Name: Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę samodzielnego montażu taktoidów mikrotubul przy użyciu białka MAP65 i PEG. Ta technika umożliwia badanie organizacji mikrotubul oraz modelowanie wrzecion mitotycznych w systemach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom Ross Lab z lata 2021, szczególnie K. Alice Lindsay, za ich pomoc. Praca ta była wspierana przez grant z NSF BIO-2134215, który wspierał S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee i J.L. Rossa. Grant z Fundacji KECK (Rae Anderson, USD, kierownik projektu) częściowo wsparł R. Brancha i P. Chauhana

<ol><li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins%3A+structuring+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).</li>
<li>Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+meiotic+spindle+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte meiotic spindle assembly and function.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).</li>
<li>Brugués, J., Needleman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+spindle+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical basis of spindle self-organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).</li>
<li>Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+transport+organize+microtubules+in+metaphase+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles.</a> Cell. 149 (3), 554-564 (2012).</li>
<li>Gatlin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+fusion+requires+dynein-mediated+sliding+of+oppositely+oriented+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules.</a> Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).</li>
<li>Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmin%3A+A+protein+complex+required+for+centrosome-independent+microtubule+generation+within+the+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle.</a> Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+by+labile+association+of+the+nature+of+mitotic+spindle+fibers+and+their+role+in+chromosome+movement+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules.</a> Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).</li>
<li>Allenspach, A. L., Roth, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variations+during+mitosis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variations during mitosis in the chick embryo.</a> Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).</li>
<li>Theg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+microtubules+in+different+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic microtubules in different animal cells.</a> Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).</li>
<li>Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+anaphase+spindle+elongation+in+Diatoma+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare.</a> Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).</li>
<li>Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChaikin%2C+PM+%22Principles+of+Condensed+Matter+Physics%22">Principles of Condensed Matter Physics</a>. , Cambridge University Press. (1995).</li>
<li>Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+and+collective+behavior+of+microtubule+bundles+in+the+presence+of+polyamines%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines.</a> Biophysical Journal. 101 (1), 205(2011).</li>
<li>Needleman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+assembly+of+microtubules+by+counterions%3A+From+hexagonal+bundles+to+living+necklaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).</li>
<li>Ross, J. L., Fygenson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+taxol+in+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility of taxol in microtubule bundles.</a> Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).</li>
<li>Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-like+beating+of+active+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cilia-like beating of active microtubule bundles.</a> Science. 333 (6041), 456-459 (2011).</li>
<li>Brandt, R., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+microtubule-associated+protein+tau.+Identification+of+regions+which+affect+microtubule+growth%2C+nucleation%2C+and+bundle+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173(1989).</li>
<li>MacRae, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+by+cross-linking+and+bundling+proteins.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Structure+and+Molecular+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).</li>
<li>She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+Ase1%2FPRC1%2FMAP65+family+in+central+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly.</a> Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).</li>
<li>Walczak, C. E., Shaw, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAP+for+Bundling+Microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAP for Bundling Microtubules.</a> Cell. 142 (3), 364-367 (2010).</li>
<li>Edozie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+spindle-like+microtubule+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Self-organization of spindle-like microtubule structures.</a> Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).</li>
<li>Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+the+microtubule+cross-linking+protein+MAP65-1+reveals+a+molecular+mechanism+for+contact-angle-dependent+microtubule+bundling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling.</a> Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).</li>
<li>Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li>
<li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li>
<li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li>
<li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li>
<li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408(2021).</li>
<li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+MAPs%2C+and+motor+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li>
<li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022).</li>
<li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903(2021).</li>
<li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+and+testing+of+a+new%2C+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme%2C+katanin+p60%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li>
<li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li>
<li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li>
<li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li>
<li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+katanin%2C+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane tutaj metody zostały wykorzystane w kilku artykułach do stworzenia taktoidów mikrotubul (ryc. 2)22,28. Eksperymenty te są biologicznie istotne, aby pomóc w odkryciu zasad organizacyjnych, które kontrolują kształt i stabilność wrzeciona mitotycznego lub mejotycznego w większości typów komórek. Ponadto mikrotubule są modelowymi mezogenami ciekłokrystalicznymi, które mogą pomóc w dowiedzeniu się więcej o tym, jak ciekłe kryształy nukleują i rozwijają fazy nematyczne z faz izotropowych.
Opisana tutaj procedura ma kilka zalet w badaniu samoorganizacji mikrotubul. Po pierwsze, jest wysoce powtarzalny, ponieważ został wykonany w laboratorium przez wielu uczniów, w tym uczniów szkół średnich, z niewielką wiedzą lub szkoleniem przed rozpoczęciem pracy w laboratorium. Takuloidy są dwójłomne22, co pozwala na oglądanie ich w świetle przechodzącym oprócz mikroskopii fluorescencyjnej, dzięki czemu metoda ta jest dostępna dla wielu laboratoriów, a ta eksperymentalna procedura może być dostosowana do celów edukacyjnych, oprócz badań na najwyższym poziomie. Wreszcie, proces ten otwiera drogę do dalszego rozumienia i badania systemów biologicznych w uproszczonym, redukcjonistycznym podejściu, pozwalając zrozumieć, w jaki sposób każdy dodatkowy warunek, białko lub dodatek może zmienić samoorganizację taktoidów i, być może, ostatecznie, wrzeciona. Cele dla lepszej biomimikry obejmują aktywność, płynność i sortowanie polaryzacji włókien.
Może istnieć kilka czynników wpływających na eksperyment dający nieoczekiwane wyniki. Na przykład, jeśli taktoidy nie tworzą się (ryc. 2), ale obserwuje się wzory przypominające wachlarze, MAP65 prawdopodobnie nie jest obecny lub nie wiąże się z mikrotubulami22,28. Powinno to być oczywiste również w kanale fluorescencyjnym MAP65, ponieważ GFP-MAP65 nie będzie związany z mikrotubulami.
