 G. Rycina stworzona za pomocą Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy masy ciała i odpowiedzi komórek odpornościowych; analiza wpływu infekcji w czasie; porównanie danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Profile ostrego uszkodzenia płuc (ALI) po modelach zapalenia płuc. (A) Masa ciała w czasie względem wartości wyjściowej; grupa kontrolna w porównaniu z Kpn oraz Spn (n = 4 na grupę). (B) Ilościowe oznaczenie całkowitej zawartości białka w BAL za pomocą testu BCA (n = 4 na grupę). (C) Całkowita liczba komórek w BAL w grupie kontrolnej (n = 3), Kpn (n = 4) i Spn (n = 3). (D) Całkowita liczba komórek w płucach w grupie kontrolnej (n = 3), Kpn (n = 4) i Spn (n = 3). (E-G) Rozkład różnicowy komórek BAL na podstawie ręcznego zliczania histologicznego cytospinów BAL w grupie kontrolnej (n = 3), Kpn (n = 4) i Spn (n = 3). Testy statystyczne przeprowadzono za pomocą indywidualnego testu t, porównując kontrolę niezinfekowaną z grupami zinfekowanymi. *p &lt; 0.05. Dane przedstawiono z błędem standardowym (SE) dla każdego wykresu. Oś y dla wszystkich paneli to dni po infekcji. Skróty: BAL = płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe; Spn = Streptococcus pneumoniae; Kpn = Klebsiella pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig02v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histologia płuc i BAL w warunkach niezakażonych i zakażonych Spn. Mikroskopia, badanie osi czasu infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Znaleziska histopatologiczne płuc podczas infekcji Spn. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) przekrojów histologicznych reprezentatywnego BAL i płuc po intratrachealnej infekcji Spn w dniach 2, 4 i 6. Powiększenie BAL = 100x; powiększenie płuc = 10x. Skróty: BAL = płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe; Spn = Streptococcus pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat BAL i tkanki płuc pokazujący postęp infekcji Kpn w ciągu 10 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki histopatologiczne płuc podczas infekcji Kpn. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) przekrojów histologicznych reprezentatywnego BAL oraz sekcji płuca po intratrachealnej infekcji Kpn w dniach 2, 4, 6 i 10. Obrazy przedstawiają duże powiększenie (pasek skali = 50 µm). Skróty: BAL = płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe; Kpn = Klebsiella pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozkład klastrów komórek, wykresy kołowe, wykresy słupkowe; analiza komórek odpornościowych, badanie wpływu infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Profil komórek odpornościowych w wielokolorowej cytometrii przepływowej po 6 dniach infekcji Spn . (A) Do wizualizacji populacji komórek odpornościowych (CD45+) w płucach zastosowano stochastyczne osadzanie sąsiadów t-rozdzielonych (t-SNE) w porównaniu grupy kontrolnej niezinfekowanej z grupą zinfekowaną. (B) Podsumowanie częstości występowania komórek odpornościowych w stosunku do całkowitej liczby komórek CD45+ w płucach. (C) Całkowita liczba komórek w każdej poszczególnej populacji. Porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą testów t między grupą kontrolną a zinfekowaną. *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0,001. Dane na wykresach przedstawiono jako błąd standardowy (SE). Skróty: BAL = płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe; Spn = Streptococcus pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej; identyfikacja komórek odpornościowych za pomocą markerów fluorescencyjnych, wykresy SSC/FSC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Strategie bramkowania w celu identyfikacji subpopulacji komórek odpornościowych w płucach w stanie wyjściowym oraz po zapaleniu płuc. Płyn z BAL i zawiesina komórek płucnych zostały poddane barwieniu do wielokolorowej cytometrii przepływowej. W pierwszej kolejności odrzucono debris przy użyciu parametrów SSC-A i FSC-A, a pojedyncze komórki wyodrębniono za pomocą dwóch strategii (SSC-W vs. SSC-H oraz FSC-W vs. FSC-H). Żywe komórki zidentyfikowano przy użyciu dyskryminatora live/dead względem SSC-A. Następnie zidentyfikowano poszczególne populacje komórek przy użyciu wcześniej określonych markerów 15. Skrót: BAL = płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Protokół ten zapewnia powtarzalny model zapalenia płuc, który generuje solidne, ostre uszkodzenie płuc. Inną zaletą tego modelu jest to, że może być stosowany do rozmnażania zakaźnego ARDS lub zespołu ostrej niewydolności oddechowej u myszy. Jak już wspomniałem, model ten jest wysoce powtarzalny, w którym poziom śmiertelności i obrażeń można łatwo dostosować w celu oceny wczesnych i późnych faz ostrego uszkodzenia płuc oraz ustąpienia, co służy jako platforma do oceny strategii terapeutycznych.Chociaż protokół ten nie zapewnia nowatorskiego podejścia do diagnozowania lub leczenia uszkodzeń płuc, jest wiarygodnym modelem, w którym można testować nowe terapie, co jest szczególnie przydatne w obszarach związanych z immunologią, chorobami płuc i chorobami zakaźnymi. Jedną z zalet tej techniki jest jej powtarzalność. Jednak osoby wykonujące tę technikę po raz pierwszy mogą odczuwać trudności z wprowadzaniem cewnika dotchawiczo.Dlatego najlepiej byłoby, gdyby osoby uczące się tej techniki zaczęły ćwiczyć na zwierzętach poddanych eutanazji. Na początek podgrzej płytkę z agarem z krwią przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w podgrzewanym shakerze lub inkubatorze. Wyjmij nową fiolkę z preparatem bakteryjnym z zamrażarki i rozmroź ją delikatnie mieszając w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż fiolka zostanie całkowicie rozmrożona.Unikaj dotykania O-ringu lub nasadki ciepłą wodą. Aby ręcznie policzyć kolonie bakterii na płytce, wykonaj rozcieńczenie 1 razy 10 do szóstego i umieść 200 mikrolitrów od ostatniego rozcieńczenia na wstępnie podgrzanej płytce z agarem do krwi. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia należy określić stężenie nowej bakterii, stosując podaną formułę. Umieść znieczuloną mysz na czystej i wysterylizowanej powierzchni. Zawieś mysz za siekacze i delikatnie przyklej przednie kończyny.Ogol okolice szyi i zdezynfekuj obszar chlorheksydyną i 70% alkoholem. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj jednocentymetrowe nacięcie szyi w linii powierzchownej pośrodkowej, aby uwidocznić tchawicę. Jeśli zauważysz obfitość tkanki tłuszczowej, ostrożnie wypreparuj tkankę tłuszczową w pionie, aby uwidocznić tchawicę.Delikatnie wyciągnij język na zewnątrz i wprowadź przez usta cewnik naczynio-naczyniowy o rozmiarze 20, przesuwając cewnik do tchawicy. Delikatnie uciskaj tchawicę, aby ułatwić intubację. Po intubacji podłącz mysz do respiratora, aby potwierdzić intubację.Ustaw parametry wentylatora na 200 mikrolitrów objętości oddechowej i 200 uderzeń na minutę. Po potwierdzeniu intubacji odłącz mysz od respiratora i ostrożnie wkraplaj 50 mikrolitrów czynnika bakteryjnego przez cewnik angiologiczny za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, końcówki do ładowania żelem. Po instalacji ponownie podłącz mysz do respiratora, aby wznowić oddychanie.Pozostaw mysz na respiratorze na 30 do 60 sekund, aby monitorować oddech. Jeśli zaobserwuje się powolny oddech, ponownie podłącz mysz do respiratora. Zamknij nacięcie, dodając jedną kroplę kleju do skóry.Zbliż do siebie fałdy skóry i delikatnie dociśnij, aż klej wyschnie. Połóż uśpioną mysz na wznak na czystej desce chirurgicznej i zawieś ją za siekacze. Po spryskaniu skóry myszy 70% etanolem, za pomocą nożyczek wykonaj małe, powierzchowne wycięcie szyi w linii środkowej, aby uwidocznić tchawicę.Kanniulować tchawicę za pomocą cewnika o rozmiarze 20 i ostrożnie dodać jeden mililitr wolnego od wapnia PBS dotchawiczo za pomocą strzykawki o średnicy jednego mililitra. Pozwól na pełne rozszerzenie płuc, a następnie odessaj płyn za pomocą tej samej strzykawki. Powtórz procedurę dwa razy, w sumie dwa mililitry.Przenieść płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe lub BAL do dwumililitrowej podwielokrotności. Za pomocą nożyczek otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić płuco, serce i tchawicę. Ostrożnie wypreparuj membranę i wyjmij klatkę piersiową, uważając, aby nie uszczypnąć tkanki płucnej.Przeciąć aortę brzuszną, aby umożliwić wykrwawienie. Perfuzję tkanki płucnej należy wykonać małe nacięcie o długości około jednego do dwóch milimetrów w prawej komorze za pomocą nożyczek i wstrzyknąć pięć mililitrów zimnego PBS za pomocą cewnika o rozmiarze 20. Po udanej perfuzji tkanka płucna staje się biała i blada, a PBS opuszcza przedział wewnątrznaczyniowy przez aortę brzuszną.Następnie ostrożnie wyjmij płuco i wypreparuj je z tchawicy. Alternatywnie, jeśli płuco jest używane do histologii, ostrożnie włóż cewnik o rozmiarze 20, aby napompować płuca do 25 centymetrów roztworem formaliny. Po wdmuchiwaniu płuc przełóż pod tchawicą sznurek do szwów 3/O o długości około pięciu centymetrów i zawiąż go mocno dwukrotnie, aby formalina pozostała w tkance płucnej.Delikatnie odetnij płuco od reszty tkanek i umieść je w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 10 mililitrów roztworu formaliny. Odwirować BAL w temperaturze 500 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i usunąć bezkomórkowy supernatant do oddzielnej probówki. Poddać lizie czerwone krwinki, dodając 100 mikrolitrów buforu lizującego przez jedną minutę.Zneutralizuj reakcję lizy, dodając jeden mililitr PBS. Odwirować BAL i usunąć supernatant przed ponownym zawiesieniem osadu w 100 do 300 mikrolitrach PBS. Następnie wykonaj zliczanie komórek z 0,4% niebieskim barwnikiem trypanowym za pomocą automatycznego zliczania komórek.Delikatnie wypreparuj płuco z tkanek w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów zimnego PBS. Po rozbiorze należy wyjąć płuco z PBS i osuszyć je ręcznikiem papierowym. Wypreparuj prawe i lewe płuco z innych tkanek, które również zostały usunięte, takich jak tchawica.Przygotuj koktajl trawienny zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i przenieś płuca do rurki C zawierającej jeden mililitr koktajlu trawiennego. Przenieś rurkę do dysocjatora tkanek i postępuj zgodnie ze standardowym protokołem przetwarzania tkanki płucnej. Po dysocjacji dodaj 10 mililitrów zimnego PBS do probówki i odpowiednio wymieszaj.Przefiltruj zawiesinę jednokomórkową za pomocą sitka komórkowego o średnicy 70 mikronów na 50-mililitrowej stożkowej rurce na lodzie. Odwirować zawiesinę i usunąć supernatant. Dodaj jeden milimetr buforu lizującego przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj 10 mililitrów zimnego PBS, aby zatrzymać reakcję lizy i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w PBS i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym za pomocą automatycznego zliczania komórek. Po uszkodzeniu płuc wywołanym bakteryjnym zapaleniem płuc u myszy, zakażone grupy wykazywały niższą masę ciała w porównaniu z niezakażoną kontrolą.Grupa Streptococcus pneumoniae lub Spn odzyskała masę ciała w kierunku wartości wyjściowej, podczas gdy myszy Klebsiella pneumoniae lub Kpn wykazywały powolny powrót do zdrowia po sześciu dniach infekcji. Stężenie białka BAL i całkowita liczba komórek zarówno w BAL, jak i w płucach były znacznie wyższe w grupach zakażonych. Reprezentatywne skrawki histologiczne pokazujące proces zapalny w obu modelach uzyskano w drugim, czwartym i szóstym dniu po inokulacji, wykazując dowody na utrzymujące się zapalenie pęcherzyków płucnych u myszy zakażonych Kpn, nawet w dniu 10.Myszy zakażone Kpn kontynuowały uraz do 10 dnia, podczas gdy myszy zakażone Spn ustąpiły z zapalenia płuc do szóstego dnia. Krajobraz komórek odpornościowych za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej po sześciu dniach infekcji Spn wykazał zwiększoną liczbę granulocytów, makrofagów śródmiąższowych, monocytów, limfocytów B i limfocytów T, w tym komórek NK. Podczas próby tej metody, wprowadzenie cewnika jest kluczem do uzyskania replikowalnych infekcji.Jest to wiarygodna metoda, która służy jako platforma do identyfikacji celów do badania ostrego uszkodzenia płuc i ustąpienia.

