Name: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę RNA FISH do wizualizacji kolonizacji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans. Technika ta umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen w modelu nicienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Marie-Anne Félix za dostarczenie nam dzikich szczepów nicieni. Praca ta była wspierana przez NSF w ramach grantu CAREER 2143718 oraz Uniwersytet Stanowy Kalifornii w ramach nagrody CSUPERB New Investigator Award dla RJL, NIH w ramach R01 AG052622 i R01 GM114139 dla ERT oraz przez stypendium American Heart Association dla VL.

UWAGA: Nicienie mogą być utrwalane roztworem paraformaldehydu (PFA) lub acetonem. PFA pozwala na lepszą wizualizację morfologii niż aceton i może zachować sygnały z transgenicznego białka zielonej fluorescencji (GFP), które jest niszczone przez aceton. Jednak utrwalanie acetonu jest konieczne do przepuszczalności zarodników mikrosporydów, aby umożliwić oznakowanie tego etapu życia. Co więcej, aceton może być wygodniejszy niż PFA, ponieważ jest mniej toksyczny, a próbki można przechowywać przez kilka dni w acetonie w zamrażarce o temperaturze -20 °C bez konieczności usuwania utrwalacza. Poniżej znajdują się dwa oddzielne protokoły, w których jako utrwalacz stosuje się roztwór PFA lub aceton. Aby zapoznać się z wizualizacją kroków protokołu, zobacz Rysunek 1.
1. Barwienie ryb z utrwalaniem PFA
<ol>
	<li>Przygotuj nicienie z powiązanymi drobnoustrojami
	<ol>
		<li>Hoduj nicienie z pożądanym mikrobem na standardowych płytkach pożywki do wzrostu nicieni (NGM) obsianych odpowiednim źródłem pożywienia. Nicienie należy inkubować w temperaturze 20 °C aż do osiągnięcia pożądanego etapu życia.</li>
		<li>Dodaj 2 ml pożywki M9 o minimalnej zawartości soli (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH4Cl) + 0,1% Tween 20 do NGM płytki zawierające szczep Caenorhabditis zakażony lub skolonizowany pożądanym drobnoustrojem, który ma być uwidoczniony. 
		UWAGA: Dodanie detergentu ma na celu zapobieżenie przywieraniu nicieni do pipet i probówek do mikrofuge oraz pomoc w osadzaniu nicieni w stadium L1-L2. 0,1% Triton-X może być używany zamiast animacji 20.</li>
		<li>Odpipetować nicienie z płytek za pomocą szklanej pipety Pasteura i gruszki, a następnie przenieść je do oznaczonych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Preferowane są pipety szklane, ponieważ nicienie mogą przyklejać się do plastikowych pipet, ale dodanie detergentu (Tween 20 lub Triton-X) może zminimalizować ten problem.</li>
		<li>Za pomocą mikrowirówki odwirować próbki zawierające skolonizowane lub zakażone nicienie w temperaturze 2000 x g przez 60 s dla zwierząt L1 lub 500 x g przez 60 s dla L4 lub dorosłych zwierząt. Wszystkie kolejne etapy wirowania zostaną wykonane z wybraną prędkością.</li>
		<li>Usunąć supernatant z probówek do mikrofuge za pomocą pipety. Unikać naruszania osadu nicieni poprzez ostrożne usuwanie supernatantu do 100 μl powyżej osadu. Można to oszacować za pomocą oznaczonych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj nicienie, aby wyeliminować zanieczyszczenia zewnętrzne
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) + 0,1% Tween 20 (PBS-T) do probówek do mikrofuge.</li>
		<li>Odwirować próbki w mikrowirówce z odpowiednią prędkością (patrz krok 1.1.4). Za pomocą pipety usunąć wszystkie substancje supernatantu z wyjątkiem 100 μl. Można to oszacować za pomocą oznaczonych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Powtórz powyższe dwa kroki 2-3x. 
		UWAGA: Zazwyczaj wystarczą trzy całkowite prania; Można jednak wykonać dodatkowe mycie w celu usunięcia nadmiaru zanieczyszczeń zewnętrznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napraw nicienie za pomocą PFA
	<ol>
		<li>W dygestorium dodać 33 μl 16% PFA do rurki do mikrodymki zawierającej 100 μl supernatantu powyżej osadu nicieni otrzymanego w kroku 1.2.3 dla końcowego stężenia 4% PFA. 
		UWAGA: PFA jest czynnikiem rakotwórczym. Kontakt z PFA może powodować uczulenie i podrażnienie skóry oraz uszkodzenie oczu. PFA uwalnia toksyczne opary, które mogą prowadzić do podrażnienia lub uczulenia dróg oddechowych. W przypadku stosowania PFA należy pracować pod wyciągiem z odpowiednim wyposażeniem ochrony osobistej i przed użyciem zapoznać się z odpowiednimi kartami charakterystyki.</li>
		<li>Próbki zawierające nicienie skolonizowane lub zakażone drobnoustrojem należy inkubować przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji próbki należy przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C do momentu, gdy protokół będzie gotowy do kontynuacji. 
		UWAGA: Krótszy okres inkubacji jest lepszy dla utrzymania sygnału GFP w szczepach transgenicznych ze względu na degradację GFP przez PFA w czasie. Dłuższy czas inkubacji pozwala utrwalaczowi lepiej przenikać do próbek. Najlepiej jest określić czas inkubacji empirycznie w zależności od próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń roztwór PFA
	<ol>
		<li>Odwirować próbki w mikrowirówce z odpowiednią prędkością (patrz krok 1.1.4). Za pomocą pipety usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu. 
		UWAGA: Supernatant zawiera PFA, który jest toksyczny. Wyrzucić sklarowany osad i co najmniej dwa pierwsze płukania jako odpady toksyczne do dygestorium.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml PBS-T do próbek w probówkach do mikrofuge.</li>
		<li>Wykonaj i powtórz kroki 1.4.1 i 1.4.2 2-3x z PBS-T. 
		UWAGA: Wykonanie większej liczby prań pomoże zredukować sygnał tła. Zalecane są co najmniej cztery prania w sumie.</li>
		<li>Po ostatnim przepłukaniu odwirować próbki i usunąć supernatant, pozostawiając osad w nienaruszonym stanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor hybrydyzacyjny (HB) i umyć nicienie
	<ol>
		<li>Przygotować 1 ml HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01% SDS) na próbkę. 
		UWAGA: HB należy przygotować na świeżo przed każdym użyciem, aby uniknąć wytrącania się osadów. Jednak ogólny bufor (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, gdy HB będzie potrzebny. Przed użyciem należy przygotować 1 ml na próbkę buforu ogólnego i dodać SDS do końcowego stężenia 0,01%.</li>
		<li>Dodać 800 μl HB do probówek do mikrokrów zawierających osad nicieni. Osadzać próbki w mikrowirówce (patrz krok 1.1.4). Usunąć supernatant bez naruszania osadu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zhybrydyzuj sondę FISH do żądanej sekwencji docelowej
	<ol>
		<li>Zmieszać 100 μl na próbkę przygotowanego HB z żądaną sondą FISH do końcowego stężenia 5-10 ng/μL sondy. 
		UWAGA: Sondy FISH to 15-23 -merowe oligonukleotydy, antysensowne do SSU badanego drobnoustroju i znakowane kolorowym fluoroforem przyczepionym do końca 5' lub 3' (patrz Tabela 1 dla używanych tutaj sond). Ogólnie rzecz biorąc, standardowe sondy FISH są przechowywane w temperaturze 1 mg/ml.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 100 μl sondy FISH zawierającej HB. Wymieszaj, delikatnie przesuwając lub odwracając rurki. 
		UWAGA: Różne kolorowe sondy FISH mogą być dodawane jednocześnie, aby uwidocznić wiele sygnałów fluorescencyjnych w tej samej próbce (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Próbki inkubować przez noc (6-24 h) w suchej łaźni w temperaturze 46-54 °C lub w mieszalniku termicznym w temperaturze 46-54 °C przy 1 200 obr./min. 