Jeśli tactoidy się nie tworzą, a tło pojawia się jako plamki na szkle, może to być spowodowane powłoką powierzchniową. Raz wykonana silanizacja trwa tylko 1 miesiąc na szkiełkach nakrywkowych. Kiedy się zużyje, tubulina będzie w stanie związać się z odsłoniętą powierzchnią w sposób niespecyficzny. To wiązanie będzie występować w dziwnych wzorach.
Jeśli taktoidy się nie tworzą, a tubulina jest obserwowana w agregatach o różnych kształtach i rozmiarach, może to być spowodowane rurką złej jakości. Tubulinę można odwirować w celu usunięcia początkowych agregatów, które mogą napędzać agregację poza szlakiem zamiast polimeryzacji mikrotubul. Jeśli powierzchnia wiąże się z tubuliną, może również zubożyć tubulinę w roztworze. Niskie stężenia tubuliny, poniżej stężenia krytycznego dla polimeryzacji mikrotubul, mogą prowadzić do powstania agregatów.
W eksperymentach FRAP, jeśli kanał MAP65 nie wykazuje żadnej regeneracji (ryc. 5), możliwe jest, że fotowybielanie powodowało fotouszkodzenie mikrotubul. Fotouszkodzenie powoduje miejscowe zniszczenie włókien. Można to sprawdzić, badając w nadawanym kanale. Taktoidy mikrotubul są widoczne w przesyłanym kanale poprzez wysoki współczynnik niedopasowania refrakcji do otaczającej wody. Fotouszkodzenie wywołane światłem pojawi się jako ślad po oparzeniu lub utrata kontrastu w obrazowaniu w świetle przechodzącym w miejscu ROI poddanego fotowybielaniu. Jeśli tak się stanie, moc lasera lub światła musi zostać zmniejszona, aby zahamować fotouszkodzenia białek.
W ramach tej procedury i podejścia napotkano kilka wyzwań. Jednym z problemów jest to, że pomiary długości są obecnie wykonywane ręcznie po kliknięciu na obraz. Ta metoda, choć prosta, może powodować dużą niepewność. Pomiar szerokości, który wykorzystuje przekrój poprzeczny i dopasowanie do Gaussa, jest lepszą metodą ilościowego określania rozmiaru. Podobną metodę można zastosować w odniesieniu do długości. Drugą kwestią jest to, że czasami taktoidy, ponieważ są tak długie i cienkie, mogą się zginać. To sprawia, że ilościowe określenie długości jest trudniejsze. Długość konturu można określić ilościowo za pomocą linii segmentowej, ale za każdym razem, gdy dodawany jest segment, pojawia się dodatkowa niepewność.
Z naukowego punktu widzenia podejście to wiąże się z pewnymi innymi wyzwaniami związanymi z jego wykorzystaniem jako modelu dla ciekłych kryształów lub wrzecion. Pierwszym wyzwaniem był długi, cienki kształt taktoidów tworzonych przez mikrotubule (ryc. 3 i ryc. 4). Jak zauważono we wcześniejszych publikacjach22, taktoidy mikrotubul są taktoidami jednorodnymi, a nie dwubiegunowymi. Oznacza to, że mikrotubule tworzące kształt nie zmieniają orientacji, aby wskazać końcówki struktury. Zamiast tego wszystkie mikrotubule są równoległe do długiej osi, a "bieguny" znajdują się w nieskończoności. Różni się to bardzo od taktoidów obserwowanych dla molekularnych ciekłych kryształów, a nawet dla aktyny lub DNA, które mogą również działać jako mezogeny ciekłokrystaliczne. W tych innych systemach taktoidy są dwubiegunowe i patrząc na nie w skrzyżowanych polaryzatorach, wykazują charakterystyczne oznaki reorientacji pręcików.
Drugim poważnym wyzwaniem w tym systemie jest to, że mikrotubule są nieruchome wewnątrz taktoidu. Wynika to jasno z eksperymentów i analiz FRAP, ponieważ odzysk mikrotubul jest bardzo niski. Ich stała natura sprawia, że taktoidy mikrotubul są mniej wartościowe niż wielkoskalowe analogi ciekłokrystaliczne. Faza nematyczna ciekłego kryształu powinna mieć zarówno właściwości ciekłe (płynne), jak i krystaliczne (zorganizowane). Chociaż kształt wydaje się odpowiedni dla wrzeciona, bezruch sprawia, że system jest mniej ekscytujący jako modelowe wrzeciono mitotyczne. Z drugiej strony, wydanie to daje możliwość zbadania, w jaki sposób można modyfikować eksperymenty, aby uzyskać większą płynność systemu.
Te wyzwania naukowe oferują ekscytujące możliwości, które pozwolą na zdobycie nowej wiedzy na temat systemu. Aby taktoidy mikrotubul były bardziej dwubiegunowe, można użyć krótszych mikrotubul. Istnieje jednak dodatkowe wyzwanie, ponieważ mikrotubule nie mają wielu dobrze scharakteryzowanych białek ograniczających, które kontrolowałyby długość, tak jak robi to aktyna. Zastosowanie zarodkowania i wzrostu wymaga użycia bardzo wysokich stężeń tubuliny i GMPCPP do wytworzenia krótkich mikrotubul. Wysokie stężenie tubuliny skutkuje większą liczbą filamentów w układzie, co utrudnia oddzielenie taktoidów od siebie. Dodanie nowych kapsli do mikrotubul, takich jak DARPin33, może pomóc w tej sytuacji. Drugi problem związany z unieruchomieniem mikrotubul można złagodzić poprzez dodanie białek motorycznych, takich jak kinezyna-534, które są tetramerami silników używanych w mitozie. Alternatywnie można zastosować sztuczne dimery dimerycznej kinezyny-115.
