Name: Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj metodę dostarczania shRNA za pomocą lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego polimeru polietyleniminy. Technika ta umożliwia efektywne wytwarzanie cząstek wirusowych z wysoką wydajnością transdukcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Uniwersytetu Zjednoczonych Emiratów Arabskich (UAEU), grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) i # 12R010 (grant UAEU-AUA). Dziękujemy prof. Randallowi Morse'owi (Wadsworth Center, Albany, NY) za pomoc w redagowaniu manuskryptu pod względem stylu i gramatyki.
Wszystkie dane są dostępne na żądanie.

1. Transfekcja komórek HEK293T przy użyciu odczynnika PEI lub Lipofectamine 3000
<ol>
	<li>Hodowla komórek HEK293T w DMEM + 10% FBS + 1x penicylina/streptomycyna w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z atmosferą 5%CO2 i 21%O2 aż do 90% zlewania się przed wysiewem do transfekcji. Do produkcji wirusa o wysokim mianie należy używać stosunkowo niskiej liczby komórek (najlepiej mniej niż P30).</li>
	<li>Wysiewaj 4 x 106 komórek w 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej na 100 mm płytce do hodowli tkankowej i hoduj przez noc w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 5% CO2 i 21%O2 .</li>
	<li>Dla każdej transfekcji rozcieńczyć plazmidowe DNA (zapasy 1 mg / ml) w 1 ml pożywki DMEM wolnej od surowicy w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, stosując następujący stosunek plazmidów wejściowych i pakujących: 
	Wektor wejściowy = 10 μg 
	psPAX2.0 = 7.5 μg 
	pMD2.G = 5 μg</li>
	<li>Wiruj przez 10 s i wiruj probówkę przy 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej, aby zebrać.</li>
	<li>Dodać 70 μl (1 mg/ml roztworu podstawowego) PEI do probówki, a następnie krótko wirować i wirować, jak opisano powyżej, aby zebrać. Objętość użytego PEI opiera się na stosunku 1:3 całkowitego DNA (μg):P EI (μg).</li>
	<li>W przypadku transfekcji na bazie lipofektaminy rozcieńczyć powyższe wektory w 500 μl pożywki DMEM bez surowicy zawierającej 45 μl odczynnika P dostarczonej w zestawie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć 70 μl odczynnika L dostarczonego w zestawie przy użyciu 500 μl pożywki DMEM bez surowicy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Połączyć zawartość obu probówek i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić tworzenie się kompleksu.</li>
	<li>Dodać kroplami 1 ml kompleksu DNA/PEI lub 1 ml kompleksu DNA/lipofektamina do płytki zawierającej komórki i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5%CO2 i 21%O2.</li>
	<li>Po 6 godzinach należy zmienić na świeżą, kompletną pożywkę wzrostową (10 ml) i zawrócić komórki z powrotem do wilgotnego inkubatora w atmosferze 5% CO2 i 21%O2 .</li>
</ol>
2. Pobieranie LVS i ultrawirowanie
<ol>
	<li>Po 2 dniach od transfekcji zebrać pożywkę zawierającą wirusa i ponownie nałożyć na komórki 10 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Po 3 dniach od transfekcji należy zebrać pożywkę zawierającą wirusa i połączyć ją z pożywką zawierającą wirusa zebraną w ciągu 2 dni.</li>
	<li>Odwirować supernatant wirusa przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia szczątków komórkowych.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant za pomocą filtra o wielkości porów 0,45 μm o niskim stopniu wiązania białek (PES lub SFCA) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do ultrawirowania. Przefiltrowany supernatant zawierający cząstki lentiwirusa może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 5 dni bez znaczącej utraty miana wirusa.</li>
	<li>Wysterylizuj probówki ultrawirówkowe zawierające kubki, myjąc je 70% etanolem przez 10 minut, wysusz na powietrzu, zamknij i utrzymuj w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 36 ml przefiltrowanej pożywki zawierającej cząstki lentiwirusa do sterylnej probówki ultrawirówkowej.</li>
	<li>Napełnij 5 ml sterylnej pasiaszki 4 ml sterylnego 20% roztworu sacharozy (przygotowanego w PBS) i dozuj go bezpośrednio na dno probówki ultrawirówki (UC) zawierającej LVS. Ważne jest, aby roztwór sacharozy nie mieszał się z pożywką i tworzył gradient na dnie probówki.</li>
	<li>Zrównoważyć wszystkie probówki ultrawirówkowe za pomocą pożywki DMEM bez surowicy, umieścić w zimnych kubkach na probówkę ultrawirówki i zamknąć pokrywki.</li>
	<li>Wirować probówki w temperaturze 125 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie wyrzucić supernatant, odwracając zawartość probówki w pojemniku zawierającym wybielacz, nie naruszając osadu. Zaznacz granulkę, jeśli jest widoczna.</li>
	<li>Umieść probówkę ultrawirówki w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 200 μl sterylnego DPBS dokładnie na wierzchu osadu. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc w spokoju.</li>
	<li>Następnego dnia delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół 40 razy.</li>
	<li>Krótko odwiruj z prędkością 13 000 x g w wirówce stołowej, aby rozdrobnić wszelkie zanieczyszczenia.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki i podzielić preparat wirusa na porcje 20 μl. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Odstawić 5 μL preparatu do pomiaru miana wirusa.</li>
</ol>
3. Pomiar miana LVS dla wektorów opartych na pLKO.1
<ol>
	<li>Określić miano cząstek lentiwirusa za pomocą qPCR zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	<li>Dla krzywej wzorcowej należy przygotować pięć 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń wzorcowego kontrolnego DNA (dostarczonego w zestawie), rozcieńczając 5 μl DNA do 45 μl H2O w każdym etapie. Użyj rozcieńczeń od 1:100 do 1:100 000, aby wygenerować krzywą standardową.</li>
	<li>Ustaw reakcje na lodzie w dwóch egzemplarzach w następujący sposób: 
	2x qPCR master mix 10 μL 
	Mieszanka gruntująca 2 μL 
	Próbka lub wzorcowy DNA 2 μL 
	Nie zawiera nukleazH2O, 6 μL</li>
	<li>Wykonuj qPCR w warunkach cyklicznych wymienionych w instrukcji zestawu, w sumie 35 cykli.</li>
	<li>Wykreśl wartości progowe cyklu (Ct) na osi Y w porównaniu z mianem wirusa na osi X.</li>
	<li>Wygeneruj regresję logarytmiczną przy użyciu czterech standardowych kontrolnych rozcieńczeń DNA (1:100 do 1:100 000), aby określić miano nieznanej próbki wirusa za pomocą równania linii trendu.</li>
</ol>
4. Pomiar miana LVS dla wektorów opartych na pll3.7
<ol>
	<li>Wysiewać 1 x 105 HEK293T komórek w każdym dołku płytki dołowej P12 w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej 24 godziny przed infekcjami.</li>
	<li>Uzupełnij pożywkę 8 μg/ml polibrenu i dodaj 1 ml do każdej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Rozcieńczyć cząsteczki wirusa za pomocą 4 μl, 2 μl, 1 μl, 0,5 μl i 0,1 μl skoncentrowanych cząstek lentiwirusowych w każdym z 1 ml pożywki zawierającej polibren.</li>
	<li>Zastąpić pożywkę z komórek HEK293T pożywką zawierającą wskazane ilości cząstek lentiwirusa wraz z 8 μg/ml polibrenu i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o atmosferze 5%CO2 i 21%O2.</li>
	<li>Następnego dnia należy zmienić pożywkę na świeżą i kontynuować hodowlę przez 72 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 i 21%O2 .</li>
	<li>Po 72 godzinach przemyć komórki PBS, trypsynizować w temperaturze 37 °C zgodnie z protokołem producenta i ponownie zawiesić w 1 ml PBS.</li>
	<li>Wykonaj sortowanie komórek FACS za pomocą sortera komórek, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Ustaw bramkę na 0% komórek dodatnich GFP przy użyciu niezakażonych komórek HEK293T i policz 50 000 zdarzeń dla każdej próbki, aby określić procent komórek dodatnich dla każdego rozcieńczenia wirusa.</li>
	<li>Do obliczenia miana cząstek lentiwirusa należy używać tylko objętości cząstek lentiwirusa, które dają komórki %GFP dodatnie w zakresie 2%-20%.</li>
</ol>
5. Zakażenie hESC i stabilna selekcja
<ol>
	<li>Umyj komórki 2 ml PBS rosnące w każdym dołku 6-dołkowej płytki wielodołkowej do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Odłączyć komórki od płytki do hodowli komórkowej za pomocą 1 ml 1x odczynnika do dysocjacji komórek przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Zebrać komórki w pożywce DMEM/F12 i odwirować przy 1,500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu zebrania osadu komórkowego.</li>
	<li>Aspirat, ponownie zawiesić komórki w 1 ml i policzyć za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wykonać zawiesinę komórkową z 2 x 105 komórek/ml kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej mTeSR1 uzupełnionej 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF), penicyliny/streptomycyny (P / S) i inhibitora 10 μM ROCK (RI).</li>
	<li>Zasiać 1 x 105 komórek na 50-krotnie rozcieńczonych, kompletnych płytkach P24-dołkowych pokrytych matrycą błony podstawnej w 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej i wyhodować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5% CO2 i 21%O2 .</li>
	<li>Następnego dnia zakażone hESC przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 należy zainfekować polibrenem o stężeniu 8 μg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin.</li>
	<li>Po 8 godzinach zastąp pożywkę zawierającą wirusa świeżą pożywką wzrostową (-RI) i kontynuuj hodowlę, aż komórki zlewają się w 90%.</li>
	<li>Rozpocznij selekcję puromycyny (0,8 μg/ml), gdy komórki osiągną 90% zbieżności, co zwykle ma miejsce 48-72 godziny po zakażeniu.</li>
	<li>Po zakończeniu selekcji (zwykle 4-6 dni) podziel stabilne komórki (1:4) i roznaż komórki w celu kriokonserwacji i dalszej analizy.</li>
</ol>
6. Transdukcja nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z H9 (NPC)
UWAGA: NPC zostały pozyskane z komórek H9 przy użyciu protokołu hamowania dual-Smad, jak opisano wcześniej19.
<ol>
	<li>Krótko mówiąc, potraktuj komórki H9 odczynnikiem dysocjacji komórek w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby wytworzyć pojedyncze komórki i ponownie zawiesić w kompletnych pożywkach wzrostowych zawierających mTeSR1 uzupełnione 10 ng / ml zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF), penicyliną / streptomycyną (P / S) i inhibitorem 10 μM ROCK (RI). Wysiew na rozcieńczonych 6-dołkowych szalkach do hodowli komórkowych pokrytych Matrigelem w stosunku 1:50 o gęstości 60 000 komórek/cm2 (dzień 0).</li>
	<li>Zainicjuj różnicowanie, gdy komórki osiągną 95%-100% konfluencji, zmieniając na 100% pożywkę KSR zawierającą LDN193189 (200 nM) i SB431542 (10 μM) (dzień1).</li>
	<li>W drugim dniu należy ponownie zmienić nośnik ze 100% KSR uzupełnionym o LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) i XAV939 (5 μM).</li>
	<li>W 4. dniu różnicowania należy przejść na mieszaninę pożywki KSR (75%) i pożywki N2 (25%) z LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) i XAV939 (5 μM).</li>
	<li>Od 6 do 12 dnia stopniowo zmieniaj pożywkę na 100% N2 uzupełnioną o LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) i XAV939 (5 μM), zwiększając pożywkę N2 o 25% każdego dnia i zmieniając pożywkę co 2 dni.</li>
	<li>Dzień hodowli 12 NPC w pożywce N2:B27 uzupełnionej 20 ng/mL bFGF.</li>
	<li>Zasiać 2 x 105 komórek w każdym dołku rozcieńczonej w stosunku 1:50, kompletnej płytki P6 pokrytej matrycą błony podstawnej w 2 ml pożywki hodowlanej NPC i inkubować, aby umożliwić komórkom przyczepienie się.</li>
	<li>Następnego dnia należy zainfekować komórki cząstkami lentiwirusa w MOI 6 w obecności 8 μg/ml polibrenu.</li>
	<li>Po 8 godzinach zastąp pożywkę zawierającą wirusa świeżą pożywką wzrostową NPC.</li>
	<li>Następnego dnia powtórz infekcje i zmień pożywkę po 8 godzinach.</li>
	<li>Trzymaj komórki w kulturze przez 72 godziny przed zbiorem w celu dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+Somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li>
<li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li>
<li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105(2008).</li>
<li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li>
<li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery+systems%3A+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li>
<li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells%3A+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li>
<li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+high-intensity+field+pulses%3A+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li>
<li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li>
<li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li>
<li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li>
<li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991(2021).</li>
<li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017(2016).</li>
<li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415(2017).</li>
<li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li>
<li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Zdolność do genetycznej modyfikacji komórek macierzystych do celów badawczych lub klinicznych jest ograniczona zarówno technologią, jak i podstawową wiedzą na temat biologii hESC. Techniki, które wykazały znaczny potencjał w mysich ESC, takie jak lipofekcja i elektroporacja, nie są wysoce skuteczne w przypadku hESC, które są notorycznie trudne do dostarczenia genów konwencjonalnymi metodami20. Koncepcja ta doprowadziła nie tylko do optymalizacji istniejących technik, ale także do opracowania nowat...

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) pochodzące z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty są pluripotencjalne i mogą być różnicowane na różne typy komórek w zależności od czynników zewnętrznych w warunkach in vitro1,2. Aby w pełni wykorzystać potencjał hESC, konieczne jest dysponowanie szybkimi i niezawodnymi metodami dostarczania genów do tych komórek. Konwencjonalnie stosowane techniki można ogólnie podzielić na dwa typy: niewirusowe i wirusowe systemy dostarczania genów3,4. Częściej stosowanymi niewirusowymi systemami dostarczania genów są lipofekcja, elektroporacja i nukleofekcja. Niewirusowe systemy dostarczania są korzystne ze względu na mniejszą liczbę mutacji insercyjnych i ogólny spadek immunogenności5,6. Jednak metody te skutkują niską wydajnością transfekcji i krótkim czasem trwania przejściowej ekspresji genów, co jest głównym ograniczeniem dla długoterminowych badań różnicowania7. Elektroporacja skutkuje lepszą wydajnością transfekcji w porównaniu z lipofekcją; Powoduje to jednak ponad 50% śmierć komórki8,9,10. Korzystając z nukleofekcji, przeżycie komórek i wydajność transfekcji można poprawić, łącząc lipofekcję i elektroporację, ale podejście to wymaga specyficznych dla komórek i specjalistycznego sprzętu, a zatem staje się dość kosztowne dla zastosowań na większą skalę11,12.
W przeciwieństwie do tego, wektory wirusowe wykazały zwiększoną skuteczność transfekcji, jak również ogólnie niską cytotoksyczność po transdukcji. Ponadto dostarczone geny ulegają stabilnej ekspresji, co sprawia, że metoda ta jest idealna do długoterminowych badań13. Do najczęściej stosowanych wektorów wirusowych do dostarczania genów do hESC należą wektory lentiwirusowe (LVS), które mogą zapewnić ponad 80% skuteczność transdukcji przy użyciu cząstek wirusa o wysokim mianie14,15. Lipofekcja i wytrącanie CaPO4 są jednymi z najczęściej stosowanych metod przejściowej transfekcji komórek HEK293T lub ich pochodnych za pomocą wektorów transferu genów wraz z plazmidami pakującymi w celu uzyskania cząstek lentiwirusowych16. Chociaż lipofekcja skutkuje dobrą wydajnością transfekcji i niską cytotoksycznością, technika ta jest utrudniona ze względu na jej koszt, a skalowanie w celu uzyskania cząstek lentiwirusa o wysokim mianie byłoby bardzo kosztowne. Wytrącanie CaPO4 skutkuje stosunkowo podobną wydajnością transfekcji do tych uzyskiwanych przy użyciu lipofekcji. Chociaż jest to opłacalne, wytrącanie CaPO4 powoduje znaczną śmierć komórek po transfekcji, co utrudnia standaryzację i unikanie różnic między partiami17. W tym scenariuszu opracowanie metody, która zapewnia wysoką wydajność transfekcji, niską cytotoksyczność i opłacalność, ma kluczowe znaczenie dla produkcji cząstek lentiwirusowych o wysokim mianie, które mają być stosowane w hESC.
Polietylenina (PEI) to kationowy polimer, który może transfekować HEK293T komórki z wysoką wydajnością bez dużej cytotoksyczności i ma znikomy koszt w porównaniu do metod opartych na lipofekcji18. W tej sytuacji PEI może być stosowany do zastosowań na większą skalę w produkcji LVS o wysokim mianie poprzez zagęszczanie cząstek lentiwirusa z supernatantów hodowlanych przy użyciu różnych technik. W prezentowanym artykule opisano zastosowanie PEI do transfekcji komórek HEK293T oraz zagęszczenia wektora lentiwirusowego za pomocą ultrawirowania przez poduszkę sacharozową. Stosując tę metodę, regularnie uzyskujemy miana znacznie powyżej 5 x 107 j.m./ml z niskimi wahaniami między partiami. Metoda jest prosta, nieskomplikowana i opłacalna w przypadku zastosowań na dużą skalę w zakresie dostarczania genów do komórek hESC i komórek pochodzących z hESC.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38,5 ml, sterylne + certyfikowane bezpłatne cienkościenne ultraprzezroczyste probówki z otwartym topem</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Rekombinowany ludzki</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej FRAC V</td><td>Invitrogen</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Podstawna membrana macierzynna, wolna od LDEV</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Mieszanka składników odżywczych F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez: Ca i Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica do życia płodu</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Przeciwciało mAb królika</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon Aminokwasy endogenne (NEAA) 100X Roztwór</td><td>GE healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamina, 100X&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH Przeciwciało poliklonalne</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH shRNA</td><td>Macrogen</td><td></td><td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 kompletne podłoże</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa 1X CTS</td><td>Suplement Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Neuropan 27 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pLKO.1 Wektor TRC</td><td>Addgene</td><td>10878</td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7 wektor&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do infekcji polibrenem</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninina, rozgałęziona</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Tocris</td><td>4551/10</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>A1113802</tr><tr><td>Inhibitor ROCK Y-27632 dichlorowodorek&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

dostarczanie shrna za pośrednictwem lentiwirusów do hesc i npc przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (pei)

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Obecny protokół opisuje użycie cząsteczek lentiwirusowych do dostarczania krótkich RNA (shRNA) zarówno do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), jak i nerwowych komórek progenitorowych (NPC) pochodzących z hESC z wysoką wydajnością. Cząsteczki lentiwirusa zostały wygenerowane przez kotransfekcję komórek HEK293T przy użyciu wektorów wejściowych (przenoszących shRNA) wraz z plazmidami pakującymi (pAX i pMD2.G) przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleneniminy (PEI). Cząstki wirusa zagęszczono za pomocą ultrawirowania, w wyniku czego uzyskano średnie miana powyżej 5 x 107. Zarówno hESC, jak i NPC mogą być zakażone z dużą skutecznością przy użyciu tych cząstek lentiwirusowych, jak wykazano na podstawie selekcji puromycyny i stabilnej ekspresji w hESC, a także przejściowej ekspresji GFP w NPC. Co więcej, analiza western blot wykazała znaczne zmniejszenie ekspresji genów, na które ukierunkowane są shRNA. Ponadto komórki zachowały swoją pluripotencję, a także potencjał różnicowania, o czym świadczy ich późniejsze różnicowanie w różne linie OUN. Obecny protokół dotyczy dostarczania shRNA; jednak to samo podejście można zastosować do ektopowej ekspresji cDNA do badań nadekspresji.

Po transferze genów niezbędna jest wysoka żywotność hESC. Mimo wysiłków i optymalizacji protokołów mających na celu zmniejszenie śmiertelności komórek po elektroporacji hESC, po tym zabiegu nadal obserwuje się śmierć ponad 50% komórek, co towarzyszy niskiej wydajności transfekcji20. Transfer genów za pośrednictwem lentiwirusów zapewnia nie tylko wysoką wydajność transferu, ale wykazuje również wysoki poziom żywotności komórek po transdukcji. Poniższe wyniki przedstawiają dwa podejścia: jedno z wyk...

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

Transfekcja komórek HEK293T musi być wykonywana przy 90% zbieżności. Niezbędne jest również zastosowanie 0,45-mikronowego filtra o niskim poziomie wiązania białek do filtracji wektorów lentiwirusowych oraz zastosowanie poduszki sacharozowej do ultrawirowania. Rozpocznij od hodowli HEK293T komórek w pożywce DMEM zawierającej 10% FBS i 1X penicylinę streptomycynę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze z atmosferą 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu, aż komórki osiągną 90% konfluencji przed wysiewem do transfekcji.Wysiew cztery razy od 10 do sześciu komórek w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej na 100-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej i hoduj przez noc w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych z atmosferą 5% dwutlenku węgla i 21% tlenu. Dla każdej transfekcji rozcieńczyć jeden miligram na mililitr plazmidowych zapasów DNA w jednym mililitrze bezsurowicowej pożywki DMEM w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych, postępując zgodnie ze stosunkiem plazmidów wejściowych i pakujących, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Wiruj rurkę przez 10 sekund i wiruj z prędkością 10 000 razy G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, aby zebrać.Następnie dodaj do

lentiviral-mediated-delivery-shrnas-to-hescs-npcs-using-low-cost

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Artykuł szczegółowo opisuje protokół swoistej miejscowo transfekcji komórek ssaków w hodowli adherentnej za pomocą matrycy mikroelektrod (MEA) z wykorzystaniem siRNA o sekwencji scrambled.

Wysokoefektywna, specyficzna lokalnie transfekcja komórek adherentnych siRNA przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEA)

Źródło: Tagliafierro, L., et al. Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje transdukcję lentiwirusową nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w celu ukierunkowanej modyfikacji epigenetycznej alfa-synukleiny, kluczowego białka w chorobie Parkinsona. Protokół umożliwia metylację DNA za pośrednictwem metylotransferazy,...

Transdukcja lentiwirusowa nerwowych komórek progenitorowych w celu epigenetycznej regulacji ekspresji alfa-synukleiny

W tym filmie demonstrujemy metodę przeprowadzania transdukcji wektorów lentiwirusowych shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown w unieśmiertelnionych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (iHSPC).

Knockdown genów za pośrednictwem RNA za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów w iHSPC in vitro: system ekspresji shRNA oparty na lentiwirusie dostarczany do iHSPC w celu wyeliminowania określonej ekspresji genów

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Dostarczanie pozostaje głównym wyzwaniem dla terapeutycznej implementacji małego interferującego RNA (siRNA). Protokół ten polega na wykorzystaniu wielofunkcyjnej i biokompatybilnej platformy dostarczania siRNA, składającej się z porowatych mikrocząstek krzemu szczepionych argininą i polietyleniną.

Porowate mikrocząsteczki krzemu do dostarczania terapii siRNA

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Ten manuskrypt opisuje efektywne, niewirusowe dostarczanie miR do komórek śródbłonka przez wektor PEI/MNP i ich namagnesowanie. Tak więc, oprócz modyfikacji genetycznej, podejście to pozwala na magnetyczne prowadzenie komórek i wykrywalność MRI. Technika ta może być stosowana w celu poprawy właściwości terapeutycznych produktów komórkowych.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro namagnesowanych komórek śródbłonka zmodyfikowanych miR

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiono protokół tworzenia zmodyfikowanych genowo ludzkich pseudowysp trzustkowych z rozproszonych ludzkich komórek wysp trzustkowych, które są transdukowane przez lentiwirusa niosącego krótkie RNA spinki do włosów (shRNA). Protokół ten wykorzystuje łatwo dostępne naczynia enzymatyczne i hodowlane, może być łatwo wykonywany i wytwarza genetycznie zmodyfikowane ludzkie pseudowysepki odpowiednie do badań funkcjonalnych i morfologicznych.

Wyciszanie genów za pośrednictwem lentiwirusa w ludzkiej pseudowysepce przygotowanej na płytkach o niskim przyłączeniu

Poznaj metodę dostarczania shRNA za pomocą lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego polimeru polietyleniminy. Technika ta umożliwia efektywne wytwarzanie cząstek wirusowych z wysoką wydajnością transdukcji.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Przeglądaj więcej filmów