experimental-model-to-evaluate-resolution-of-pneumonia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje proces powstawania infekcji płuc u immunokompetentnego modelu gryzoni poprzez intubację i instalację zawiesin bakteryjnych w płatach płuc. Model ten umożliwia badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych.

Wkraplanie dooskrzelowe Streptococcus pneumoniae w immunokompetentnych modelach gryzoni

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Opisano metodę wykrywania infekcji płuc u gryzoni immunokompetentnych. Przy wprawdzie metodę tę można szybko i łatwo przeprowadzić w celu wywołania stabilnego zakażenia wieloma izolatami S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae i A. baumannii.

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Zakaźne zapalenie płuc jest jedną z najczęstszych infekcji u ludzi. Odpowiedni model in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy choroby i testowania skuteczności nowych terapii. Dzięki temu mysiemu modelowi aspiracyjnego zapalenia płuc w jamie ustnej i gardle można zbadać patogenezę i nowe metody leczenia tych śmiertelnych infekcji.

Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu

Tutaj prezentujemy metody poprawy badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie nieinwazyjnej drogi wkraplania do dolnych dróg oddechowych, po której następuje odzyskiwanie patogenów i analiza transkryptów. Zabiegi te są powtarzalne i mogą być wykonywane bez specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowe.

Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Selektywne wkraplanie kwasu dooskrzelowego do lewego płuca u myszy powoduje jednostronne i samoograniczające się ostre uszkodzenie płuc, które modeluje ludzki zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) wywołany aspiracją kwasu żołądkowego.

Model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc przez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Eksperymentalny mysi model przerzutów do płuc i immunoterapii CTL do analizy oddziaływań komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.

Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

Poznaj powtarzalny model zapalenia płuc u myszy do badania ostrego uszkodzenia płuc i jego ustępowania. Ta metoda umożliwia ocenę strategii terapeutycznych w chorobach zakaźnych i pulmonologicznych.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Przeglądaj więcej filmów