Innym sposobem na zwiększenie płynności byłoby umożliwienie mikrotubulom wykonywania ich dynamicznej niestabilności, czyli wzrostu i kurczenia się mikrotubul. Obecnie mikrotubule, które są wysiewane stabilnymi włóknami GMPCPP, a następnie ulegają dynamicznej niestabilności, są znacznie dłuższe niż pożądane, aby utworzyć wrzeciono lub taktoid, co skutkowałoby bardzo długimi organizacjami, takimi jak wentylatory lub wiązki. Tak więc dodanie dynamicznej niestabilności mikrotubul musiałoby być wykonane ostrożnie, aby zachować kształt taktoidalny. Dodanie powiązanych białek i enzymów, które mogą kontrolować długość, może złagodzić ten problem. Na przykład prawdopodobnie potrzebna byłaby depolimeryzacja kinezyny, takiej jak kinezyna-1335, lub enzymy odcinające, takie jak katanina36. Eksperymenty te są złożone i trudne, chociaż byłyby bardzo wnikliwe bez względu na to, co ujawnią wyniki. Niezależnie od tego, w jakim kierunku pójdą przyszłe eksperymenty, opracowana tutaj platforma do tworzenia taktoidów mikrotubul może ujawnić nowe informacje na temat fizycznych podstaw organizacji mikrotubul.

Podział komórek poprzez mitozę jest jednym z najważniejszych procesów biologicznych dla podtrzymania życia. Włókna mikrotubul, złożone z dimerów tubuliny, są niezbędnymi elementami strukturalnymi tego procesu. Przejściowa maszyneria utworzona w metafazie, gdy chromosomy ustawiają się w środku komórki, nazywana jest wrzecionem mitotycznym ze względu na swój kształt, który jest jak wrzeciono krosna pokrytego nitkami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). W wielu organizmach dobrze wiadomo, że mikrotubule są używane w metafazie do wypychania i wciągania skondensowanych chromosomów do środka komórki, wyrównując je i łącząc z mikrotubulami, które rozerwą je w anafazie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B, C). Wrzeciono tworzy się zarówno w mejozie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B), jak i mitozie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C), utworzonych z wielu nakładających się na siebie mikrotubul nie owiniętych wokół osi środkowej jak nić, ale biegnących równolegle do interfejsu. Tworzenie tych struktur opartych na mikrotubulach wymaga powiązanych białek, które sieciują się krzyżowo, i powiązanych enzymów, które mogą działać jako silniki, aby pomóc w popychaniu i przyciąganiu chromosomów1.
Badania wrzecion mejotycznych wykazały, że mikrotubule są krótkie, dynamiczne i nakładają się na siebie w usieciowanych tablicach2,3,4,5,6 (Rysunek 1Di). Ze względu na fizyczną organizację tych krótkich mikrotubul, wrzeciono mejotyczne jest podobne do ciekłokrystalicznego taktoidu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). Rzeczywiście, wykazano, że wrzeciona łączą się i łączą, jak można się spodziewać po taktoidach ciekłokrystalicznych5.
Wiele badań z lat sześćdziesiątych XX wieku wykorzystywało fiksację, sekcje szeregowe i mikroskopię elektronową, aby ustalić, że wewnątrz wrzeciona mitotycznego znajdują się dwa rodzaje mikrotubul7,8,9,10. Pierwszy typ nazywa się mikrotubulami kinetochorowymi, które łączą biegun wrzeciona z kinetochorem. Drugi typ nazywany jest mikrotubulami międzybiegunowymi lub polarnymi, które wyrastają poza chromosomy i nakładają się na siebie w strefie środkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Dii)8,9,10. Trzeci typ nazywa się mikrotubulami astralnymi, które znajdują się na zewnątrz wrzeciona i łączą bieguny z krawędzią komórki; Te organizacje zajmujące się mikrotubulami znajdują się poza zakresem obecnej dyskusji. Ostatnio przeprowadzono badania nad interakcją między augmin6 a kompleksem pierścieni gamma-tubuliny wpływającym na centra zarodkowania dla mikrotubul, co skutkuje wrzecionem mitotycznym z krótszymi mikrotubulami, jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 1D.
Ponieważ mikrotubule są dłuższe niż szerokie, o wysokim współczynniku kształtu i wysokiej sztywności, są jak pomniejszone wersje cząsteczek ciekłokrystalicznych. W fizyce miękkiej materii atomy i cząsteczki zostały przybliżone przy użyciu minimalnych oddziaływań, aby wydedukować fizyczne mechanizmy przemian fazowych, w tym zarodkowanie i topnienie kryształów11. Podobnie, mikrotubule są obiektami mezoskalowymi, które są przeskalowanymi wersjami cząsteczek ciekłokrystalicznych, dając wgląd w fizykę dynamiki ciekłych kryształów, w tym zarodkowanie i wzrost faz nematycznych z izotropowych. Ponadto, jak omówiono powyżej, wrzeciono mejotyczne wykazuje właściwości podobne do właściwości ciekłokrystalicznego taktoidu, stanu nematycznego, który nukleuje się i rośnie ze stanu izotropowego cząsteczek ciekłokrystalicznych3,4,5. W przypadku taktoidów zarodkowanie i wzrost są podobne do innych kryształów (tj. wymagają stosunkowo wysokiego stężenia mezogenów [cząsteczek tworzących ciekłe kryształy]). Unikalny kształt "wrzeciona" taktoidu pochodzi z lokalnego wyrównania mezogenów ciekłokrystalicznych, które ustawiają się w fazie nematycznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). Nie mogą tworzyć zaokrąglonego kryształu, ponieważ cząsteczki są wysoce asymetryczne. Biorąc pod uwagę naturę mikrotubul, być może nie jest zaskakujące, że mitotyczne wrzeciono-maszyneria wykonana z wysokiego lokalnego stężenia mikrotubul ma również ten sam kształt, niezależnie od tego, czy nazywa się je taktoidalnym, czy wrzecionowym. Taktoidy mogą być dwubiegunowe, z biegunami na zwężających się końcach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Ei), lub jednorodne, z biegunami efektywnie ustawionymi na nieskończoność (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Eii).