		UWAGA: Inkubacja w temperaturze 46-48 °C jest zwykle stosowana do hybrydyzacji. Jednak temperatura ta może wymagać dostosowania w zależności od temperatury topnienia sondy FISH. Ogólnie rzecz biorąc, temperatura hybrydyzacji jest o 4 °C niższa od temperatury topnienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij sondę FISH i umyj nicienie
	<ol>
		<li>Przygotować 3 ml buforu do przemywania (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) na próbkę. 
		UWAGA: WB należy przygotować na świeżo przed każdym użyciem, aby uniknąć opadów. Można jednak wcześniej przygotować ogólny bufor (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) i przechowywać go w temperaturze pokojowej do czasu, gdy bufor płuczący będzie potrzebny. Przed użyciem należy przygotować 3 ml na próbkę buforu ogólnego i dodać EDTA do końcowego stężenia 5 mM i SDS do końcowego stężenia 0,01%.</li>
		<li>Odwirować próbki z odpowiednią prędkością (patrz krok 1.1.4). Usuń HB za pomocą pipety, uważając, aby pozostawić osad nicieni w spokoju.</li>
		<li>Dodać 1 ml przygotowanego WB do każdej próbki.</li>
		<li>Odwirować próbki z odpowiednią prędkością (patrz krok 1.1.4). Usuń WB za pomocą pipety, uważając, aby pozostawić granulkę w spokoju.</li>
		<li>Dodać 1 ml przygotowanego WB do każdej próbki.</li>
		<li>Próbki inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 48–56 °C w suchej łaźni (lub w mieszalniku termicznym w temperaturze 48–56 °C przy 1200 obr./min). W przypadku inkubacji w suchej kąpieli delikatnie odwracaj probówki co 15-20 minut. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, jako standardową temperaturę prania przyjmuje się 48 °C; Jednak temperatura ta może wymagać dostosowania, jeśli występuje wysoki sygnał tła. Temperatura prania jest często o 2 °C wyższa niż temperatura hybrydyzacji. Czas inkubacji w WB można skrócić do 30 minut, aby jeszcze bardziej zredukować tło, po czym kroki 1.7.4 i 1.7.5 należy powtórzyć. Następnie należy wykonać jeden (w przypadku bakterii) lub dwa (w przypadku sporoplazm mikrosporydiów) 30-minutowe okresy inkubacji w temperaturze 48 °C.</li>
		<li>Odwirować próbki z odpowiednią prędkością (patrz krok 1.1.4). Za pomocą pipety wyjmij bufor do mycia, uważając, aby pozostawić granulkę w spokoju.</li>
		<li>Dodać 100-500 μl PBS-T do każdej z próbek. Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w PBS-T w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, dopóki protokół nie będzie gotowy do kontynuacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wsiądź nicienie
	<ol>
		<li>Odwirować próbki z odpowiednią prędkością (patrz krok 1.1.4). Usuń jak najwięcej PBS-T bez naruszania osadu nicieni.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Do próbek dodać 20 μl podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu z DAPI (tabela materiałów).</li>
		<li>Załadować pipetę o pojemności 20 μl końcówką do pipety o pojemności 200 μl i za pomocą nożyczek odciąć końcówkę pipety, aby umożliwić pipetowanie większych nicieni.</li>
		<li>Za pomocą przeciętej końcówki pipety przenieś 5-10 μl granulki na szkiełko mikroskopowe. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym 22 x 22. Aby przechowywać szkiełka, należy uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i przechowywać je w ciemnym pudełku w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie RYB za pomocą utrwalania acetonu
<ol>
	<li>Przygotuj nicienie wraz z powiązanymi drobnoustrojami, jak opisano w kroku 1.1.</li>
	<li>Umyj nicienie, aby wyeliminować zanieczyszczenia zewnętrzne, jak opisano w kroku 1.2.</li>
	<li>Napraw nicienie acetonem
	<ol>
		<li>Usunąć supernatant bez naruszania osadu i dodać 1 ml acetonu laboratoryjnego do próbki. 
		UWAGA: Aceton jest wysoce łatwopalną cieczą i parą. Chociaż można go kupić bez recepty jako zmywacz do paznokci, należy pamiętać, że aceton powoduje poważne podrażnienie oczu i może powodować senność lub zawroty głowy.</li>
		<li>Próbki zawierające nicienie skolonizowane lub zakażone drobnoustrojem należy inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji próbki można przechowywać w acetonie w temperaturze -20 °C przez okres do 2 tygodni, aż protokół będzie gotowy do kontynuacji. 
		UWAGA: Nie należy stosować tego protokołu w przypadku transgenicznych szczepów C. elegans wykazujących ekspresję GFP (lub jego zmutowanych form allelicznych), jeśli pożądane jest utrzymanie fluorescencji, ponieważ aceton niszczy ten sygnał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń aceton
	<ol>
		<li>Odwirować próbki w mikrowirówce z odpowiednią prędkością (patrz krok 1.1.4). Za pomocą pipety usunąć supernatant bez naruszania osadu. 
		UWAGA: Supernatant zawiera aceton. Wyrzucić sklarowany osad i co najmniej dwa pierwsze płukania jako odpady toksyczne do dygestorium.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml PBS-T do próbek w probówkach do mikrofuge.</li>
		<li>Wykonaj i powtórz kroki 2.4.1 i 2.4.2 2-4x z PBS-T. 
		UWAGA: Wykonanie większej liczby prań pomoże zredukować sygnał tła. Zaleca się wykonanie łącznie czterech prań.</li>
		<li>Po ostatnim płukaniu odwirować próbki i usunąć supernatant, upewniając się, że osad jest nienaruszony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor hybrydyzacyjny (HB) i umyć nicienie zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
	<li>Zhybrydyzuj sondę FISH do żądanej sekwencji docelowej, jak opisano w kroku 1.6.</li>
	<li>Wyjmij sondę FISH i umyj nicienie
	<ol>
		<li>Przygotować 1,1 ml buforu do przemywania (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01% SDS) na próbkę. 
		UWAGA: WB należy przygotować na świeżo przed każdym użyciem, aby uniknąć opadów. Jednak ogólny bufor (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, gdy potrzebny będzie bufor do płukania. Przed użyciem należy przygotować 1,1 ml na próbkę buforu ogólnego i dodać EDTA do końcowego stężenia 5 mM i SDS do końcowego stężenia 0,01%.</li>
		<li>Odwirować próbki z odpowiednią prędkością (patrz ppkt 1.1.4). Usuń HB za pomocą pipety, uważając, aby pozostawić osad nicieni w spokoju.</li>
		<li>Dodać 100 μl przygotowanego WB do każdej próbki.</li>
		<li>Odwirować próbki z odpowiednią prędkością (patrz ppkt 1.1.4). Usuń WB za pomocą pipety, uważając, aby pozostawić granulkę w spokoju.</li>
		<li>Dodać 1 ml przygotowanego WB do każdej próbki.</li>
		<li>Próbki inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 48-56 °C w suchej łaźni (lub w mieszalniku termicznym w temperaturze 48-56 °C przy 1 200 obr./min). W przypadku inkubacji w suchej kąpieli delikatnie odwracaj probówki co 15-20 minut. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, jako standardową temperaturę prania przyjmuje się 48 °C; Jednak temperatura ta może wymagać dostosowania, jeśli występuje wysoki sygnał tła. Temperatura prania jest często o 2 °C wyższa niż temperatura hybrydyzacji.</li>
		<li>Odwirować próbki z odpowiednią prędkością (patrz krok 1.1.4). Za pomocą pipety wyjmij bufor do mycia, uważając, aby pozostawić granulkę w spokoju.</li>
		<li>Dodać 100-500 μl PBS-T do każdej z próbek. Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w PBS-T w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia, dopóki protokół nie będzie gotowy do kontynuacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj nicienie zgodnie z opisem w kroku 1.8.</li>
</ol>

