Izolacja i identyfikacja wodnych bakterii opornych na antybiotyki oraz charakterystyka molekularna ich genów oporności na antybiotyki

Nasza metoda odpowiada na kluczowe pytania, takie jak: jakie jest całkowite obciążenie bakteriami opornymi na antybiotyki w próbce wody? Jaka jest tożsamość tych bakterii i jakie są różne rodzaje cech oporności na antybiotyki i genów, które przenoszą? Zaletą naszego protokołu jest to, że może wykryć nawet bakterie, których nie można wyhodować w laboratorium, a które stanowią znaczną część wszystkich bakterii w próbce wody.

W związku z tym teoretycznie żadna bakteria ani jej cechy odporności nie są pominięte. Ta technika kombinatoryczna, obejmująca zarówno techniki oparte na kulturach, jak i niezależne od kultury, może być powielana i dostosowywana do dowolnej próbki uzyskanej ze ścieków, ścieków farmaceutycznych lub szpitalnych, warunków klinicznych i nieklinicznych i nie tylko. Razem z Deviką procedury eksperymentalne zademonstrują Harshali Shinde i Maitri Mishra, obaj starsi pracownicy naukowi z mojego laboratorium.

Na początek przetrzyj próbkę wody w sposób aseptyczny, filtrując ją przez sterylną muślinową szmatkę w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych. Następnie przefiltrowaną próbkę wody należy seryjnie rozcieńczyć do dalszej analizy. Aby określić całkowite obciążenie bakteryjne, należy umieścić 100 mikrolitrów odpowiednich rozcieńczeń przefiltrowanej próbki wody na zestalonych płytkach agarowych R2A i duplikatach i równomiernie rozprowadzić.

Inkubować wszystkie płytki do rozprowadzania próbek w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po okresie inkubacji policz kolonie i wyraź całkowite obciążenie bakteryjne w jednostkach tworzących kolonie na mililitr. Aby określić liczbę bakterii opornych na antybiotyki, dodaj antybiotyki oddzielnie do probówek zawierających 20 mililitrów sterylnego stopionego agaru R2A zmodyfikowanego w przybliżeniu w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

Zamieszać do równomiernego wymieszania i wylać na sterylne płytki Petriego, zanim agar zastygnie. W celu kontroli jakości i sprawdzenia skuteczności antybiotyków rozprowadź 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej na odpowiednich płytkach zmodyfikowanych agarem zawierających antybiotyk R2A. Inkubuj płytki w temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin, a następnie określ liczbę bakterii.

Aby przygotować matrycę DNA z izolatów do PCR, za pomocą sterylnej wykałaczki należy pobrać pojedynczą izolowaną czystą kolonię izolatu rosnącą na płytce Petriego. Zawiesić kolonię bakteryjną w 100 mikrolitrach sterylnej podwójnie destylowanej wody w probówce z mikrowirówką i gotować we wrzącej łaźni wodnej lub suchej kąpieli przez 10 minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Odwirować zawiesinę o stężeniu 10 000 g przez dwie minuty w celu osadzenia szczątków i przeniesienia supernatantu do świeżej sterylnej probówki do mikrowirówki, która ma służyć jako surowa matryca DNA.

Aby amplifikować region V3 genu 16S rRNA metodą PCR, należy przygotować 40 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej w probówce do PCR. Umieść probówkę w bloku termicznym i uruchom odpowiedni program w termocyklerze PCR. W celu rozdzielenia i wizualizacji amplikonów PCR, wymieszaj 10 mikrolitrów amplifikowanego produktu PCR w dwóch mikrolitrach 6-krotnego buforu ładującego żel i załaduj tę mieszaninę do studzienek 1,5% żelu agarozowego wraz z drabinką 100 sparowanych zasad DNA w celu oszacowania wielkości amplikonów.

Przeprowadzić elektroforezę żelu w buforze zbiornika TAE przy napięciu od 80 do 100 woltów, aż barwnik śledzący będzie przebiegał przez 3/4 żelu. Następnie zwizualizuj pasma amplikonów pod transiluminatorem UV. Aby przygotować inokulum, należy aseptycznie zaszczepić pojedynczą izolowaną oczyszczoną kolonię oporności na antybiotyki za pomocą sterylnej pętli w dwóch mililitrach bulionu Luria-Bertani lub LB bez antybiotyku i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 80 obr./min przez noc.