Biorąc pod uwagę znaczenie formowania wrzeciona, podjęto wysiłki w kierunku samoorganizującego się tworzenia wrzeciona in vitro, demonstrując kondensację mikrotubul w wiązki za pomocą form jonowych12,13, czynniki tłumiące, które tworzą interakcje zubożenia14,15, oraz specyficzne białka sieciujące mikrotubule13,16,17,18,19,21. Co zaskakujące, chociaż wszystkie te środki działają w celu zwiększenia lokalnego stężenia mikrotubul, często skutkują długimi wiązkami mikrotubul, ale nie taktoidami. Jednym z powodów, dla których te wiązki są długie, może być to, że tworzące je mikrotubule są również długie. Niedawne prace z użyciem krótszych mikrotubul wykazały również dłuższe wiązki, które nie są zwężane na końcu15; W tym przypadku wiązki są utrzymywane razem z białkami motorycznymi, które powodują wydłużenie wiązek, a tym samym wydłużają je. Krótkie mikrotubule z nierozciągliwymi sieciownikami są potrzebne do stożkowych, wrzecionowatych zespołów, jak opisano tutaj.
Ostatnio opracowaliśmy technikę umożliwiającą tworzenie taktoidów mikrotubul za pomocą antyrównoległego środka sieciującego, MAP65, w obecności nukleujących stabilnych mikrotubul22. Mikrotubule musiały być krótkie, ale niewiele znanych regulatorów długości mikrotubul może zabezpieczyć mikrotubule przed niestabilnością dynamiczną lub wyżarzaniem od końca do końca. Zamiast tego GMPCPP użyto do zarodkowania i stabilizacji włókien po wzroście. Pozwoliło to na stworzenie dużej gęstości krótkich mikrotubul, które mogły samoorganizować się w taktoidy. Te taktoidy były jednorodne, gdy oglądało się je w warunkach dwójłomności. Oprócz krótkich mikrotubul, do utworzenia taktoidów zastosowano specyficzny antyrównoległy środek sieciujący, MAP65 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). MAP65 jest białkiem związanym z mikrotubulami roślinnymi z rodziny mitotycznych środków sieciujących PRC1/Ase123. MAP65 występuje jako dimer, z silnym powinowactwem do wiązania się z samym sobą, a także z mikrotubulami24. W przeciwieństwie do wrzeciona mejotycznego i taktoidów obserwowanych za pomocą filamentów aktynowych25,26,27, które są dwubiegunowe i mają właściwości ciekłe ciekłych kryształów, zaobserwowano, że taktoidy mikrotubul są podobne do ciał stałych22,28.
Tutaj przedstawione są protokoły tworzenia taktoidów mikrotubul i charakteryzowania kształtu zespołów oraz mobilności składników za pomocą technik opartych na fluorescencji.

<table><tbody><tr><td>2% Dichlorodimethylsilane</td><td>GE Healthcare</td><td>118945</td><td>Hydrofobowa obróbka powierzchni silanu. Można go ponownie użyć do trzech razy i przechowywać w temperaturze pokojowej przez rok.</td></tr><tr><td>5-minutowa żywica epoksydowa</td><td>Bob Smith Industries</td><td></td><td>Do uszczelniania komór eksperymentalnych</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>32900HPLC</td><td>100%</td></tr> <tr><td>BL21 komórki</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td><td>Kompetentne komórki bakteryjne używane do ekspresji MAP65</td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>Część systemu oczyszczania tlenu. Zapas 300 mg/ml jest wytwarzany w ddH2O i przechowywany w 10 &mu; l podwielokrotności w -20&deg; C na okres do jednego roku.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm lub 22 mm x 30 mm)</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>Do komór doświadczalnych</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>Mała cząsteczka, która służy do rozbijania wiązań dwusiarczkowych i usuwania tlenu. Kolba o pojemności 1 M jest wykonana z proszku (Sigma) w ddH2O. Roztwór jest podawany i przechowywany w temperaturze -20C przez okres do jednego roku. Podwielokrotności są używane 7-8 razy, a następnie odrzucane.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>Bufor tubulinowy składnik bazowy</td></tr><tr><td>Eppendorf 0,5 ml probówki</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>Do przechowywania roztworów eksperymentalnych</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Fisher</td><td>111000200</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>Do czyszczenia i przeciągania roztworów przez komory doświadczalne</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny z wysokim NA obiektywy</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 Konfokalny</td><td>Do eksperymentów obrazowych</td></tr><tr><td>Zamrażarka -20&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>Do przechowywania odczynników</td></tr><tr><td>Zamrażarka -80&deg; C</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>Do przechowywania białek.</td></tr><tr><td>Szklane pojemniki do silanizacji</td><td>Michaels</td><td></td><td>Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbki szkieł nakrywkowych</td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher</td><td>12544-4</td><td>Do komór doświadczalnych</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td>Część systemu oczyszczania tlenu. Zapas 300 mg/ml jest wytwarzany w ddH2O i przechowywany w 10 &mu; l podwielokrotności w -20&deg;C.</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Część systemu oczyszczania tlenu. Jest to przechowywane w 4&deg; C na okres do jednego roku.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>Wolno hydrolizowalny analog GTP stosowany do polimeryzacji i stabilizacji mikrotubul poprzez zmniejszenie dynamicznej niestabilności i spontanicznego stężenia krytycznego dla zarodkowania mikrotubul w celu uzyskania stałej długości. Kupujemy zapas o pojemności 10 mM od Jena Biosciences i przechowujemy go w temperaturze -20&deg; C na okres do jednego roku.</td></tr><tr><td>Element grzejny do mikroskopu</td> Inkubator <td></td><td>górny stopnia Okolab</td><td>Do eksperymentów obrazowych</td></tr><tr><td>Imidizol</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>Służy do elucji białka MAP65 z kulek niklu w celu oczyszczenia MAP65</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>Do czyszczenia i przeciągania roztworów przez komory doświadczalne.