<ol><li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+defense+mechanisms+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium.</a> Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).</li>
<li>Balla, K. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+intracellular+pathogen+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection.</a> Cellular Microbiology. 15 (8), 1313-1322 (2013).</li>
<li>Dimov, I., Maduro, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+intestine%3A+organogenesis%2C+digestion%2C+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology.</a> Cell and Tissue Research. 377 (3), 383-396 (2019).</li>
<li>Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apical+disposition+of+the+Caenorhabditis+elegans+intestinal+terminal+web+is+maintained+by+LET-413%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413.</a> Developmental Biology. 268 (2), 448-456 (2004).</li>
<li>Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+RAB-11+directs+polarized+exocytosis+of+the+intracellular+pathogen+N.+parisii+for+fecal-oral+transmission+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 8215-8220 (2014).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).</li>
<li>Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2736-2752 (2008).</li>
<li>Felix, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+experimental+infection+of+Caenorhabditis+nematodes+by+novel+viruses+related+to+nodaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses.</a> PLoS Biology. 9 (1), 1000586(2011).</li>
<li>Osman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+infection+of+C.+elegans+by+an+oomycete+reveals+a+new+pathogen-specific+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response.</a> Current Biology. 28 (4), 640-648 (2018).</li>
<li>Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLOS Pathogens. 12 (12), 1006093(2016).</li>
<li>Clark, L. C., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensals%2C+probiotics+and+pathogens+in+the+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Commensals, probiotics and pathogens in the Caenorhabditis elegans model.</a> Cell Microbiology. 16 (1), 27-38 (2014).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource%5BTitle%5D)+AND+%22G3.+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li>
<li>Michael, L., Markus, S., Petra, P., Holger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+approach+using+an+extended+set+of+fluorophores+to+visualize+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A multicolor fluorescence in situ hybridization approach using an extended set of fluorophores to visualize microorganisms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1383(2019).</li>
<li>Fuchs, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+the+in+situ+accessibility+of+Escherichia+coli+16S+rRNA+for+fluorescently+labeled+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64 (12), 4973-4982 (1998).</li>
<li>O'Neil, D., Glowatz, H., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+depletion+for+efficient+use+of+RNA-seq+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA depletion for efficient use of RNA-seq capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 4-19 (2013).</li>
<li>Franz, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Santeuil+and+Le+Blanc+viruses+primarily+infect+intestinal+cells+in+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Santeuil and Le Blanc viruses primarily infect intestinal cells in Caenorhabditis nematodes.</a> Virology. 448, 255-264 (2014).</li>
<li>Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+filamentation+as+a+mechanism+for+cell-to-cell+spread+within+an+animal+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial filamentation as a mechanism for cell-to-cell spread within an animal host.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).</li>
<li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Discovery of a natural microsporidian pathogen with broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS Pathogens. 12 (6), 1005724(2016).</li>
<li>Lažetić, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+The+transcription+factor+ZIP-1+promotes+resistance+to+intracellular+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">et al The transcription factor ZIP-1 promotes resistance to intracellular infection in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-16 (2022).</li>
<li>Félix, M. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+richness%2C+distribution+and+genetic+diversity+of+Caenorhabditis+nematodes+in+a+remote+tropical+rainforest%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest.</a> BMC Evolutionary Biology. 13 (1), 10(2013).</li>
<li>Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cleaning+of+wild+Caenorhabditis+nematodes+to+enrich+for+intestinal+microbiome+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Selective cleaning of wild Caenorhabditis nematodes to enrich for intestinal microbiome bacteria.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62937(2021).</li>
<li>Sowa, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+RIGI+homolog+DRH-1+mediates+the+intracellular+pathogen+response+upon+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans RIGI homolog DRH-1 mediates the intracellular pathogen response upon viral infection.</a> Journal of Virology. 94 (2), 01173(2020).</li>
<li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLOS Pathogens. 10 (6), 1004200(2014).</li>
<li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+paralogs+control+a+switch+between+growth+and+pathogen+resistance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans.</a> PLoS Pathogens. 15 (1), 1007528(2019).</li>
<li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li>
<li>Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PloS One. 14 (4), 0216011(2019).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+gateway+to+a+new+host-microbiome+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38(2016).</li>
<li>Fu, R., Gong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+linking+ribosomal+%28r%29DNA+and+rRNA+copy+numbers+to+cell+size+and+growth+rate+provides+insights+into+molecular+protistan+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology.</a> The Journal of Eukaryotic Microbiology. 64 (6), 885-896 (2017).</li>
<li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li>
<li>Cuomo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidian+genome+analysis+reveals+evolutionary+strategies+for+obligate+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Microsporidian genome analysis reveals evolutionary strategies for obligate intracellular growth.</a> Genome Research. 22 (12), 2478-2488 (2012).</li>
<li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8 (1), 14023(2017).</li>
<li>Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Dzikie C. elegans są naturalnie związane z różnymi drobnoustrojami. Naukowcy mogą wykorzystać RNA FISH do wykrywania i identyfikacji tych drobnoustrojów, a także uzyskania wglądu w ich lokalizację w kontekście całego zwierzęcia. Za pomocą tej metody można zidentyfikować drobnoustroje o pożądanych lub interesujących fenotypach, a następnie wyizolować je w celu dalszej charakterystyki i sekwencjonowania. Liczebność licznych izolatów bakteryjnych dzikich C. elegans można również określić ilościowo za pomocą RNA FISH29. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, możliwe jest również obserwowanie znanych mikroorganizmów wewnątrz ich gospodarzy i dowiedzenie się więcej o ich interakcjach. Co ważne, wirus Orsay i mikrosporydia są pasożytami obligatoryjnymi i nie mogą być hodowane niezależnie od gospodarza, dlatego FISH jest standardowym narzędziem do wizualizacji. Kolonizację lub infekcję można również określić ilościowo za pomocą RNA FISH przy użyciu nicieni hodowanych na płytkach obsianych pożądanymi bakteriami hodowlanymi. Oprócz barwienia mikroorganizmów w jelicie C. elegans, protokół ten może być stosowany w przypadku innych szczepów nicieni, takich jak C. tropicalis lub Oscheius tipulae19,23.
Główną zaletą protokołu FISH jest to, że oferuje prostą, szybką i solidną metodę barwienia drobnoustrojów związanych z C. elegans. Obrazy uzyskane w wyniku barwienia FISH mają wysoki stosunek sygnału do szumu, który osiąga się dzięki wykorzystaniu sond FISH, które celują w obfite RNA SSU w próbce. Ponieważ zazwyczaj występują 30-krotne lub wyższe poziomy rRNA niż rDNA, większość sygnału z barwienia FISH za pomocą sond, które celują w rRNA, wynika z rRNA, a nie rDNA30. Co więcej, RNA FISH umożliwia dostrzeżenie infekcji lub kolonizacji w kontekście całego zwierzęcia. Wizualizacja ta jest ułatwiona poprzez współbarwienie jąder gospodarza za pomocą DAPI i/lub użycie fluorescencyjnych szczepów C. elegans w celu lepszego podkreślenia lokalizacji infekcji lub kolonizacji w próbce. Na przykład specyficzny dla mikrosporydiów FISH wykorzystano do określenia tropizmu tkankowego Nematocida displodere przy użyciu panelu szczepów C. elegans z ekspresją GFP w różnych tkankach20. Ponadto protokół ten jest podatny na zmiany, które pozwalają badaczom określić idealne warunki odpowiednie dla ich konkretnych potrzeb (np. dostosowanie okresu utrwalania, zwiększenie temperatury hybrydyzacji).
Jednym z kluczowych kroków w protokole FISH jest naprawienie próbek. Okres inkubacji następujący po dodaniu utrwalacza jest niezbędny, aby dać czas na przenikanie czynnika do próbki. Dłuższe czasy inkubacji nie są idealne dla próbek zawierających transgeniczne białka fluorescencyjne ze względu na degradację białek przez PFA w czasie. W przypadku próbek zawierających GFP konieczne jest określenie optymalnego czasu wiązania, aby umożliwić przenikanie, przy jednoczesnym zachowaniu sygnału GFP.
FISH może być używany do barwienia bakterii, wirusów lub mikrosporydiów u C. elegans. Jednak najlepszy rodzaj środka utrwalającego stosowanego do FISH zależy od próbki i dalszych wymagań. Protokół ten przedstawia roztwór PFA jako główny środek utrwalający do barwienia bakterii i wirusów. Jednak PFA nie jest wystarczający do wizualizacji zarodników mikrosporydów, ponieważ nie może przeniknąć przez ścianę zarodników. Do wizualizacji zarodników należy zamiast tego użyć acetonu. Chociaż wiązanie PFA jest skuteczne w znakowaniu RYB innych etapów życia mikrosporydiów, w tym sporoplazm, merontów i sporontów. Inne główne różnice występują między utrwalaniem acetonu a utrwalaniem PFA; Aceton jest wygodniejszy, ponieważ próbki można szybko przechowywać w zamrażarce po dodaniu, bez konieczności mycia. Jednak aceton szybko zabija wszelkie istniejące GFP w transgenicznym gospodarzu. PFA jest preferowanym utrwalaczem, jeśli ważne jest zachowanie pewnych struktur fizjologicznych w żywicielu, ponieważ zwierzęta utrwalone acetonem wydają się być bardziej zdegradowane, co utrudnia identyfikację niektórych tkanek. Ponieważ próbki są utrwalone, ten protokół FISH nie pozwala na obrazowanie na żywo interakcji gospodarz-mikroorganizm in vivo. Jednak przebieg czasowy infekcji w pogoni za impulsem, po którym następuje barwienie próbek FISH w różnych punktach czasowych, może pozwolić dostrzec pewną dynamikę infekcji mikrobiologicznej 19,20,31.
Kolejnym krytycznym krokiem w całym protokole jest dokładne umycie próbek przed i po hybrydyzacji. Przed hybrydyzacją, podczas zbierania robaków do probówek mikrofuge, nadmiar bakterii lub innych drobnoustrojów z płytek NGM może być przenoszony z próbką robaka. Trzy mycia z PBS-T są standardem; jednak może być konieczne więcej mycia, aby wystarczająco wyeliminować zewnętrzne mikroorganizmy, zwłaszcza w przypadku stosowania silnie zanieczyszczonych, dziko izolowanych C. elegans. Podczas przeglądania zamontowanych próbek po FISH, może znajdować się jakaś szczątkowa sonda FISH, która wytwarza duże ilości sygnału w tle próbki. Temperatura prania i liczba prań są ważne, aby usunąć nadmiar i niespecyficznie związaną sondę. Aby zmniejszyć fluorescencję tła, możliwe jest wykonanie dwóch lub trzech prań z 1 ml WB co 30 minut, zamiast jednego prania z 1 ml WB przez godzinę. Różne sondy FISH mogą wymagać różnych temperatur prania. Zazwyczaj temperatura prania jest o 2 °C wyższa od temperatury hybrydyzacji, ale można ją zwiększyć, jeśli fluorescencja tła jest zbyt duża (wysoki poziom hałasu).
Protokół FISH wykorzystuje sondy fluorescencyjne zaprojektowane do celowania w specyficzne dla gatunku mikrobiologiczne RNA, ale sondy FISH mogą być zaprojektowane dla innych transkryptów o dużej liczbie kopii. Inne sondy FISH mogą mieć różne temperatury topnienia, więc etapy inkubacji mogą wymagać przeprowadzenia w wyższej lub niższej temperaturze niż opisana. Barwienie FISH może zidentyfikować przestrzenny rozkład kolonizacji mikrobiologicznej lub infekcji w organizmie gospodarza, co pozwala na scharakteryzowanie interakcji gospodarz-drobnoustrój i drobnoustroj-drobnoustroj. Jednym z ograniczeń jest to, że tylko kilka konwencjonalnych fluoroforów może być używanych jednocześnie, co zmniejsza liczbę różnych mikroorganizmów, które można wykryć za pomocą FISH w tym samym czasie. Ogranicza to jego zastosowanie do złożonych badań mikrobiomu u C. elegans. Jednak wielokolorowy FISH ukierunkowany na rRNA wykorzystuje sondy znakowane niekanonicznymi fluoroforami, które mogą zwiększyć liczbę odrębnych znaczników grup drobnoustrojów15. Innym ograniczeniem jest to, że trudno jest rozróżnić blisko spokrewnione gatunki, zwłaszcza bakterie, których sekwencje SSU są bardzo podobne. Jednak ekstremalna rozbieżność sekwencji między gatunkami mikrosporydiów pomaga ułatwić ich różnicowanie za pomocą tego protokołu (ryc. 3)32,33.
Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół FISH opisuje technikę wykrywania mikroorganizmów w obrębie C. elegans. Pozwala to naukowcom na wykorzystanie przejrzystego i genetycznie wykonalnego systemu modelowego do wykrywania i ilościowego określania kolonizacji i infekcji w kontekście nienaruszonego zwierzęcia, a także identyfikacji unikalnych zachowań mikrobiologicznych lub morfologii w obrębie gospodarza. Wersja preprintowa tego manuskryptu została zamieszczona podczas recenzji34.

