Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans
27 lipca 2022
Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.
Barwienie RNA FISH jest przydatne do wizualizacji, identyfikacji i kwantyfikacji drobnoustrojów, które naturalnie kolonizują lub infekują C. elegans, w tym bakterii mikrobiomu i patogenów wewnątrzkomórkowych. Ta technika jest prosta, szybka i solidna, co pozwala skutecznie barwić i wizualizować drobnoustroje w kontekście całego nienaruszonego zwierzęcia. Możemy użyć RNA FISH do wykrywania i wizualizacji bakterii mikrobiomu jelitowego u dzikich C.elegans.
Może to pomóc nam zrozumieć porównywalne interakcje w systemach ssaków. Po przeniesieniu nicieni z pożądanym drobnoustrojem będącym przedmiotem zainteresowania, z płytek NGM do probówek mikrowirówek, umyj nicienie, dodając jeden mililitr 1X PBST do probówek do mikrofuge. Odwiruj próbki w mikrowirówce lub Nanofuge z odpowiednią prędkością.
Za pomocą pipety usunąć wszystkie z wyjątkiem 100 mikrolitrów supernatantu. Powtórz mycie PBST dwa do trzech razy. Aby utrwalić nicienie za pomocą paraformaldehydu, zacznij od dodania 33 mikrolitrów 16% paraformaldehydu do probówki do mikrorurki zawierającej 100 mikrolitrów supernatantu nad granulką nicienia, aby uzyskać końcowe stężenie 4% paraformaldehydu.
Próbki zawierające nicienie skolonizowane lub zakażone drobnoustrojem należy inkubować przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór paraformaldehydu i dodaj 0,5 mililitra PBST do próbek. Odwirować próbki w mikrowirówce z odpowiednią prędkością, jak podano w manuskrypcie.
Za pomocą pipety usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu. Dodaj 0,5 mililitra PBST do próbek w probówkach do mikrofuge. Powtórz mycie PBST dwa do trzech razy.
Po ostatnim przepłukaniu odwirować próbki i usunąć supernatant, pozostawiając osad w nienaruszonym stanie. Następnie przygotuj jeden mililitr buforu hybrydyzacyjnego na próbkę. Dodaj 800 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego do probówek do mikrofuge zawierających osad nicieni.
Osadzać próbki w mikrowirówce. Usunąć supernatant bez naruszania osadu. Przygotować 100 mikrolitrów na próbkę buforu hybrydyzacyjnego z żądaną sondą FISH do końcowego stężenia od 5 do 10 nanogramów na sondę mikrolitrów i wirować do wymieszania.
Do każdej próbki dodać 100 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego zawierającego sondę FISH. Wymieszaj, delikatnie przesuwając lub odwracając rurki. Próbki należy inkubować przez noc w suchej łaźni w temperaturze od 46 do 54 stopni Celsjusza lub w mieszalniku termicznym w temperaturze od 46 do 54 stopni Celsjusza przy 1 200 obrotach na minutę.
Przygotować trzy mililitry buforu do przemywania na próbkę. Odwirować próbki z odpowiednią prędkością. Usuń bufor hybrydyzacyjny za pomocą pipety, uważając, aby pozostawić osad nicieni w spokoju.
Dodać jeden mililitr przygotowanego buforu do przemywania do każdej próbki. Odwirować próbki z odpowiednią prędkością. Usunąć bufor do płukania za pomocą pipety, uważając, aby pozostawić osad w spokoju.
Dodać jeden mililitr przygotowanego buforu do przemywania do każdej próbki. Inkubować próbki przez godzinę w temperaturze od 48 do 56 stopni Celsjusza w suchej łaźni lub mieszalniku termicznym w temperaturze od 48 do 56 stopni Celsjusza przy 1 200 obrotach na minutę. W przypadku inkubacji w suchej kąpieli delikatnie odwracaj probówki co 15 do 20 minut.
Odwirować próbki z odpowiednią prędkością. Za pomocą pipety wyjmij bufor do mycia, uważając, aby pozostawić granulkę w spokoju. Dodać od 100 do 500 mikrolitrów PBST do każdej z próbek.
W tym momencie próbki mogą być przechowywane w PBST w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia, aż protokół będzie gotowy do kontynuacji. Granulować próbki z odpowiednią prędkością. Usuń jak najwięcej PBST, nie naruszając osadu nicieni.
Do próbek dodać 20 mikrolitrów podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu z DAPI. Załadować pipeter o pojemności 20 mikrolitrów końcówką pipety o pojemności 200 mikrolitrów i za pomocą nożyczek odciąć końcówkę pipety, aby umożliwić pipetowanie większych nicieni. Za pomocą przeciętej końcówki pipety przenieś od 5 do 10 mikrolitrów granulki na szkiełko mikroskopowe.
Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 na 22. Aby przechowywać szkiełka, uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i przechowuj je w ciemnym pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do dalszego użycia. Pod mikroskopem kontrastowym z interferencją różnicową stwierdzono, że dziki szczep Caenorhabditis tropicalis jest skolonizowany bakterią, która wydaje się kierunkowo przylegać do nabłonka jelitowego.
Sygnał fluorescencyjny z zielonej uniwersalnej sondy 16S rRNA i czerwonej sondy gatunków Alphaproteobacteria całkowicie się pokrywają, co sugeruje, że większość bakterii kolonizujących jelita to przylegające bakterie Alphaproteobacteria. Dwudzielny genom RNA wirusa Orsay składa się z segmentów RNA1 i RNA2 i opracowano sondy FISH ukierunkowane na oba segmenty. Białko ZIP1 oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym jest zlokalizowane w jądrach jelitowych komórek, które wykazują dodatnie barwienie wirusem Orsay FISH w cytoplazmie.
Pokazano, że wiele zwierząt barwionych FISH specyficznym dla Orsaya lub N.parisii wskazuje siłę tego sygnału w celu łatwej kwantyfikacji. Jednoczesne zakażenie C.elegans dwoma pasożytami mikrosporydiów za pomocą specyficznych dla gatunku sond, które konkurują o wiązanie z 18S, zastosowanie DAPI do barwienia jąder pozwala na lepszą lokalizację infekcji w kontekście całego zwierzęcia, szczególnie w jelicie, które ma duże, łatwe do zidentyfikowania jądra. Zakażenia N. parisii powodują rozwój merontów w zarodniki.
Uzyskane barwienie FISH pokazuje małe i duże struktury w kształcie pręcików, które prawdopodobnie odpowiadają zarodnikom N.parisii, które są barwione na czerwono za pomocą sond specyficznych dla N. parisii. Przy doborze utrwalacza należy pamiętać, że wiązanie PFA pozwala na lepsze zachowanie morfologii i transgenicznego GFP, ale wiązanie acetonu jest konieczne do wizualizacji sporoplazm. RNA FISH może być używany do identyfikacji i wizualizacji bakterii kolonizujących jelita C.elegans.
Naukowcy mogą następnie przeprowadzić więcej genetycznych badań przesiewowych, aby zidentyfikować czynniki zaangażowane w te interakcje gospodarz-mikroorganizm.
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół wykrywania i kwantyfikacji mikroorganizmów kolonizujących i infekujących C. elegans, w tym bakterii oraz patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak wirus Orsay. Metoda wykorzystuje barwienie RNA FISH w celu wizualizacji i kwantyfikacji w całych nicieniach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Neuronauka
- Interakcje z patogenami
Wprowadzenie
- Mikroby jelitowe odgrywają kluczową rolę w zdrowiu C. elegans.
- Zrozumienie oddziaływań między gospodarzem a mikrobami może dostarczyć wiedzy na temat podobnych procesów u ssaków.
- RNA FISH jest potężną techniką badania kolonizacji mikrobiologicznej.
- Patogeny, takie jak wirus Orsay i mikrosporidia, mogą znacząco wpływać na biologię nicieni.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu wykrywania i ilościowego oznaczania infekcji mikrobiologicznych u C. elegans.
- Pogłębienie wiedzy na temat oddziaływań mikrobiologicznych w jelicie nicieni.
- Umożliwienie dalszych badań genetycznych nad dynamiką relacji gospodarz-mikrob.
Zastosowane metody
- Barwienie RNA FISH w celu wizualizacji drobnoustrojów.
- Przemywanie i utrwalanie nicieni za pomocą paraformaldehydu.
- Hybrydyzacja ze specyficznymi sondami FISH w celu celowanej detekcji.
- Analiza mikroskopowa w celu oceny kolonizacji i infekcji drobnoustrojowej.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja bakterii mikrobiomu jelitowego u dzikich C. elegans.
- Identyfikacja konkretnych patogenów przy użyciu sond FISH.
- Ilościowe oznaczenie ładunku patogenów w zainfekowanych nicieniach.
- Wgląd w morfologię i lokalizację infekcji.
Wnioski
- Metoda RNA FISH jest skuteczna w badaniu interakcji mikrobiologicznych u C. elegans.
- Protokół ten umożliwia szczegółową analizę kolonizacji jelit oraz dynamiki patogenów.
- Wyniki mogą stanowić podstawę przyszłych badań nad interakcjami gospodarz-mikrob u innych organizmów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda RNA FISH umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację kolonizacji oraz infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans, stanowiąc solidny model do badania interakcji gospodarz-mikrob istotnych dla systemów ssaków. Podejście to wspiera wczesne etapy odkryć poprzez wyjaśnienie dynamiki mikrobiologicznej w organizmie podatnym na manipulacje genetyczne, co dostarcza informacji dla badań translacyjnych oraz pozwala naBniżenie ryzyka mechanistycznego w przypadku terapii celowanych w mikrobiom. Zdolność tej metody do wykrywania różnorodnych mikroorganizmów, w tym tych pozbawionych narzędzi genetycznych, zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze modeli przedklinicznych i walidacji celów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną walidację kolonizacji mikrobiologicznej i infekcji w kontekście całego organizmu.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez rozróżnienie między interakcjami komensalnymi a patogennymi.
- Ułatwia badanie ścieżek zależności gospodarz-mikrob istotnych dla zdrowia ludzi w oparciu o postawione hipotezy.
- Stanowi platformę do przesiewów genetycznych w celu zidentyfikowania czynników gospodarza wpływających na dynamikę mikrobiologiczną.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, ilościowe odczyty obciążenia mikrobiologicznego i lokalizacji drobnoustrojów w nienaruszonych organizmach.
- Umożliwia powtarzalną detekcję bakterii, mikrosporydiów i wirusów przy użyciu sond gatunkowo specyficznych lub o szerokim zakresie.
- Wspiera skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy dla różnych celów mikrobiologicznych.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy związków chemicznych lub przesiewowych badań genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie zakażenia i kolonizacji jelit in vivo.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po przedkliniczną walidację oddziaływań między gospodarzem a mikroorganizmami.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez kwantyfikację dynamiki zakażenia i odpowiedzi gospodarza.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez wizualizację lokalizacji i stopnia nasilenia zakażenia.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół RNA FISH wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów oraz ilościową ocenę kolonizacji mikrobiologicznej u C. elegans. Jest on przeznaczony do stosowania w procesach wczesnego odkrywania, opracowywania testów oraz w ramach badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wizualizację oddziaływań gospodarz-mikrob in vivo.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki w zakresie detekcji mikrobów oraz oceny stopnia infekcji.
- Analityka: Umożliwia bezpośredni pomiar i porównanie kolonizacji mikrobialnej w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia w organizmach modelowych z systemami ssaków, wykorzystując konserwatywną biologię jelit.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do detekcji różnorodnych mikrobów bez konieczności stosowania modyfikacji genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad interakcjami gospodarz-mikrob.
- Wartość operacyjna: Dostarcza standaryzowane, skalowalne i powtarzalne schematy postępowania w zakresie wizualizacji mikroorganizmów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka w odniesieniu do celów związanych z mikrobiomem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów ukierunkowanych na mikrobiom.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie projektowania sond RNA FISH oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do odczynników utrwalających (PFA, aceton) oraz infrastruktury obrazowej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie doboru sond i protokołów obrazowania.
- Możliwość dostosowania do różnych celów mikrobiologicznych poprzez modyfikację specyficzności sond.
- Ograniczona koniecznością starannego doboru metody utrwalania w zależności od rodzaju mikroba i pożądanej zachowawczości morfologicznej.