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M w ddH2O, świeży, aby zapobiec zakwaszeniu w miarę upływu czasu.</td></tr><tr><td>Ciekły azot Airgas</td><td></td><td>NI 230LT22</td><td>Do upuszczania podwielokrotności zamrażania. Może być również używany do przechowywania (niezalecane)</td></tr><tr><td>Białko MAP65</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>Białko związane z mikrotubulami (MAP) o masie cząsteczkowej 65 kD, które jest antyrównoległym środkiem sieciującym mikrotubule. Oczyściliśmy nieznakowaną i znakowaną GFP wersję MAP65-1 z Arabidopsis thaliana. Mieszamy GFP-MAP65 z nieznakowanym MAP65 tak, że 10% białka jest znakowane. Zapas roboczy to 10,8 &mu; Rozwiązanie M. To roztwór roboczy jest przechowywany w 4&deg; C i przerabiane na świeżo co tydzień. Protokół oczyszczania MAP65 i GFP-MAP65 jest podany w naszym poprzednim rozdziale dotyczącym metod (26).</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>MKCJ940</td><td>Składnik buforu tubuliny</td></tr><tr><td>Koraliki NTA-Nikiel</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Koraliki wymagane do oczyszczenia 6xHis oznaczone białka MAP65</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td> System laserowy <td>Nikon</td><td></td><td>405 nm, który może skupić laser w dowolnym pożądanym kształcie obszaru zainteresowania</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>Obojętny bufor bazowy do polimeryzacji tubuliny do roztworu wykonanego z 80 mM K-PIPES, pH 6,8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, przechowywany w temperaturze 4& C na okres do jednego roku.</td></tr><tr><td>Trwała taśma dwustronna</td><td>3M - Scotch</td><td>34-8724-5691-7</td><td>Do komór doświadczalnych</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Do komory wilgotnej</td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>Bufor tubulinowy składnik bazowy</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Kopolimer blokowy z dwoma hydrofilowymi blokami tlenku etylenu (PEO) na końcach i hydrofobowym blokiem środkowym z hydrofobowej powłoki powierzchniowej tlenku fenylenu (PPO), którego używamy, aby zapobiec wiązaniu się białek z powierzchnią. Pluronic-F127 jest kupowany w postaci proszku (Sigma) i rozpuszczany do 5% (w/v) roztworu w ddH2O na noc. Po rozpuszczeniu roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do jednego roku.</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>Środek tłumiący stosowany do tworzenia sił zubożających, które wynoszą taktoidy na powierzchnię i pomagają organizować mikrotubule. Tworzymy 5% (w/v) roztwór 100 kDa PEG w PEM80. Roztwór jest przechowywany w 4&deg; C przez okres do jednego roku i umieszczony na bujaku przed użyciem. Jest lepki, dlatego do pracy z nim zalecamy użycie pipety wyporowej.</td></tr><tr><td>Pipeta wyporowa</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Do pipetowania lepkich cieczy</td></tr><tr><td>Stojaki na szkiełka nakrywkowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72240</td><td>Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbka szkieł nakrywkowych</td></tr><tr><td>Lodówka 4&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Do przechowywania odczynników</td></tr><tr><td>Cytoszkielet</td><td>znakowany tubuliną</td><td>TL590M</td><td>liofilizowana tubulina znakowana rodaminą z mózgu świni jest kupowana (cytoszkielet) i przechowywana w temperaturze -80&deg; C do momentu uwodnienia w PEM80 i stosowania przez okres do jednego roku.</td></tr><tr><td>Białko tubuliny</td><td>Cytoszkielet</td><td>T240</td><td>liofilizowana tubulina 99% czysta, nieznakowana z mózgu świni jest kupowana (cytoszkielet) i przechowywana w -80&deg; C do momentu uwodnienia w PEM80 i stosowania przez okres do jednego roku.</td></tr><tr><td>UV-Ozone</td><td>Jelight</td><td>Model 342</td><td>Do przygotowania komór doświadczalnych - obróbki szkieł nakrywkowych</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>wtyczka do rejestracji danych szeregów czasowych w celu usunięcia dryfu</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>wtyczka do rejestracji danych szeregów czasowych w celu usunięcia dryfu</td></tr></tbody></table>

samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Cytoszkielet jest odpowiedzialny za główną wewnętrzną organizację i reorganizację w komórce, a wszystko to bez kierownika, który kierowałby zmianami. Dzieje się tak zwłaszcza podczas mitozy lub mejozy, gdzie mikrotubule tworzą wrzeciono podczas podziału komórki. Wrzeciono to maszyneria używana do segregacji materiału genetycznego podczas podziału komórki. W kierunku tworzenia samoorganizujących się wrzecion in vitro, opracowaliśmy niedawno technikę rekonstytucji mikrotubul w wrzecionowate zespoły z minimalnym zestawem białek związanych z mikrotubulami i środków tłumiących. W szczególności użyto MAP65, który jest antyrównoległym środkiem sieciującym mikrotubule z roślin, homologiem Ase1 z drożdży i PRC1 z organizmów ssaków. Ten środek sieciujący samoorganizuje mikrotubule w długie, cienkie, przypominające wrzeciono samoorganizujące się zespoły mikrotubul. Zespoły te są również podobne do taktoidów ciekłokrystalicznych, a mikrotubule mogą być używane jako mezoskalowe mezozogeny. W tym miejscu przedstawiono protokoły tworzenia tych taktoidów mikrotubul, a także charakteryzowania kształtu zespołów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz ruchliwości składników za pomocą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu.

Przy użyciu zaledwie niewielkiej liczby komponentów, dimerów tubuliny oraz sieciujących białek mikrotubul, mogą tworzyć się taktoidy mikrotubul (Rycina 2A). Choć niniejszy protokół opisuje inkubację w celu nukleacji i wzrostu mikrotubul w inkubatorze, proces nukleacji i wzrostu można obserwować bezpośrednio pod mikroskopem (procesy te kończą się w ciągu 30 min) (Rycina 2B). Stężenie tubuliny utrzymuje się na stałym poziomie 13.6 µm, a wiązanie MAP65-MT na poziomie 10%.
Rysunek 4 przedstawia poprawne dane. Taktoidy powinny być widoczne zarówno przy użyciu lasera 561 nm w kanale tubuliny, jak i 488 nm w kanale MAP65, wykazując przy tym idealną koincydencję (Rysunek 4A). Jedną z zagadek tego układu jest fakt, że szerokość taktoidów nie wydaje się zmieniać przy różnych modyfikacjach eksperymentalnych, w tym przy zmianie długości mikrotubul, stężenia MAP65 oraz rodzaju czynników zagęszczających (Rysunek 4B)22,28. Długość jest znacznie bardziej zmienna i zależy zarówno od długości mikrotubul, jak i od stężenia MAP65 (Rysunek 4B)22,28.
Podczas przeprowadzania FRAP zaobserwowano, że sygnał MAP65 ulega regeneracji, natomiast sygnał mikrotubul nie ulega regeneracji (Rysunek 5). Regeneracja w FRAP wynika z mobilności i ruchu obiektów znakowanych oraz poddanych fotowybielaniu. W przypadku MAP65 wybielone cząsteczki dysocjują i oddalają się od mikrotubuli, a na ich miejsce w dany obszar przemieszczają się nowe cząsteczki (Rysunek 5). Wiązanie MAP65 przebiega w stanie równowagi, zatem szybkość wiązania i odłączania jest taka sama (mierzona w liczbie cząsteczek na sekundę). W przypadku mikrotubul nie zaobserwowano regeneracji, co oznacza, że mikrotubule nie są w stanie opuścić taktoidu (Rysunek 5A, Bi, C). Ponadto nie zaobserwowano rozprzestrzeniania się zaciemnionego obszaru, co sugeruje, że mikrotubule są lokalnie nieruchome i nie tworzą cieczy w obrębie kształtu taktoidu.
<img alt="Proces podziału komórki ze schematami wrzeciona metafazowego, mikrotubulami, chromosomami i obrazami mikroskopowymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Różne modele formowania wrzeciona. Wrzeciono mitotyczne to struktura zbudowana z mikrotubul oraz powiązanych z nimi białek i enzymów, która ustawia i rozdziela chromosomy do dwóch nowych komórek potomnych podczas podziału komórki. (A) Zdjęcie repliki wrzeciona kroplowego z wczesnego średniowiecza z cienką przędzą z Holandii. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie obrazu z Wikimedia autorstwa Petera van der Sluijsa30. (B) Rekonstrukcja trójwymiarowa mikrotubul w różnych etapach mejozy II typu dzikiego. Mikrotubule przedstawiono na zielono, a chromosomy na szaro. Pasek skali = 1 µm. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Lantzsch et al.31. (C) Obraz mikroskopowy mikrotubul we wrzecionie mitotycznym dzielącej się komórki Sf9. Bieguny wrzeciona i mikrotubule wrzeciona są znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym. Pasek skali = 5 µm. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Advani et al.32. (D) Różne modele organizacji mikrotubul wrzeciona mitotycznego i meiotycznego. (i) W przypadku wrzecion meiotycznych stworzonych z ekstraktów jąder komórkowych Xenopus, zaobserwowano wcześniej, że mikrotubule (zielone) są krótkie i dynamiczne w obrębie całego wrzeciona. Jest to podobne do organizacji bipolarnego taktoidu wewnątrz kryształu ciekłego. (ii) Kanoniczny model organizacji mikrotubul wewnątrz wrzeciona mitotycznego obejmuje dwa typy mikrotubul: mikrotubule interpolarne lub polarne (ciemnozielone), które krzyżują się w strefie środkowej wokół chromosomów, oraz mikrotubule kinetochorowe (jasnozielone), które są wiązkowane i rozciągnięte od bieguna do kinetochoru, aby pchać i ciągnąć chromosomy. Na wszystkich obrazach chromosomy przedstawiono w kolorze przezroczystego błękitu, a bieguny wrzeciona w ciemnozielonym. (E) Schematy mezogenów (zielone linie) w taktoidzie kryształu ciekłego dla taktoidów (i) bipolarnego i (ii) homogenicznego. Taktoidy bipolarne mają dwa bieguny na końcach taktoidu, a mezogeny zmieniają orientację, aby wskazywać na te bieguny. Taktoidy homogeniczne mają bieguny w nieskończoności, a mezogeny nie zmieniają orientacji wzdłuż długości taktoidu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat powstawania taktoidu, montaż mikrotubul z MAP65, seria time-lapse, pasek skali 5μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Kondensacja mikrotubul. (A) Mikrotubule mogą być wiązane w pęki i sieciowane za pomocą różnych metod, w tym przez gatunki jonowe, siły wyczerpania wywołane przez czynniki zagęszczające oraz specyficzne sieciujące mikrotubule białka, takie jak MAP65. (i) Dimery tubuliny i białka MAP65 są mieszane w celu nukleacji i wzrostu mikrotubul. (ii) Mikrotubule nukleują i rosną z tubuliny, a MAP65 natychmiast wiąże się z mikrotubulami, innym monomerem MAP65 lub obiema tymi strukturami, co powoduje tworzenie pęków. (iii) Mikrotubule w sieciowanych pękach nukleują i rosną. (iv) Końcową konfiguracją jest taktoid mikrotubularny podobny do wrzeciona. (B) Seria czasowa nukleacji i wzrostu taktoidów mikrotubularnych w ciągu 105 min. Pasek skali = 5 µm. Rycina zaadaptowana z Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat komory przepływowej; kierunek próbki z silanizowaną laminką, szkiełkiem przedmiotowym, taśmą dwustronną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Montaż komory przepływowej. Komorę przepływową wykonuje się przy użyciu szkiełka przedmiotowego, silanizowanej laminek oraz trwałej taśmy dwustronnej. Żółto zaznaczony obszar to ścieżka przepływu, przez którą przepływa i jest obserwowana próbka. Objętość komory przepływowej wynosi ~20 µL. Do uszczelnienia końców komory użyto epoksydy, aby zapobiec odparowaniu próbki podczas długotrwałego obrazowania trwającego kilka godzin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza taktoidów: obrazowanie mikrotubul, kanał MAP65, kwantyfikacja długości, wykres dopasowania Gaussa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Obrazy taktoidów oraz analiza długości i szerokości. (A) Przykładowe dane taktoidów utworzonych zgodnie z opisem i obrazowanych za pomocą konfokalnego mikroskopu z tarczą rotacyjną, przedstawiające (i) obrazowanie kanału mikrotubul z tubuliną znakowaną rhodaminą przy użyciu lasera 561 nm, (ii) obrazowanie kanału GFP-MAP65 przy użyciu lasera 488 nm oraz (iii) nałożony obraz z kanału mikrotubul (magenta) i kanału GFP-MAP65 (cyan). Obszary pokrywania się są wyświetlane jako białe i wykazują dokładną kolokalizację mikrotubul i MAP65. Pasek skali = 10 µm dla wszystkich obrazów w (A). (B) Kwantyfikacja długości i szerokości taktoidów. (i) Obraz taktoidu przeznaczonego do analizy bez etykiet. Pasek skali = 5 µm. (ii) Ten sam obraz co w (i), gdzie zaznaczono pomiary długości (linia ciągła z zakończeniami) i szerokości (linia przerywana). Pasek skali = 5 µm. (iii) Szerokość mierzono poprzez analizę profilu intensywności w poprzek taktoidu na symetrycznej dwusiecznej prostopadłej (linia przerywana) zaznaczonej w (ii). Profil intensywności dopasowano do funkcji Gaussa, aby określić amplitudę i szerokość taktoidu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza FRAP: serie czasowe mikrotubul i MAP65, wykresy intensywności, porównanie regeneracji, fluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne dane i analiza FRAP. (A) Dane z serii czasowych mikroskopowych (i) taktoidu mikrotubularnego oraz (ii) GFP-MAP65, a także (iii) obraz nałożony obu kanałów z mikrotubulami w kolorze purpurowym i GFP-MAP65 w kolorze cyjanowym, które zostały poddane fotowybielaniu w czasie 63 s i obserwowane przez kolejne 5 min. (B) Ilościowa analiza intensywności (i) kanału mikrotubul w obszarze wybielonym (purpurowe okręgi) i w tle (ciemnoszare okręgi) oraz (ii) kanału GFP-MAP65 w obszarze wybielonym (cyjanowe kwadraty) i w tle (ciemnoszare kwadraty). (C) Dane zostały skorygowane o szum tła i przeskalowane dla kanału mikrotubul (purpurowe okręgi) oraz kanału GFP-MAP65 (cyjanowe kwadraty). Mikrotubule nie ulegają regeneracji, natomiast GFP-MAP65 ulega i może zostać dopasowany (ciemnoszara linia) do funkcji rosnącego zaniku wykładniczego w celu wyznaczenia amplitudy i skali czasowej regeneracji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Protokół ten umożliwia spontaniczną samoorganizację taktoidów mikrotubul przy użyciu antyrównoległego sieciowania krzyżowego, MAP65. Ten system może pomóc nam zrozumieć organizację mikrotubul i systemy biologiczne, takie jak wrzeciona mitotyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to minimalistyczny system, który może odtwarzać kształty przypominające wrzeciono dla mikrotubul, który jest wysoce powtarzalny i dostępny dla wielu laboratoriów.Metoda ta ma zastosowanie nie tylko w systemach komórkowych, ale może również służyć jako model do badań ciekłokrystalicznych w mezoskali. Aby przygotować tubulinę, najpierw wyjmij porcję nieoznakowanej tubuliny zawierającą jeden miligram liofilizowanej tubuliny z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i trzymaj ją na lodzie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów zimnego PEM-80.Aby rozpuścić cały liofilian, trzymaj probówkę na lodzie przez 10 minut. Następnie wyjmij tubkę tubuliny znakowaną rodaminą zawierającą 20 mikrogramów liofilizowanej tubuliny w proszku z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i trzymaj ją na lodzie. Następnie dodaj cztery mikrolitry zimnego PEM-80 i trzymaj probówkę na lodzie przez 10 minut, aby rozpuścić cały liofiliat.Gdy liofilizowane tubuliny rozpuszczą się, dodaj 100 mikrolitrów ponownie zawieszonego nieznakowanego roztworu tubuliny do czteromikrolitrowego roztworu tubuliny znakowanego rodaminą. Następnie wymieszaj roztwory, przeciskając je rurami od sześciu do siedmiu razy bardzo powoli. Aby przechowywać pozostałe 100 mikrolitrów nieznakowanego roztworu tubuliny, najpierw włóż probówkę do ciekłego azotu, aby zamrozić roztwór, a następnie utrzymuj probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.Następnie rozprowadź mieszaninę tubuliny do siedmiu nowych probówek, dodając 15 mikrolitrów do każdej. Zamroź probówki w ciekłym azocie, jak wykazano wcześniej, i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Aby zmontować komory przepływowe do wykonywania eksperymentów, najpierw wyczyść szklane szkiełko wodą podwójnie destylowaną i osusz je niestrzępiącą się chusteczką laboratoryjną.Następnie najpierw wyczyść szkiełko etanolem, a następnie wodą podwójnie destylowaną. Aby utworzyć ścieżkę przepływu, wytnij kawałek taśmy dwustronnej o długości od 40 do 50 milimetrów. Następnie podziel go pomiędzy, aby utworzyć dwa cieńsze paski taśmy i umieść dwa paski na szkiełku w odległości od pięciu do ośmiu milimetrów od siebie.Następnie umieść silanizowane szkiełka nakrywkowe na ścieżce przepływu. Następnie uszczelnij suwak i okładkę, wsuń dwustronne paski taśmy, delikatnie naciskając obszar taśmy grzbietem długopisu. Jeśli uszczelka jest dobrze wykonana, taśma powinna zmienić kolor z półprzezroczystego na przezroczysty.Aby usunąć dodatkową taśmę na krawędziach, przetnij taśmę żyletką, pozostawiając tylko jeden milimetr od wejścia do komory przepływowej. Następnie należy oznaczyć komorę odpowiednimi parametrami doświadczalnymi Do przeprowadzenia eksperymentów dotykowych należy najpierw rozmrozić wszystkie niezbędne odczynniki na lodzie i przechowywać je na lodzie podczas pracy. Następnie pokryj komorę przepływową 20 mikrolitrami 5% niejonowego surfaktantu z kopolimeru blokowego rozpuszczonego w PEM-80 z małymi kroplami na obu końcach komory, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza wewnątrz.Następnie trzymaj komorę przepływową w wilgotnej komorze wykonanej z szalki Petriego z mokrą, niestrzępiącą się chusteczką laboratoryjną przez co najmniej pięć do siedmiu minut. Następnie wymieszaj PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, ditiotreitol, glukozę, glikol polietylenowy, wytworzoną wcześniej mieszankę tubuliny i MAP65 z GFP MAP65 w celu wizualizacji w sterylnej probówce, pipetując pięć do sześciu razy, utrzymując probówkę na lodzie. Następnie dodać jeden mikrolitr wstępnie zmieszanego roztworu oksydazy glukozowej i katalazy do probówki mieszaniny tubulina-MAP i ponownie wymieszać, przetaczając rury siedem do ośmiu razy.Podzielić całkowitą objętość roztworu na dwie porcje, które należy wykorzystać w oddzielnych komorach. Tymczasem ciecz dodana wcześniej do komory przepływowej musi zostać usunięta przez działanie kapilarne za pomocą niestrzępiącej się chusteczki laboratoryjnej na drugim końcu komory, wraz z dodaniem mieszanki tubulina-MAP do komory przepływowej. Gdy próbka znajdzie się całkowicie w komorze, uszczelnij dwa końce komory za pomocą pięciominutowej żywicy epoksydowej i utrzymuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 30 minut, aby zanukleować i wyhodować taktoidy mikrotubul.Do obrazowania taktoidów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej należy używać obiektywów o aperturze numerycznej 1,2 lub większej w powiększeniu 60X lub większym, aby zebrać wystarczającą ilość światła we fluorescencji. Rejestruj obrazy za pomocą bezpłatnego półprzewodnika z tlenku metalu lub kamery ze sprzężeniem ładunkowym. Aby utrzymać próbkę, należy ją przechowywać w komorze środowiskowej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.Alternatywnie można w tym celu zastosować inne grzejniki stopniowe, w tym nagrzewnice stopniowe na gorące powietrze i obiektywne kołnierze z regulacją temperatury z cyrkulacją ciepłej wody. Ponieważ odpowiednie źródła wzbudzenia są niezbędne do prawidłowej fluorescencji tubuliny rodaminy, należy użyć lasera 561 nm o mocy co najmniej jednego miliwata na próbce, aby uzyskać obrazy dobrej jakości. Jednak w przypadku GFP MAP65 zmień źródło wzbudzenia na laser 488-nanometrowy.Jeśli używasz mikroskopii epifluorescencyjnej o szerokim polu, użyj kostki filtra rodaminowego o wzbudzeniu 540 12,5 nanometra, dichroicznym 545 nanometrów 12,5 nanometra odcięcia i emisji 575 nanometrów długiego przepustu. W przypadku GFP MAT należy użyć kostki filtra GFP o wzbudzeniu 480 15 nanometrów, dichroicznym 505 nanometrach 15 nanometrów odciętych i emisji 515 nanometrów długoprzepustowych. Po upewnieniu się, że moc oświetlenia i czasy naświetlania są takie, że skala intensywności kamery nie jest nasycona, wykonaj co najmniej 10 zdjęć różnych obszarów, aby zobrazować ponad 100 taktoidów zarówno w kanale czerwonym, jak i zielonym, i zapisz je jako 16-bitowe obrazy TIFF do analizy.Korzystając z tego protokołu, taktoidy mikrotubul, których tworzenie kończy się w ciągu 30 minut, można bezpośrednio wizualizować pod mikroskopem. Taktoidy są widoczne zarówno za pomocą lasera o długości 561 nm w kanale tubuliny, jak i lasera o długości 488 nm w kanale MAP65. Obrazy również idealnie na siebie nakładają się.W tej metodzie można również zmierzyć długość i szerokość taktoidów. Stwierdzono, że profil intensywności taktoidu zmienia się wraz z jego szerokością. Co więcej, nieruchomy charakter taktoidów mikrotubul wykazano poprzez odzyskiwanie fluorescencji po eksperymentach fotowybielania lub FRAP, które nie wykazały żadnego odzyskania fluorescencji po fotowybielaniu.Z drugiej strony, eksperymenty FRAP ujawniły mobilną naturę MAP65, w przypadku której można było zaobserwować stopniową regenerację i fluorescencję po fotowybielaniu. Ten odzysk fluorescencji przez MAP65 może być dopasowany do rosnącego rozpadu wykładniczego, aby znaleźć amplitudę i skalę czasową odzyskiwania. Część eksperymentu taktoidowego powinna zostać zakończona w ciągu 10 do 12 minut, ponieważ tubulina może szybko zepsuć się na lodzie, co może być szkodliwe dla zarodkowania taktoidów.Przyszłe prace nad różnymi białkami sieciującymi mikrotubule i sieciującymi białkami motorycznymi, enzymami, które mogą poruszać mikrotubulami, będą nadal ujawniać nowe informacje na temat samoorganizacji wrzeciona mitotycznego.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Przedstawione tutaj są metody przygotowania aktywnych nematyków z mikrotubul i silników kinezynowych, w tym przygotowanie i budowa białek oraz wykorzystanie studni do aktywnego uwięzienia nematycznego.

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

Ten manuskrypt opisuje standardowe protokoły pomiaru hiperfosforylacji tau, pomiaru wiązania tau z mikrotubulami oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowego tau po leczeniu farmakologicznym. Protokoły te mogą być stosowane wielokrotnie do badań przesiewowych leków lub innych związków, które są ukierunkowane na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul.

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Poznaj metodę samodzielnego montażu taktoidów mikrotubul przy użyciu białka MAP65 i PEG. Ta technika umożliwia badanie organizacji mikrotubul oraz modelowanie wrzecion mitotycznych w systemach biologicznych.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Przeglądaj więcej filmów