Następnego dnia dodaj 100 do 150 mikrolitrów wyhodowanej przez noc kultury do dwóch mililitrów świeżego nieselektywnego bulionu LB i inkubuj przez dwie do czterech godzin, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,4 do 0,5. Rozcieńczyć świeżo wyhodowaną zawiesinę hodowli za pomocą sterylnego 0,85% roztworu soli fizjologicznej i delikatnie wymieszać, aby równomiernie rozprowadzić komórki, aby osiągnąć gęstość hodowli odpowiadającą 0,5 wzorca McFarlanda. W ciągu 15 minut od rozcieńczenia zanurzyć sterylny wacik w inokulum i usunąć nadmiar zawiesiny, aby uniknąć nadmiernego zaszczepienia płytek.

Następnie równomiernie rozprowadź kulturę na przygotowanej płytce agarowej Mueller Hinton, zaczynając od góry i przechodząc tam iz powrotem od krawędzi do krawędzi. Następnie obróć płytkę o 60 stopni i ponownie rozpocznij pobieranie wacika. Aby umieścić krążki z antybiotykiem, użyj sterylizowanych płomieniowo kleszczy i aseptycznie przenieś krążki z antybiotykiem na zaszczepione płytki agarowe.

Delikatnie dociśnij krążki, aby zapewnić pełny poziom kontaktu z agarem. Umieść odpowiednią liczbę krążków antybiotyku na płytce agarowej, biorąc pod uwagę organizm, zastosowany antybiotyk i rozmiar płytki, aby uniknąć nakładania się stref inhibicji. W ciągu 15 minut od aplikacji krążka z antybiotykiem odwróć płytki i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia należy zmierzyć strefę średnicy inhibicji w milimetrach i zinterpretować ją zgodnie z wartościami punktu granicznego podanymi przez EUCAST. Stwierdzono, że całkowite obciążenie bakteryjne w próbce wody wynosi od 3,0 x 10 do dziewiątego CFU/ml, a obciążenie bakterii opornych na antybiotyki okazało się wysokie. Zsekwencjonowane izolaty kulturowe oporności na antybiotyki należały do rodziny Enterobacteriaceae, z których większość to Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae.

Ponadto zidentyfikowano również rzadkie bakterie oportunistyczne. Badanie wrażliwości na antybiotyki metodą dyfuzji krążkowej wykazało wskaźnik wielorakiej oporności na antybiotyki wynoszący około 0,2 dla ośmiu izolatów, co wskazuje na wysoki stopień oporności. Jednak gatunki Comamonas i Arthrobacter nie wykazywały oporności na żaden z badanych antybiotyków.

Izolaty hodowlane wykazały obecność genów oporności na antybiotyki kodujących czynniki przeciwko beta-laktamom, trimetoprimowi i aminoglikozydom. Metagenomiczna analiza DNA dla całkowitej różnorodności bakteryjnej doprowadziła do zidentyfikowania 50 typów, co wskazuje na wysoką różnorodność bakteryjną, w której Proteobacteria był najbardziej dominującą gromadą, składającą się z klas Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria i Gammaproteobacteria. Na poziomie zamówienia najbardziej rozpowszechniony był Burkholderiales, należący do klasy Betaproteobacteria.

Na poziomie ogólnym Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium i Comamonas były jednymi z licznych bakterii. Analiza metagenomicznego DNA ujawniła również więcej genów oporności na antybiotyki. W tej metodzie etap seryjnego rozcieńczania ma kluczowe znaczenie, ponieważ każdy błąd może prowadzić do błędnej interpretacji całkowitej CFU i obciążenia bakteriami opornymi na antybiotyki.

Należy również dokładnie zmierzyć średnicę strefy inhibicji, aby prawidłowo zinterpretować, czy izolat jest oporny lub wrażliwy. Korzystając z tych protokołów, oprócz próbki wody, można badać każdą inną próbkę, czy to środowiskową, żywnościową czy kliniczną. Co więcej, oprócz bakterii, przy użyciu podobnych podejść można również badać inne populacje drobnoustrojów w dowolnym ekosystemie.