Caenorhabditis elegans stał się potężnym modelowym systemem do badania odporności wrodzonej i interakcji gospodarz-mikroorganizm w komórkach nabłonka jelitowego1,2. Ze względu na przezroczyste ciało i tylko 20 komórek jelitowych, C. elegans stanowi wygodny system monitorowania procesów kolonizacji i infekcji jelit drobnoustrojów w kontekście nienaruszonego organizmu. Komórki jelitowe nicieni mają wiele morfologicznych i funkcjonalnych podobieństw z komórkami nabłonka jelitowego ssaków, co czyni je wykonalnym modelem in vivo do analizy procesów rządzących kolonizacją mikrobiomu i infekcją patogenami3,4,5,6.
Dzikie C. elegans żywią się różnymi mikrobami, które kolonizują i infekują jelita, a pobieranie próbek tych nicieni zaowocowało odkryciem wirusów, eukariontów (grzybów, lęgniowców) i bakterii, które naturalnie kojarzą się z tym gospodarzem7,8,9,10. Stwierdzono, że wirus Orsay infekuje jelito i jest obecnie jedynym znanym naturalnym wirusem C. elegans9. Mikrosporydia to związane z grzybami obligatoryjne patogeny wewnątrzkomórkowe, które są najczęściej występującą infekcją u dziko żyjących Caenorhabditis, przy czym odkryto kilka gatunków infekujących C. elegans i pokrewne nicienie8,11. Wiele bakterii jest powszechnie występujących w świetle jelit dziko żyjących C. elegans, a kilka gatunków zostało ustalonych jako naturalny model mikrobiomu C. elegans (CeMbio)6,12,13,14. Odkrycie i scharakteryzowanie drobnoustrojów, które naturalnie kolonizują i/lub infekują C. elegans, jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów genetycznych, które rządzą tymi interakcjami gospodarz-mikroorganizm, a także do wizualizacji nowych procesów mikrobiologicznych, które zachodzą tylko w kontekście nienaruszonego zwierzęcia gospodarza.
Po pobraniu próbek, dzikie nicienie są badane za pomocą mikroskopii kontrastu różnicowego (DIC) w poszukiwaniu fenotypów, które wskazują na infekcję lub kolonizację. Na przykład zmiany w stereotypowym ziarnistym wyglądzie komórek jelitowych mogą być związane z obecnością wewnątrzkomórkowego zakażenia pasożytami8. W szczególności utrata granulek jelitowych i zmniejszona lepkość cytozolowa są oznakami infekcji wirusowej, podczas gdy reorganizacja granulek jelitowych w "rowki" może wskazywać na zakażenie mikrosporydiami w rodzaju Nematocida8,9. Ze względu na to, że w próbkach dzikich C. elegans występuje wiele różnych drobnoustrojów, rozróżnienie drobnoustrojów za pomocą mikroskopii DIC może być trudne. Informacje dotyczące przestrzennego rozmieszczenia drobnoustrojów w organizmie gospodarza mogą być również trudne do wykrycia ze względu na mały rozmiar wielu drobnoustrojów15. Ponadto hodowla konkretnych drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania in vitro nie zawsze jest możliwa, co prowadzi do trudności w wykrywaniu i/lub kwantyfikacji.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) dostarcza metody fluorescencyjnego znakowania mikrobów za pomocą sond fluorescencyjnych, które wiążą się z RNA małej podjednostki rybosomalnej (SSU) w stałych komórkach. Jeśli analiza cech morfologicznych sugeruje istnienie określonej klasy drobnoustrojów, można zastosować sondy FISH, które są ukierunkowane na określone lub szerokie klasy takich drobnoustrojów. Na przykład EUB338 jest uważany za uniwersalną sondę dla bakteryjnego SSU i jest powszechnie używany do wykrywania szerokiej gamy bakterii16. Opisany tutaj protokół wykorzystuje jednoniciowe sondy DNA, które są znakowane na końcu fluoroforem i specjalnie zaprojektowane tak, aby były komplementarne do docelowego SSU interesującego drobnoustroju, chociaż dostępne są wcześniej zaprojektowane sondy16. Główną zaletą celowania w SSU drobnoustrojów jest stosunkowo duża obfitość tego RNA, który zazwyczaj stanowi 80%-90% całego RNA w komórce, co prowadzi do barwienia o bardzo wysokim stosunku sygnału do szumu17. Sondy mogą być również zaprojektowane tak, aby celować w RNA w celu wykrywania wirusów, takich jak Orsay virus9,18, które często są obecne w bardzo dużych kopiach w zainfekowanych komórkach, jeśli wirus aktywnie się replikuje.
W zależności od wyników z poznanych sond, może być konieczne uzyskanie dalszych informacji o sekwencji, aby zaprojektować bardziej szczegółowe sondy do potwierdzania gatunków in situ. Powszechnym podejściem jest użycie uniwersalnych starterów przeciwko konserwatywnym regionom SSU (16S dla bakterii i 18S dla eukariontów) w celu amplifikacji (poprzez PCR) regionów, które są bardziej rozbieżne8. Korzystając z tych informacji o sekwencji, można zaprojektować sondy o większej specyficzności gatunkowej. Te sondy FISH mogą następnie umożliwić identyfikację drobnoustrojów w sposób niezależny od kultury8. Dodatkowo, RNA FISH może dać wgląd w unikalne cechy morfologicznej kolonizacji i infekcji, w tym wzorce filamentacji lub lokalizacji tkanek19,20. Różne kolorowe sondy FISH mogą być używane jednocześnie, co pozwala na wizualne rozróżnienie drobnoustrojów w próbkach dzikich nicieni, a także obserwację dynamiki mikroorganizm-mikrob wewnątrz hosta15,20. Co więcej, barwienie RNA FISH może być stosowane w badaniach interakcji gospodarz-patogen, w których infekcja i kolonizacja znanego gatunku mogą być łatwo określone ilościowo ręcznie lub za pomocą zautomatyzowanych podejść, aby uzyskać wgląd w obciążenie patogenem, na przykład porównując mutanty C. elegans, które mają zwiększoną lub zmniejszoną odporność na infekcję21.

<table><tbody><tr><td>10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>AM9822</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11-1</td><td></td></tr><tr><td>Serum mocujące zapobiegające blaknięciu z DAPI (Vectashield)</td><td>Vectalab</td><td>NC9524612</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sondy Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>FISH (patrz Tabela 1)</td><td>LGC Biosearch Technologies</td><td></td><td>Sondy FISH zostały zakupione komercyjnie poprzez niestandardową syntezę oligonukleotydów</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P-286</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S375-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-671</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-661</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Science</td><td>50-980-487</td><td>UWAGA: PFA jest czynnikiem rakotwórczym. Odpowiednio się obchodź</td></tr><tr><td>Mikser termiczny</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-151</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjna hybrydyzacja in situ rna (fish) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach caenorhabditis elegans

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Jelita dzikich nicieni Caenorhabditis są zamieszkiwane przez różne mikroorganizmy, w tym bakterie mikrobiomu jelitowego i patogeny, takie jak mikrosporydia i wirusy. Ze względu na podobieństwa między Caenorhabditis elegans a komórkami jelitowymi ssaków, a także moc systemu C. elegans, gospodarz ten pojawił się jako system modelowy do badania interakcji jelito-mikroorganizmy gospodarza in vivo. Chociaż możliwe jest zaobserwowanie niektórych aspektów tych interakcji za pomocą mikroskopii jasnego pola, trudno jest dokładnie sklasyfikować drobnoustroje i scharakteryzować zakres kolonizacji lub infekcji bez bardziej precyzyjnych narzędzi. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) RNA może być wykorzystywana jako narzędzie do identyfikacji i wizualizacji drobnoustrojów w nicieniach żyjących na wolności lub do eksperymentalnego charakteryzowania i ilościowego określania infekcji u nicieni zakażonych drobnoustrojami w laboratorium. Sondy FISH, znakujące bardzo obfite małe podjednostki rybosomalnego RNA, wytwarzają jasny sygnał dla bakterii i komórek mikrosporydów. Sondy zaprojektowane do celowania w konserwatywne regiony rybosomalnego RNA wspólne dla wielu gatunków mogą wykrywać szeroki zakres drobnoustrojów, podczas gdy celowanie w rozbieżne regiony rybosomalnego RNA jest przydatne do węższego wykrywania. Podobnie, sondy mogą być zaprojektowane do znakowania wirusowego RNA. Przedstawiono protokół barwienia RNA FISH za pomocą utrwalania paraformaldehydu (PFA) lub acetonu. Wiązanie PFA jest idealne dla nicieni związanych z bakteriami, mikrosporydiami i wirusami, podczas gdy wiązanie acetonu jest niezbędne do wizualizacji zarodników mikrosporidów. Zwierzęta najpierw myto i utrwalano w paraformaldehydzie lub acetonie. Po utrwaleniu sondy FISH inkubowano z próbkami, aby umożliwić hybrydyzację sond do pożądanego celu. Zwierzęta zostały ponownie umyte, a następnie zbadane na szkiełkach mikroskopowych lub przy użyciu metod automatycznych. Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół FISH umożliwia wykrywanie, identyfikację i kwantyfikację drobnoustrojów zamieszkujących jelito C. elegans, w tym drobnoustrojów, dla których nie ma dostępnych narzędzi genetycznych.

W celu analizy bakterii mikrobiomu, w badaniach zwierząt izolowanych z natury wykorzystano specyficzne i uniwersalne sondy FISH skierowane przeciwko 16S bakterii. Dziki szczep Caenorhabditis tropicalis (JU1848) pobrano z lasu Nouragues w pobliżu małej rzeki w Gujanie Francuskiej, z gnijących owoców palmy22. Pod mikroskopem kontrastu interferencyjnego (DIC) stwierdzono, że szczep ten jest kolonizowany przez bakterię, która wydaje się kierunkowo przylegać do nabłonka jelitowego (Rysunek 2A). Następnie szczep JU1848 poddano selektywnemu oczyszczaniu w celu wyeliminowania innych zanieczyszczeń mikrobiologicznych i wzbogacenia populacji pożądanej bakterii przylegającej23. Przy użyciu uniwersalnej metody PCR zidentyfikowano tę bakterię jako nowy gatunek z klasy Alphaproteobacteria. Następnie zaprojektowano sondę FISH znakowaną Cal Fluor Red 610, specyficzną dla sekwencji 16S rRNA tej bakterii, aby umożliwić fluorescencyjną wizualizację kolonizacji w obrębie C. tropicalis (Rysunek 2B). Do próbki dodano również uniwersalną sondę FISH 16S rRNA zdolną do wiązania wielu gatunków bakterii (EUB338), znakowaną 6-karboksyfluoresceiną (FAM). Zielone i czerwone sygnały fluorescencji całkowicie się pokrywają, co sugeruje, że większość bakterii kolonizujących jelita to przylegające bakterie z klasy Alphaproteobacteria. Przed barwieniem zwierzęta utrwalono w PFA.
W celu analizy infekcji eksperymentalnej w laboratorium z wykorzystaniem patogenów wewnątrzkomórkowych o znanej tożsamości, zastosowano sondy FISH specyficzne dla wirusa Orsay oraz mikrosporidiów na osobnikach C. elegans o genotypie typu dzikiego. Wirus Orsay jest wirusem RNA o dodatnej polarności nici z rodziny Nodaviridae i jedynym naturalnym patogenem wirusowym występującym u C. elegans. Dwuczęściowy genom RNA wirusa Orsay składa się z segmentów RNA1 i RNA2, a dla obu tych segmentów opracowano sondy FISH (Rycyna 3A,B)9,18. W jelicie RNA wirusa jest wykrywane przez homolog RIG-I, DRH-124, który jest niezbędny do aktywacji transkrypcyjnego programu obronnego zwanego odpowiedzią na patogeny wewnątrzkomórkowe (IPR — Intracellular Pathogen Response)25,26,27. Transkrypcja przeciwwirusowych genów IPR jest co najmniej częściowo kontrolowana przez czynnik transkrypcyjny ZIP-121. Tutaj ekspresja ZIP-1::GFP jest zlokalizowana w jądrach komórek jelita, które wykazują pozytywne barwienie FISH na wirusa Orsay w cytoplazmie (Rycyna 3A)21. Przedstawiono wiele zwierząt zabarwionych specyficznym dla Orsay FISH, aby wskazać siłę tego sygnału w celu łatwej kwantyfikacji (Rycyna 3B). Zwierzęta pokazane na Rycynie 3A,B zostały utrwalone w PFA.
 pasożyt z grupy mikrosporidiów o nazwie Nematocida parisii, co oznacza „zabójca nicieni z Paryża”, jest obligatoryjnym patogenem wewnątrzkomórkowym jelit. Wykorzystywano kilka sond FISH znakujących 18S rRNA N. parisii, w tym sondy MicroA i MicroB znakowane fluorescencyjnie. Przedstawiono wiele zwierząt barwionych metodą FISH z użyciem MicroB, aby wskazać siłę tego sygnału w celu łatwej kwantyfikacji (Rycina 3C). Ponadto C. elegans jest zakażany przez inne blisko spokrewnione mikrosporidia. Współzakażenie szczepu N2 przez N. parisii oraz spokrewnionego z nim N. ausubeli można rozróżnić za pomocą tego protokołu FISH poprzez zaprojektowanie gatunkowo specyficznych sond FISH, które konkurują ze sobą o wiązanie w zróżnicowanym regionie 18S rRNA (Rycina 3D)28. W tym przykładzie sonda FISH dla N. parisii posiada idealne parowanie zasad z 18S rRNA N. parisii, ale wykazuje niedopasowanie o długości 7 bp w stosunku do 18S rRNA N. ausubeli. Odwrotna sytuacja ma miejsce w przypadku sondy dla N. ausubeli. W związku z tym każda gatunkowo specyficzna sonda FISH będzie skuteczniej wiązać się z 18S gatunku cognatywnego niż z gatunkiem niecognatywnym. Dodatkowo zastosowanie DAPI do barwienia jąder pozwala na lepszą lokalizację infekcji w kontekście całego organizmu, zwłaszcza w przypadku jelita, które posiada duże, łatwo identyfikowalne jądra. Rycina 3C,D przedstawia zwierzęta utrwalone w PFA. Późniejsze etapy infekcji N. parisii prowadzą do rozwoju merontów w zarodniki. Aby zwizualizować zarodniki N. parisii, zwierzęta muszą zostać utrwalone w acetonie, ponieważ penetruje on ścianę zarodnika lepiej niż PFA (Rycina 3E,F)8. Wynikowe barwienie FISH wykazuje małe i duże struktury pręcikowate, które prawdopodobnie odpowiadają zarodnikom N. parisii, zabarwionym na czerwono za pomocą specyficznych sond dla N. parisii.
<img alt="Schemat fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z wykorzystaniem próbek nicieni, przygotowaniem buforu i etapami inkubacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63980/63980fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Graficzna reprezentacja protokołu FISH. Utworzone za pomocą Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63980/63980fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, barwienie fluorescencyjne u nicieni, lokalizacja bakterii, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63980/63980fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Barwienie FISH dzikiego szczepu C. tropicalis JU1848 skolonizowanego przylegającymi bakteriami w jelitach. (A) Obraz Nomarski przedstawiający tysiące cienkich bakterii pręcikowych (bac) wiążących się kierunkowo z jelitem (in) JU1848, tworząc fenotyp przypominający włoski wewnątrz światła jelita (lu). Ten panel rysunku został zaadaptowany z Morgan, E. et al. (2021)23. (B) Barwienie FISH JU1848, utrwalonego w PFA, z użyciem sondy znakowanej na czerwono (b002_16S_A-CF610) zaprojektowanej do celowania w sekwencję 16S rRNA przylegającej bakterii (góra) oraz uniwersalnej sondy FISH znakowanej na zielono (EUB338-FAM) zaprojektowanej do celowania w 16S bakterii (dół). Barwienie jąder komórkowych gospodarza DAPI przedstawiono na niebiesko. Sekwencje sond znajdują się w Tabeli 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63980/63980fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna C. elegans; schemat; lokalizacja białek; analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63980/63980fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3barwienie FISH w celu wykrycia C. elegans zakażone patogenami wewnątrzkomórkowymi. (A,B) barwienie FISH w obrębie C. elegans wyrażając ZIP-1::GFP i zainfekowane wirusem Orsay, które przed barwieniem utrwalono za pomocą PFA, aby zachować sygnał GFP. Do barwienia patogenu wykorzystano sondy Orsay 1 Red oraz Orsay 2 Red. (AObraz kompozytowy składa się z nałożonych na siebie kanałów fluorescencji czerwonej i zielonej. Ekspresja jądrowa ZIP-1::GFP jest indukowana po zakażeniu wirusem Orsay i przedstawiona jest w kolorze zielonym. Autofluorescencja ziarnistości jelitowych widoczna jest w kolorze żółtym i wskazana żółtymi strzałkami. Linie przerywane obrysowują ciało nicienia. Pasek skali = 25 µm. (BObraz kompozytowy składa się z nałożonych na siebie kanałów fluorescencji czerwonej oraz DIC. Pasek skali = 200 µm. (C,D) Barwienie FISH typu dzikiego C. elegans zakażone mikrosporidiami utrwalonymi w PFA. (C) Barwienie FISH typu dzikiego C. elegans zakażony N. parisii i utrwalono w PFA. Do barwienia patogenów użyto sondy MicroB-CF610. Obraz kompozytowy składa się z nałożonych na siebie kanałów fluorescencji czerwonej oraz DIC. Pasek skali = 100 µm. (D) Barwienie FISH typu dzikiego C. elegans z coinfekcją *N. parisii* i *N. ausubeli* w jelicie. Oba patogeny poddano jednoczesnemu barwieniu z użyciem pary specyficznych sond FISH, które konkurują o wiązanie z tym samym regionem 18S rRNA. *N. parisii* zbarwiono przy użyciu MicroF-CF610 (czerwony) oraz N. ausubeli zbarwiono przy użyciu MicroSp1A-FAM (zielony). Barwienie jąder komórkowych gospodarza DAPI widoczne jest na niebiesko. Pasek skali = 25 µm. (E) Barwienie FISH z zastosowaniem typu dzikiego utrwalonego acetonem C. elegans zakażone N. parisii zarodniki. Do barwienia użyto MicroA-CF610 (czerwony). Pasek skali = 15 µm. (FObraz w kontraście Nomarskiego przedstawiający *N. parisii* widoczne zarodniki w (E). Pasek skali = 15 µmW (E) i (F), małe i duże struktury w kształcie pręcików są oznaczone odpowiednio małymi i dużymi strzałkami, które odpowiadają zarodnikom N. parisii. Patrz Tabela 1 dla sekwencji sond. Obraz przedstawiony w (A) opracowano na podstawie Lažetić, V. i wsp. (2022)21Obrazy przedstawione w (B) i (C) zostały opracowane na podstawie pracy Reddy, K. C. et al. (2019)26Obrazy przedstawione w (E) i (F) zostały opracowane na podstawie pracy Troemel, E. R. et al. (2008)8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63980/63980fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa sondy</td>
			<td>Specyficzność sondy</td>
			<td>Fluorofor sondy</td>
			<td>Sekwencja sondy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EUB338-FAM</td>
			<td>Bakteryjne 16S (uniwersalne)</td>
			<td>5' 6-fluoresceina (FAM)</td>
			<td>GCTGCCTCCCGTAGGAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b002_16S_A-CF610</td>
			<td>16S Alphaproteobacteria</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>TGTACCGACCCTTAACGTTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orsay1 Red</td>
			<td>RNA1 wirusa Orsay</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>GACATATGTGATGCCGAGAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orsay2 Red</td>
			<td>RNA2 wirusa Orsay</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>GTAGTGTCATTGTAGGCAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroA-CF610</td>
			<td>*Nematocida parisii* 18S</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>CTCTGTCCATCCTCGGCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB-CF610</td>
			<td>Nematocida parisii 18S</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroF-CF610</td>
			<td>Nematocida parisii 18S</td>
			<td>Cal Fluor Red 610 (CF610)</td>
			<td>AGACAAATCAGTCCACGAATT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSp1A-FAM</td>
			<td>Nematocida ausubeli 18S</td>
			<td>5' 6-fluoresceina (FAM)</td>
			<td>CAGGTCACCCCACGTGCT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista sekwencji sond FISH. Wszystkie sondy FISH zostały zakupione komercyjnie z fluoroforem przyłączonym do końca 5' (poprzez niestandardową syntezę oligonukleotydów; patrz Tabela materiałów), a oligonukleotydy zostały oczyszczone metodą HPLC w odwróconej fazie.

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Barwienie RNA FISH jest przydatne do wizualizacji, identyfikacji i kwantyfikacji drobnoustrojów, które naturalnie kolonizują lub infekują C. elegans, w tym bakterii mikrobiomu i patogenów wewnątrzkomórkowych. Ta technika jest prosta, szybka i solidna, co pozwala skutecznie barwić i wizualizować drobnoustroje w kontekście całego nienaruszonego zwierzęcia. Możemy użyć RNA FISH do wykrywania i wizualizacji bakterii mikrobiomu jelitowego u dzikich C.elegans.Może to pomóc nam zrozumieć porównywalne interakcje w systemach ssaków. Po przeniesieniu nicieni z pożądanym drobnoustrojem będącym przedmiotem zainteresowania, z płytek NGM do probówek mikrowirówek, umyj nicienie, dodając jeden mililitr 1X PBST do probówek do mikrofuge. Odwiruj próbki w mikrowirówce lub Nanofuge z odpowiednią prędkością.Za pomocą pipety usunąć wszystkie z wyjątkiem 100 mikrolitrów supernatantu. Powtórz mycie PBST dwa do trzech razy. Aby utrwalić nicienie za pomocą paraformaldehydu, zacznij od dodania 33 mikrolitrów 16% paraformaldehydu do probówki do mikrorurki zawierającej 100 mikrolitrów supernatantu nad granulką nicienia, aby uzyskać końcowe stężenie 4% paraformaldehydu.Próbki zawierające nicienie skolonizowane lub zakażone drobnoustrojem należy inkubować przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór paraformaldehydu i dodaj 0,5 mililitra PBST do próbek. Odwirować próbki w mikrowirówce z odpowiednią prędkością, jak podano w manuskrypcie.Za pomocą pipety usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu. Dodaj 0,5 mililitra PBST do próbek w probówkach do mikrofuge. Powtórz mycie PBST dwa do trzech razy.Po ostatnim przepłukaniu odwirować próbki i usunąć supernatant, pozostawiając osad w nienaruszonym stanie. Następnie przygotuj jeden mililitr buforu hybrydyzacyjnego na próbkę. Dodaj 800 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego do probówek do mikrofuge zawierających osad nicieni.Osadzać próbki w mikrowirówce. Usunąć supernatant bez naruszania osadu. Przygotować 100 mikrolitrów na próbkę buforu hybrydyzacyjnego z żądaną sondą FISH do końcowego stężenia od 5 do 10 nanogramów na sondę mikrolitrów i wirować do wymieszania.Do każdej próbki dodać 100 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego zawierającego sondę FISH. Wymieszaj, delikatnie przesuwając lub odwracając rurki. Próbki należy inkubować przez noc w suchej łaźni w temperaturze od 46 do 54 stopni Celsjusza lub w mieszalniku termicznym w temperaturze od 46 do 54 stopni Celsjusza przy 1 200 obrotach na minutę.Przygotować trzy mililitry buforu do przemywania na próbkę. Odwirować próbki z odpowiednią prędkością. Usuń bufor hybrydyzacyjny za pomocą pipety, uważając, aby pozostawić osad nicieni w spokoju.Dodać jeden mililitr przygotowanego buforu do przemywania do każdej próbki. Odwirować próbki z odpowiednią prędkością. Usunąć bufor do płukania za pomocą pipety, uważając, aby pozostawić osad w spokoju.Dodać jeden mililitr przygotowanego buforu do przemywania do każdej próbki. Inkubować próbki przez godzinę w temperaturze od 48 do 56 stopni Celsjusza w suchej łaźni lub mieszalniku termicznym w temperaturze od 48 do 56 stopni Celsjusza przy 1 200 obrotach na minutę. W przypadku inkubacji w suchej kąpieli delikatnie odwracaj probówki co 15 do 20 minut.Odwirować próbki z odpowiednią prędkością. Za pomocą pipety wyjmij bufor do mycia, uważając, aby pozostawić granulkę w spokoju. Dodać od 100 do 500 mikrolitrów PBST do każdej z próbek.W tym momencie próbki mogą być przechowywane w PBST w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia, aż protokół będzie gotowy do kontynuacji. Granulować próbki z odpowiednią prędkością. Usuń jak najwięcej PBST, nie naruszając osadu nicieni.Do próbek dodać 20 mikrolitrów podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu z DAPI. Załadować pipeter o pojemności 20 mikrolitrów końcówką pipety o pojemności 200 mikrolitrów i za pomocą nożyczek odciąć końcówkę pipety, aby umożliwić pipetowanie większych nicieni. Za pomocą przeciętej końcówki pipety przenieś od 5 do 10 mikrolitrów granulki na szkiełko mikroskopowe.Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 na 22. Aby przechowywać szkiełka, uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i przechowuj je w ciemnym pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do dalszego użycia. Pod mikroskopem kontrastowym z interferencją różnicową stwierdzono, że dziki szczep Caenorhabditis tropicalis jest skolonizowany bakterią, która wydaje się kierunkowo przylegać do nabłonka jelitowego.Sygnał fluorescencyjny z zielonej uniwersalnej sondy 16S rRNA i czerwonej sondy gatunków Alphaproteobacteria całkowicie się pokrywają, co sugeruje, że większość bakterii kolonizujących jelita to przylegające bakterie Alphaproteobacteria. Dwudzielny genom RNA wirusa Orsay składa się z segmentów RNA1 i RNA2 i opracowano sondy FISH ukierunkowane na oba segmenty. Białko ZIP1 oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym jest zlokalizowane w jądrach jelitowych komórek, które wykazują dodatnie barwienie wirusem Orsay FISH w cytoplazmie.Pokazano, że wiele zwierząt barwionych FISH specyficznym dla Orsaya lub N.parisii wskazuje siłę tego sygnału w celu łatwej kwantyfikacji. Jednoczesne zakażenie C.elegans dwoma pasożytami mikrosporydiów za pomocą specyficznych dla gatunku sond, które konkurują o wiązanie z 18S, zastosowanie DAPI do barwienia jąder pozwala na lepszą lokalizację infekcji w kontekście całego zwierzęcia, szczególnie w jelicie, które ma duże, łatwe do zidentyfikowania jądra. Zakażenia N. parisii powodują rozwój merontów w zarodniki.Uzyskane barwienie FISH pokazuje małe i duże struktury w kształcie pręcików, które prawdopodobnie odpowiadają zarodnikom N.parisii, które są barwione na czerwono za pomocą sond specyficznych dla N. parisii. Przy doborze utrwalacza należy pamiętać, że wiązanie PFA pozwala na lepsze zachowanie morfologii i transgenicznego GFP, ale wiązanie acetonu jest konieczne do wizualizacji sporoplazm. RNA FISH może być używany do identyfikacji i wizualizacji bakterii kolonizujących jelita C.elegans.Naukowcy mogą następnie przeprowadzić więcej genetycznych badań przesiewowych, aby zidentyfikować czynniki zaangażowane w te interakcje gospodarz-mikroorganizm.

