Name: Test dla Przyczepność i Invasion Agar w S. cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Poznaj test przyczepności i inwazji w agarze u Saccharomyces cerevisiae. Ta metoda pozwala ocenić fenotyp inwazyjny drożdży i wpływ czynników środowiskowych na ich różnicowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Lisa Schneper i Katrin Duevel ich wgląd w rozwój tego testu.

<ol><li> Umieść 200ul kultur rosnących odsetek od syntetycznych mediów płytkach z wymaganych warunków głodu (SC z 2% glukozy w porównaniu z SC z 0,2% glukozy, na przykład) Jeżeli gęstość kultur różnią się zbytnio od siebie, zmienić liczbę komórek na kulturę 200ul więc każda kropla jest w przybliżeniu taką samą ilość komórek. </li><li> Upewnij się, że do prowadzenia ewidencji, które spadku na płytach, które jest kultura. </li><li> Przechowywać uchylone wieko płyty i pozostawić albo w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 30 ° C, aż krople są suche. </li><li> Płyty Seal z parafilmie i folią (opcjonalne) i pozostawić w temperaturze 30 ° C przez 3-7 dni. </li><li> Dokument wzrost komórek na płytkach (przez skanowanie, biorąc obrazu cyfrowego, itp.) </li><li> Przemyć komórki z powierzchni agaru z wodą pod wysokim ciśnieniem (najlepiej wody DI) przez około minutę dbanie o agar nie do zniesienia i zmiany orientacji. </li><li> Pozbyć się nadmiaru wody, wybierając płyty na ręczniki papierowe i pozostawiając je otwarte do wyschnięcia. </li><li> Gdy płyty są suche przyczepność dokument na każdej płytce (przez skanowanie lub robienie cyfrowych zdjęć) </li><li> Z palec w rękawiczce, delikatnie zetrzeć komórki tworzą na powierzchni agaru pod bieżącą wodą przez około minutę. </li><li> Wysuszyć płytki jak wcześniej. </li><li> Jeśli korzystasz z zakresu prosektorium, usunąć igłę przed umieszczeniem płyty na platformę mikroskopem. </li><li> Inwazja dokumentu w powiększeniu 10x lub 40x. Upewnij się, że koncentrują się na środkowej części każdego okręgu, do krawędzi będą zbyt zatłoczone, aby zobaczyć poszczególne morfologii komórek. Krawędzie mogą wskazywać poziom nitkowatych wzrostu i może być udokumentowane w przyszłości. Skanowanie lub biorąc cyfrowy obraz całego tabliczka może być również pomocne. </li></ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+in+the+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology+International%22%5BJournal%5D)">Biofilms in the food industry.</a> Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).</li>
<li>Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+structure+and+biomass+in+developing+drinking+water+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms.</a> Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).</li>
<li>Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biofilm+enhanced+miniature+microbial+fuel+cell+using+Shewanella+oneidensis+DSP10+and+oxygen+reduction+cathodes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes.</a> Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).</li>
<li>Kim, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+structure%2C+compartmentalization+and+activity+in+a+microbial+fuel+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell.</a> J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).</li>
<li>Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electricity+generation+and+microbial+community+analysis+of+alcohol+powered+microbial+fuel+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour+Technol%22%5BJournal%5D)">Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells.</a> Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).</li>
<li>Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+for+biofilm-based+microbial+fuel+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">A computational model for biofilm-based microbial fuel cells.</a> Water Res. 41, 2921-2940 (2007).</li>
<li>Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+implications+in+bioremediation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: implications in bioremediation.</a> Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).</li>
<li>Cullen, P. J., Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+depletion+causes+haploid+invasive+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).</li>
<li>Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unipolar+cell+divisions+in+the+yeast+S.+cerevisiae+lead+to+filamentous+growth%3A+regulation+by+starvation+and+RAS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS.</a> Cell. 68, 1077-1090 (1992).</li>
<li>Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+biofilm%3A+a+fungal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How to build a biofilm: a fungal perspective.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).</li>
<li>Reynolds, T. B., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bakers%27+yeast%2C+a+model+for+fungal+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation.</a> Science. 291, 878-881 (2001).</li>
<li>Verstrepen, K. J., Klis, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flocculation%2C+adhesion+and+biofilm+formation+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts.</a> Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).</li>
<li>Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+the+yeast+pheromone+response+pathway+required+for+filamentous+growth+of+diploids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids.</a> Science. 262, 1741-1744 (1993).</li>
<li>Madhani, H. D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+filamentous+differentiation+and+virulence+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The control of filamentous differentiation and virulence in fungi.</a> Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).</li>
<li>Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+the+Ras2p-controlled+mitogen-activated+protein+kinase+and+cAMP+pathways+during+invasive+growth+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).</li>
<li>Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras2+signals+via+the+Cdc42%2FSte20%2Fmitogen-activated+protein+kinase+module+to+induce+filamentous+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).</li>
<li>Pan, X., Heitman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-dependent+protein+kinase+regulates+pseudohyphal+differentiation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).</li>
<li>Roberts, R. L., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+a+single+MAP+kinase+cascade+in+Saccharomyces+cerevisiae+mediate+two+developmental+programs+in+the+same+cell+type%3A+mating+and+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth.</a> Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).</li>
<li>Robertson, L. S., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+yeast+A+kinases+have+specific+signaling+functions+in+pseudohyphal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).</li>
<li>Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mat+formation+in+Saccharomyces+cerevisiae+requires+nutrient+and+pH+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients.</a> Eukaryot Cell. , (2007).</li>
</ol>

Drożdże wyświetlania różnych rodzajów zróżnicowania w zależności od składników odżywczych dostępności i warunków środowiskowych, w tym formowanie sporów w warunkach głodu i stresu, filamentacji w różnych substancji odżywczych podkreśla i flokulacji. Różne drożdży, w tym S. cerevisiae i C. albicans, można znaleźć również w biofilm utworzony przez zestaw różnorodnych mikroorganizmów. Choć istnieje pewna korelacja z filamentacji i zachowania inwazyjne, nie jest jasne, jak dokładnie filamentacji może spowodować inwazję i kolonizację powierzchni...

<table><tbody><tr><td>Moticam 350</td><td>Kamera</td><td>Motic</td><td>wycofany z produkcji (nowy model: Moticam 352)</td><td>Stosunkowo tania kamera, którą mocuje się do okularów mikroskopu w celu rejestracji obrazów cyfrowych na komputer PC lub Mac.</td></tr></tbody></table>

test dla przyczepność i invasion agar w s. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Drożdże są na naturalnych biofilmu, gdzie wielu mikroorganizmów kolonizacji powierzchni. W sztucznych warunkach, takich jak powierzchnie obiekty stworzone przez człowieka, biofilmu może zmniejszyć wydajności przemysłu, zniszczyć struktury i zagrażają ludzkiemu życiu. 03/01 Z drugiej strony, wykorzystanie mocy biofilmu może pomóc czyste środowisko oraz zrównoważony energii. 08/04 Możliwość S. cerevisiae do kolonizacji powierzchni i uczestniczą w złożonych biofilm był zazwyczaj ignorowane aż do ponownego odkrycia programów zróżnicowanie wywołane przez różne szlaki sygnałowe i wskazówki dla środowiska w tym organizmie. 9, 10 nadal zainteresowanie wykorzystaniem S. cerevisiae jako organizm modelowy do zrozumienia interakcji i zbieżności ścieżek sygnałowych, takich jak Ras-PKA, Kss1 MAPK i Hog1 osmolarności ścieżek, szybko umieścić S. cerevisiae w zbiegu biofilmu biologii i badaniach transdukcji sygnału. 20/11 W tym celu różnicowania komórek drożdży w długie, klej, nici pseudohyphal stał się wygodny odczyt do aktywacji szlaków transdukcji sygnału na różne zmiany w środowisku. Jednak filamentacji jest złożonym kolekcji fenotypów, co sprawia, oznaczanie to tak, jakby był prosty fenotyp mylące. W ciągu ostatniej dekady, kilka testów udało się przyjąć od bakteryjnego biofilmu badań do badań drożdże, takie jak testy formacji MAT do pomiaru rozprzestrzeniania kolonii w miękkim agarze i barwienia fioletem krystalicznym ilościowego pomiaru powierzchni komórek przestrzegania. 12, 21 Jednak nie było pewne zamieszanie w testach opracowanych do jakościowo ocenić kleju i inwazyjne fenotypy drożdży w agar. Poniżej przedstawiamy proste i niezawodne metody oceny kleju i inwazyjne jakości szczepy drożdży z łatwym do zrozumienia kroki w celu odizolowania oceny przyczepności z oceny inwazji. Nasze metody, przyjęte z poprzednich badań, 10, 16 dotyczy komórek rosnących w ciekłych i poszycia na różnicy odżywczych warunków dla wzrostu dużych punktów, które następnie zmyć wodą w celu oceny przyczepności i pocierać komórek całkowicie z powierzchni agaru ocenić inwazję agar. Eliminujemy potrzebę smug komórek na agar, co wpływa na inwazję komórek w agar. Ogólnie rzecz biorąc, zauważyliśmy, że haploidalnych szczepów, które atakują agar zawsze kleju, ale nie wszystkie szczepy kleju można najechać agarze. Nasze podejście może być stosowany w połączeniu z innymi testy dokładnie przeanalizujemy kroki różnicowania i wymagania transdukcji sygnału drożdży, różnicowanie, wykrywania kworum, a tworzenie biofilmu.

Opisujemy to test na przyczepność drożdży i inwazji agar jako miara zróżnicowania inwazyjne i pseudohyphal. Ten prosty test może być wykorzystane do oceny inwazyjnym fenotypem różnych mutantów, jak również wpływu na środowisko pamięci i szlaków sygnałowych różnicowania drożdży.

Test dla Przyczepność i Invasion Agar w S. cerevisiae

Drożdże występują w naturalnych biofilmach, w których powierzchnie są kolonizowane przez wiele mikroorganizmów. W środowiskach sztucznych, takich jak powierzchnie obiektów wytworzonych przez człowieka, ...

Pobrać 200 µL badanego hodowli i nanieść ją na płytkę. Zazwyczaj można zmieścić do sześciu próbek na jednej płytce, a następnie pozostawić ją otwartą do wyschnięcia. Przedstawione są dwie płytki.W jednej z nich znajduje się pleśń, ale nie ma to znaczenia, ponieważ nie wpływa to na nasz eksperyment. Jedna z nich znajduje się w podłożu kompletnym, a druga w podłożu z niską zawartością glukozy. Zbadamy zatem adhezję i inwazję, aby sprawdzić, czy występują różnice.Wystarczy w ten sposób wyjąć płytkę. Można zauważyć wzrost kultur. Przystąpię teraz do płukania.Pod świdrem widać pęcherzyki powietrza, co wynika z dostania się wody pod świder; jest to dopuszczalne, o ile świder nie wysunie się z płytki. Można zatem stwierdzić, że mimo oderwania się części komórek, oba te szczepy wykazują adhezję. Komórki przylegają do innych komórek, które z kolei przylegają prawdopodobnie do agaru.W przeciwnym razie wiele komórek mogłoby się oddzielić, ale tak się nie stało. Zatem teraz, gdy udokumentowaliśmy adhezję, przejdziemy do udokumentowania inwazji. Będę delikatnie ścierać komórki z powierzchni, usuwając tyle, ile się oddzieli.Nie wywieram żadnego nacisku, staram się jedynie zebrać wszystko, co odd

assay-for-adhesion-and-agar-invasion-in-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie opisujemy procedurę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach oraz identyfikację fenotypów zahamowania wzrostu indukowanego przez efektory. Takie fenotypy mogą być następnie wykorzystane do wyjaśnienia funkcji i celów działania efektorów.

Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Ogólny protokół badania inwazji komórek gospodarza przez patogen bakteryjny, skupiający się na Staphylococcus aureus oraz ludzkich komórkach śródbłonka.

Inwazja komórek ludzkich przez patogen bakteryjny

Niniejszy protokół opisuje prosty test adhezji bakteryjnej, polegający na zliczaniu jednostek tworzących kolonie bakterii, które przylgnęły do hodowli komórkowych. Test ten jest wiarygodny, niezależny od badanej adhezyny, a jego liczne modyfikacje są stosowane w większości laboratoriów zajmujących się patogenezą bakteryjną.

In Vitro Analiza Adhezji Bakteryjnej do Komórek Nabłonkowych Ssaków

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół opisuje metodologię o wysokiej przepustowości do funkcjonalnego badania przesiewowego pod kątem dziedziczenia opartego na białkach u S. cerevisiae.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku dziedziczenia na podstawie białek u S. cerevisiae

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Tutaj prezentujemy protokół badania infekcji Candida jamy ustnej u pacjentów z pierwotnym zespołem Sjögrena, który może być wykorzystany do szybkiego leczenia, a następnie uniknięcia związanych z nim powikłań.

Badanie zakażenia Candida w jamie ustnej u pacjentów z pierwotnym zespołem Sjögrena

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Poznaj test przyczepności i inwazji w agarze u Saccharomyces cerevisiae. Ta metoda pozwala ocenić fenotyp inwazyjny drożdży i wpływ czynników środowiskowych na ich różnicowanie.

Test dla Przyczepność i Invasion Agar w S. cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów