Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych do wytwarzania analogów kostnych

Protokół ten umożliwia wytwarzanie analogów kości bez konieczności podgrzewania lub stosowania toksycznych chemikaliów. W ten sposób powstają struktury kostne, które mogą naprawić ubytek kostny w warunkach klinicznych przy użyciu własnych komórek pacjenta. Główną zaletą tej techniki jest to, że tusz kostny może być drukowany z żywymi komórkami, tworząc dowolną złożoną strukturę przypominającą kość i kierując różnicowanie w kierunku linii tworzącej kość.

Co więcej, leki mogą być ładowane do atramentu kostnego, aby jednocześnie przyspieszyć gojenie się ran, regenerację kości i leczyć patologie, takie jak rak. Procedurę zademonstrują Gagan Jalandhra, doktorant w moim laboratorium, oraz dr Sara Romanazzo, która współpracowała ze mną i dr Jalandhrą przy różnych projektach, w tym nad rozwojem tej technologii. Rozpocząć od dodania mieszaniny wodorofosforanu wapnia i sproszkowanego węglanu wapnia do tygla cyrkonowego, tak aby nie był wypełniony w więcej niż 75%.

Przenieść tygiel do pieca, podgrzać go do 1 400 stopni Celsjusza w tempie pięciu stopni Celsjusza na minutę i trzymać przez trzy godziny. Ugasić reakcję, wyjmując tygiel z pieca i pozostawiając na wierzchu bloku ogniotrwałego. Pozwól mu całkowicie ostygnąć przed użyciem.

Za pomocą moździerza i tłuczka rozbij i zmiel makuch fosforanowy alfa-trójwapniowy tak, aby powstałe granulki miały maksymalny rozmiar 200 mikrometrów. Do zmielonej mieszanki dodaj trzy milimetrowe kulki cyrkonu stabilizowane tlenkiem itru, a następnie 100% etanol. Zabezpiecz pokrywkę i miel przez dwie godziny z prędkością 180 obrotów na minutę.

Zebrać zawiesinę i oddzielić kulki, używając 100% etanolu do mycia. Zawiesinę suszyć w piekarniku w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Dodaj wysuszony proszek do słoików do mielenia z jednomilimetrowymi kulkami cyrkonu i 100% etanolem w takich samych proporcjach wagowych jak w pierwszym etapie.

Miel przez dwie godziny z prędkością 180 obrotów na minutę. Następnie oddziel i wysusz w piekarniku. Wyjąć próbkę z pieca.

Aby zrobić tusz kostny, dodaj 630 mikrolitrów glicerolu i 130 mikrolitrów polisorbatu 80 do słoika z kulkami. Następnie dodać 100 miligramów dwuzasadowego fosforanu amonu i dwa gramy sproszkowanego fosforanu alfa-triwapniowego i ciągle mieszać szpatułką do połączenia. Dodaj kulkę cyrkonu o średnicy 25 milimetrów, zabezpiecz pokrywkę i umieść ją w młynie planetarnym na 60 minut z prędkością 180 obrotów na minutę, zatrzymując się w połowie, aby zeskrobać boki słoika szpatułką za pomocą szpatułki.

Załaduj atrament do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Sporządzić 10% roztwór żelatyny typu A w 1X PBS zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Umieścić kolbę stożkową na mieszadle.

Następnie dodaj 5,796 mililitra bezwodnika metakrylowego i kontynuuj mieszanie w ciemności w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 90 minut. Ugasić reakcję, rozcieńczając zawartość kolb stożkowych dwukrotnie PBS. Zdekantować do 50-mililitrowych probówek i usunąć nieprzereagowany bezwodnik metakrylowy przez odwirowanie w temperaturze 3000 RCF w temperaturze pokojowej przez trzy minuty i zebranie supernatantu.

Dializuj supernatant w 14-kilodaltonowych rurkach dializacyjnych z odciętej celulozy w wodzie dejonizowanej o temperaturze 40 stopni Celsjusza przez pięć dni, delikatnie mieszając. Wodę dejonizowaną należy wymieniać codziennie. Przygotuj się do przechowywania, przelewając do 50-mililitrowych tubek, zabezpieczając nakrętkę i umieszczając ją w lodówce na 12 godzin.

Następnie zamrozić próbki za pomocą ciekłego azotu i natychmiast liofilizować przez pięć dni w temperaturze minus 54 stopni Celsjusza i 0,4 milibara. Powstałą pianę przechowuj w zamrażarce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby zsyntetyzować mikrożele GelMA, należy przygotować 10% wagowo roztwór GelMA w PBS, ważąc liofilizowany GelMA, dodając go do probówki z PBS i podgrzewając w łaźni wodnej w temperaturze 50 stopni Celsjusza aż do pełnego uwodnienia.

Dodaj 37 mililitrów oleju na jeden mililitr roztworu GelMA do zlewki, upewniając się, że nie jest wypełniona w więcej niż 65%. Ustaw system podwójnej zlewki na płycie grzejnej z mieszaniem magnetycznym, umieszczając zlewkę zawierającą olej w większej zlewce. Podgrzej do 40 stopni Celsjusza, mieszając.

Załadować roztwór GelMA do strzykawki i dodawać go kroplami do oleju do mieszania przez filtr 0,45 mikrometra. Pozostawić emulsję do wyrównania przez 10 minut. Zmniejsz temperaturę emulsji do 15 stopni Celsjusza do temperatury termicznej.

Ustabilizuj kule, dodając pokruszony lód do przestrzeni między dwiema zlewkami. Dodaj aceton do wirującej emulsji GelMA. Zdekantować zawartość zlewki do 50-mililitrowych probówek, upewniając się, że ścianki zlewki zostały umyte acetonem.

Odstaw na 20 minut, aby odwodnione mikrożele opadły na dno. Wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć mikrożele acetonem. Skonsolidować w jednej probówce, uzupełnić acetonem i sonikować przez 10 sekund.

Ponownie umyj go dwukrotnie acetonem. Przechowywać w acetonie w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie to potrzebne do drukowania. Aby przygotować zawiesinę mikrożelu GelMA do druku, należy sformułować 1% roztwór wagowy GelMA w DMEM, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym.

Odparuj aceton z odwodnionych mikrożeli i zważ powstały proszek do probówki. Dodaj aceton i przenieś do sterylnego środowiska. Aby utworzyć zawiesinę mikrożelu, odparuj aceton z proszku wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.

Po odparowaniu dodaj DMEM, 1% roztwór GelMA w DMEM i 2,5% roztwór inicjatora LAP, aby uzyskać końcową frakcję upakowania 30% Pozostawić do pełnego nawodnienia przez co najmniej 12 godzin w temperaturze pokojowej. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełniona 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla aż do zlewu. Usunąć mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej z kolby do hodowli tkankowej, usuwając pożywkę i przemywając sterylnym PBS.

Osadzaj komórki, odwirowując w temperaturze 150 RCF w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Policz komórki i oblicz co najmniej 5 x 10 do pięciu komórek na każdy mililitr mikrożeli GelMA. Przypisz wymaganą objętość zawiesiny komórek do oddzielnej probówki i osadu, jak pokazano wcześniej.

Ostrożnie usuń jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety, pozostawiając tylko osad komórkowy. Dodaj wymaganą objętość zawiesiny mikrożelu do granulki i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Załaduj komórkę wypełnioną zawiesiną mikrożelu do reaktora za pomocą pipety.

Za pomocą jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 23 nałóż tusz kostny, usieciuj komórkę i mikrożel GelMA z tuszem kostnym za pomocą lampy sieciującej UV o długości 405 nanometrów przez 90 sekund. Natychmiast przenieść zawiesinę mikrożelu na odpowiednio dobraną płytkę studzienkową zawierającą kompletny DMEM. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Pożywkę należy wymienić po 24 godzinach, a następnie co 48 do 72 godzin, w zależności od potrzeb. Tusz kostny poddano analizie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej w celu określenia jego mikrostruktury, która wykazała tworzenie się kryształu hydroksyapatytu po ustawieniu tuszu, szczególnie widoczne w suchych warunkach. W tym badaniu komórki zmieszano z mikrożelami GelMA i utrzymywano w hodowli przez okres do pięciu dni, albo w samej zawiesinie mikrożelu, albo w systemie COBICS.

Komórki wykazywały dobrą żywotność w obecności tuszu kostnego, zarówno w pierwszym, jak i piątym dniu, co potwierdza, że produkty wymywania atramentu nie były szkodliwe dla komórek. Bardzo ważne jest, aby kontrolować prędkość mieszania podczas syntezy mikrożelu, ponieważ niewielkie zmiany mogą powodować różnice w wielkości. Ważne jest również, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek w zawiesinie mikrożelu.

Ten sam protokół można zastosować do drukowania wewnątrz zawiesin żelu żelatynowego, które działają jak podpory ofiarne, pozostawiając samodzielne konstrukcje kostne. Jednak zastosowanie GelMA otwiera drogę dla wielofazowych konstruktów z jednego garnka, takich jak interfejsy kostno-chrzęstne lub kostne.