rna-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-visualize-microbial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Aby zbadać mutualizm między bakteriami Xenorhabdus a nicieniami Steinernema, opracowano metody monitorowania obecności i lokalizacji bakterii wewnątrz nicieni. Podejście eksperymentalne, które można zastosować w innych systemach, polega na zmodyfikowaniu bakterii w celu ekspresji zielonego białka fluorescencyjnego oraz wizualizacji bakterii wewnątrz przezroczystego nicienia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wizualizacja bakterii w nicieniach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Źródło: Ng, K. M., Tropini, C. Wizualizacja interakcji mikrobioty jelitowej z gospodarzem za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ , barwienia lektynowego oraz obrazowania. J. Vis. Exp. (2021).Ten film demonstruje procedurę hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) w celu barwienia mikrobioty jelitowej w tkance jelitowej myszy poprzez hybrydyzację fluorescencyjnych sond do bakteryjnego rRNA (rybosomalnego kwasu rybonukleinowego) oraz przeciwbarwienie struktur gospodarza do analizy...

Fluorescencja in situ Hybrydyzacja bakterii jelitowych w przekrojach jelit myszy

Źródło: Flores, E. i inni. Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji pokarmowych u larw danio danio. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę ustalania modelu bakteryjnego zakażenia jelit przenoszonego przez żywność u larw danio pręgowanego poprzez karmienie ich paramecjami zakażonymi fluorescencyjnym E. coli.

Modelowanie infekcji jelit u larw danio pręgowanego przy użyciu bakterii przenoszonych przez żywność

Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

W tym artykule demonstrujemy obrazowanie na żywo poszczególnych robaków za pomocą niestandardowego urządzenia mikroprzepływowego. W urządzeniu wiele robaków jest indywidualnie zamkniętych w oddzielnych komorach, co pozwala na wielokrotny nadzór podłużny nad różnymi procesami biologicznymi.

Platforma mikroprzepływowa do obrazowania podłużnego u Caenorhabditis elegans

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Poznaj metodę RNA FISH do wizualizacji kolonizacji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans. Technika ta umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen w modelu nicienia.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów