Name: Zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii Ramana (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: Poznaj zastosowanie spektroskopii CARS do obrazowania mieliny w tkance mózgowej. Ta metoda pozwala wizualizować otoczki mielinowe i łączyć je z immunofluorescencją w badaniach nad stwardnieniem rozsianym i autyzmem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Obsługiwane przez NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug), oraz NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280, oraz FRAXA (McCullagh). Obrazowanie CARS zostało przeprowadzone w Advanced Light Microscopy Core w Centrum Neurotechnologii na University of Colorado Anschutz Medical Campus, wspieranym częściowo przez NIH P30 NS048154 i NIH P30 DK116073.

Wszystkie eksperymenty były zgodne z obowiązującymi przepisami, wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Kolorado Anschutz.
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Należy użyć myszy C57BL/6J (numer serii #000664) (Mus musculus) pozyskanych z The Jackson Laboratory lub gerbil mongolskich (Meriones unguiculatus) pierwotnie pozyskanych z Charles River.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanki
<ol>
	<li>W celu przeprowadzenia perfuzji przezsercowej, podaj badanym gryzoniom dawkę przedawkowaną pentobarbitalu (120 mg/kg masy ciała), a następnie wykonaj perfuzję przezsercową solą fosforanową (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4), a po niej 4% paraformaldehydem (PFA)24.
	<ol>
		<li>W szczególności należy otworzyć jamę brzusną oraz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i unieruchomić klatkę piersiową kleszczykami hemostatycznymi Kelly’ego, aby odsłonić serce.</li>
		<li>Wprowadź igłę 23 GA połączoną z pompą perfuzyjną do lewej komory i szybko przetnij prawy przedsionek za pomocą precyzyjnych nożyczek.</li>
		<li>Podawaj PBS za pomocą pompy perfuzyjnej i igły w sercu przez 10 min, aby oczyścić mózg i organizm z krwi.</li>
		<li>Przełącz pompę perfuzyjną na 4% PFA na 10 min i sprawdź sztywność kończyn oraz ogona, aby potwierdzić prawidłowy przebieg perfuzji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po perfuzji zdekapituj zwierzęta i wyjmij mózgi z czaszek. Przechowuj mózgi przez noc w 4% PFA przed przeniesieniem do PBS. Osadź pnie mózgu w 4% agarozie (w PBS) i wykonaj cięcia koronalne za pomocą wibratomu, uzyskując plastry o grubości 200 µm.</li>
</ol>
3. Barwienie
<ol>
	<li>Barw swobodnie pływające skrawki na ciałka Nissla w celu wizualizacji ciał komórkowych (1:100), stosując medium przeciwciał (medium AB: 0,1 M bufor fosforanowy (PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) przez 30 min w temperaturze pokojowej na standardowym wytrząsarce laboratoryjnej25.
	<ol>
		<li>Chroń skrawki przed światłem, używając folii aluminiowej i/lub przykrycia. Długości fal 550 nm lub niższe są kompatybilne z obrazowaniem CARS (Rycina 1). 
		UWAGA: Chociaż nie spodziewamy się, aby Triton-X lub inne odczynniki miały wpływ na obrazowanie lipidów metodą CARS, zasadne może być zastosowanie dodatkowych kontroli z użyciem specyficznych mediów przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li> punkt przerwania: Przechowuj swobodnie pływające skrawki (chroniąc je przed światłem) w PBS do momentu obrazowania. Po wykonaniu skrawków, obrazowanie sekcji mózgu należy przeprowadzić w ciągu 2 tygodni.</li>
</ol>
<img alt="Widmo emisji fluorescencji, 660 nm, wykres analizy emisji, względna intensywność względem długości fali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obrazowanie CARS można łączyć z obrazowaniem immunofluorescencyjnym. Wykresy pokazują, że obrazowanie CARS odbywa się w czerwonym spektrum sygnału 660/640 nm26. Długość fali ta jest wystarczająco oddalona od zakresu zielonego, niebieskiego lub UV, co pozwala na połączenie sygnału CARS z immunofluorescencją w tych zakresach. W szczególności wykres wskazuje również wzbudzenie i emisję dla ciałek Nissla znakowanych niebieskim fluoroforem, co zostało połączone z CARS podczas gromadzenia reprezentatywnych wyników do niniejszej publikacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Obrazowanie
UWAGA: Układ laserowy CARS zawiera laser światłowodowy generujący taktowanie 80 MHz oraz laser OPO (oscylator parametryczny) z zakresem strojenia 770-990 nm i wiązką Stokesa ustawioną na 1031 nm, które są niezbędne do zbierania sygnału CARS. Dla obu wiązek przewidziano jedną aperturę.
<ol>
	<li>Przed umieszczeniem próbek pod mikroskopem włączyć i rozgrzać laser CARS przez co najmniej 1 h, przeprowadzić wyrównanie lasera CARS oraz ustawić optykę kondensora i przysłonę mikroskopu zgodnie z metodą Koehlera dla obrazowania CARS w kierunku przednim (forward CARS). 
	UWAGA: Krok ten jest kluczowy dla prawidłowego działania mikroskopii CARS.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać wyrównanie przestrzenne dwóch wiązek laserowych (pompy i Stokesa), uzyskać dostęp do dwóch wewnętrznych PSD (detektorów czułych na pozycję) za pomocą interfejsu graficznego (GUI) lasera CARS.</li>
		<li>Osiągnąć wyrównanie czasowe, korzystając z funkcji opóźnienia w GUI lasera CARS, co pozwala na nałożenie na siebie impulsów dwóch laserów (pompy i Stokesa), które mają różne dyspersje ze względu na odmienne długości fal. W związku z tym zarówno nakładanie czasowe, jak i przestrzenne wiązek pompy i Stokesa odbywa się poprzez wprowadzanie danych przez użytkownika w GUI.</li>
		<li>Wyregulować zewnętrzny peryskop (dwa ostatnie lustra układu), aby wycentrować przestrzennie nałożone dwa lasery na lustra głowicy skanującej mikroskopu.</li>
		<li>Aby uzyskać najlepszą detekcję nielustrzaną (non-descanned) w kierunku przednim CARS, upewnić się, że kondensor jest ustawiony zgodnie z metodą Koehlera (kondensor jest wycentrowany i skupiony na przysłonie w celu uzyskania jednorodnego oświetlenia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu obrazowania konfokalnego immunofluorescencyjnego oraz obrazowania CARS, skonfigurować laser CARS z detektorami nielustrzanymi (NDD) dla obu kierunków (przedniego i epi), wykorzystując mikroskop konfokalny wyposażony w lasery widzialne do obrazowania fluorescencyjnego (Rysunek 2).</li>
	<li>Umieścić skrawki w szalce hodowlanej z zakryciem (dla mikroskopii odwróconej), dodać PBS, aby zapobiec wysychaniu tkanki oraz położyć szklany obciążnik, aby utrzymać tkankę blisko zakrycia.</li>
	<li>Wykonac stosy z-stacków lub pojedyncze obrazy przy użyciu obiektywu wodnego z korekcją podczerwoną 60X, 1.2 NA, który służy do zbierania sygnału CARS w kierunku epi, oraz poprzez kondensor 0.55 NA w kierunku przednim, w celu obrazowania obszarów mózgu, takich jak przyśrodkowe jądro ciała trapezyjnego (MNTB).
	<ol>
		<li>Wykonać obrazy CARS przy mocy pompy/sondy około 600 mW i Stokesa 300 mW, korzystając z GUI lasera CARS. Wartości mocy laserów są mierzone wewnętrznie przez system. Moce obu laserów w miejscu próbki wynoszą mniej niż 25 mW i są bezpieczne dla próbki tkanki.</li>
		<li>Nałożyć na siebie wiązki pompy i Stokesa przestrzennie i czasowo. Nastroić OPO na 797.2 nm. Daje to długość fali CARS wynoszącą 650 nm. Ze względu na wyższy poziom energii, wynikający powrót do stanu podstawowego jest anty-Stokesowski (przesunięty w stronę niebieską) względem wzbudzenia.</li>
		<li>Zarejestrować sygnał CARS w detektorach nielustrzanych epi lub przednich, używając filtrów przepustowych (640-680 nm), a następnie przeprowadzić sekwencyjną detekcję znacznika immunofluorescencyjnego (w tym przypadku fluorescencyjnie znakowanego Nissla). 
		UWAGA: Marker somy neuronalnej Nissla nie jest wyłapywany przez filtr przepustowy CARS 640-680 nm, co umożliwia połączenie obrazowania fluorescencyjnego i CARS na przedstawionych poniżej obrazach.</li>
		<li>CARS i fluorescencja nie korzystają ze wspólnych PMT. Użyć tych ustawień dla optymalnego sygnału lipidowego, aby selektywnie obrazować mielinizację w obszarze mózgu. 
		OSTRZEŻENIE: Chronić użytkownika przed wiązką laserową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisywać obrazy jako pliki .oib, które mogą zostać zaimportowane do programu do analizy obrazów w celu dalszej kwantyfikacji (Rysunek 3).</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu CARS przedstawiający łącznik laserów, PMT i obiektywy dla nieliniowej mikroskopii optycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat urządzenia CARS przedstawiający lasery CARS (czerwone strzałki) oraz detekcję epi i przednią typu non-descanned (NDD) wbudowane w konfokalny skaner laserowy. W trybie przedniego NDD rejestrujemy sygnał CARS dla wiązań C-H (ciemnoczerwone strzałki) oraz SHG (generację drugiej harmonicznej) przy 515 nm (pomarańczowa strzałka). W trybie epi NDD rejestrujemy sygnał CARS dla wiązań C-H (ciemnoczerwone strzałki) oraz autofluorescencję 2PE (dwufotonową emisję) (jasnoniebieska strzałka). Sekwencyjnie można pozyskać obrazy konfokalne fluorescencji (zielone strzałki dla lasera widzialnego, niebieskie strzałki dla detekcji konfokalnej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii Nissla i CARS porównujące struktury neuronów u świstaka i myszy, analiza projekcji z." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: CARS pozwala na obrazowanie mieliny (magenta) w tkance mózgowej (pień mózgu), umożliwiając jednocześnie obrazowanie barwienia Nissla (cyjan) lub markerów fluorescencyjnych. Dwa panele przedstawiają reprezentatywne wyniki z mózgu świstaka mongolskiego (pojedynczy obraz M. unguiculatus, Rycina 3A,C,E) oraz myszy (maksymalna projekcja stosu z M. musculus, Rycina 2B,D,F), co wskazuje, że technika ta może być stosowana u różnych gatunków. Rycina 3A,B przedstawia barwienie Nissla w kolorze cyjan, C,D pokazują sygnał CARS w kolorze magenta, a E,F łączą sygnały Nissla i CARS dla odpowiednio świstaka i myszy. Oba zestawy obrazów przedstawiają przekrój jądra przyśrodkowego ciała trapezoideum (MNTB) w pniu mózgu. Neurony w MNTB otrzymują sygnały z silnie zmielinizowanych aksonów, które kończą się w kaliksie Held, będącym rodzajem gigantycznej synapsy27. Pasek skali wynosi 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Cole, K., Curtis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+impedance+of+the+squid+giant+axon+during+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electric impedance of the squid giant axon during activity.</a> The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).</li>
<li>Cole, K. S., Curtis, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+of+the+squid+giant+axon+during+current+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane potential of the squid giant axon during current flow.</a> Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).</li>
<li>Alcami, P., El Hady, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+computations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal computations.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413(2019).</li>
<li>Neumann, E., Nachmansohn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+excitability-Toward+an+integrating+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Aharon+Katzir+Memorial+Volume%22%5BJournal%5D)">Nerve excitability-Toward an integrating concept.</a> Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).</li>
<li>Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+properties+and+design+principles+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Integrative properties and design principles of axons.</a> International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).</li>
<li>Fitzhugh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computation+of+impulse+initiation+and+saltatory+conduction+in+a+myelinated+nerve+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber.</a> Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).</li>
<li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+myelin%3A+a+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Novartis+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).</li>
<li>Salzer, J. L., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Myelination.</a> Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).</li>
<li>Boullerne, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The history of myelin.</a> Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).</li>
<li>Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+in+development%2C+myelin+generation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond.</a> Cells. 8 (11), 1424(2019).</li>
<li>Saab, A. S., Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+dynamics%3A+protecting+and+shaping+neuronal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).</li>
<li>Chomiak, T., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+optimal+value+of+the+g-Ratio+for+myelinated+fibers+in+the+rat+CNS%3F+A+theoretical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach.</a> PLOS ONE. 4 (11), 7754(2009).</li>
<li>Ford, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+Ranvier+node+and+internode+properties+in+myelinated+axons+to+adjust+action+potential+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing.</a> Nature Communications. 6, 8073(2015).</li>
<li>Stange-Marten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input+timing+for+spatial+processing+is+precisely+tuned+via+constant+synaptic+delays+and+myelination+patterns+in+the+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).</li>
<li>Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+NG2%2B+glial+cell+proliferation+and+oligodendrocyte+generation+in+the+hypomyelinating+mutant+shiverer%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer.</a> Glia. 48 (1), 51-63 (2004).</li>
<li>Pacey, L. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+myelination+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).</li>
<li>Green, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clemastine+fumarate+as+a+remyelinating+therapy+for+multiple+sclerosis+%28ReBUILD%29%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+double-blind%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial.</a> Lancet. 390 (10111), London, England. 2481-2489 (2017).</li>
<li>Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+translational+control+of+fragile+X+mental+retardation+protein+on+myelin+proteins+in+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders.</a> Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).</li>
<li>Barak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+deletion+of+Gtf2i%2C+associated+with+Williams+syndrome%2C+causes+behavioral+and+myelin+alterations+rescuable+by+a+remyelinating+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug.</a> Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).</li>
<li>Phan, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin-related+transcriptomic+profile+is+shared+by+Pitt-Hopkins+syndrome+models+and+human+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).</li>
<li>Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+deficits+in+the+auditory+brainstem+of+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 1536(2021).</li>
<li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-stokes+raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+ttissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).</li>
<li>Kim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+coherent+anti-stokes+raman+spectroscopy+images+intact+atheromatous+lesions+and+concomitantly+identifies+distinct+chemical+profiles+of+atherosclerotic+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids.</a> Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-floating+Immunostaining+of+Mouse+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Free-floating Immunostaining of Mouse Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62876(2021).</li>
<li>Fluorescence SpectraViewer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer">https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer</a> (2022).</li>
<li>Held, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+centrale+geh%C3%B6rleitung%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Anat+Physiol+Anat+Abt%22%5BJournal%5D)">Die centrale gehörleitung.</a> Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).</li>
<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li>
<li>Gruchot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+remyelination+failure+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis.</a> Cells. 8 (8), 825(2019).</li>
<li>Rivera, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+pathway+in+the+age-related+decline+of+oligodendrocyte+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007(2022).</li>
<li>Kútna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+demyelination+and+neurodegeneration+associated+with+mTORC1+hyperactivity+may+contribute+to+the+developmental+onset+of+autism-like+neurobehavioral+phenotype+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Research%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Autism+Research%22%5BJournal%5D)">Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model.</a> Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).</li>
<li>Ozsvár, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+lipid+debris+accumulation+caused+by+cuprizone+induced+myelin+degradation+in+different+CNS+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas.</a> Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).</li>
<li>Prineas, J. W., Graham, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+capping+of+surface+immunoglobulin+G+on+macrophages+engaged+in+myelin+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown.</a> Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).</li>
<li>Bégin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+the+segmentation+and+morphometry+of+nerve+fibers+in+large-scale+CARS+images+of+spinal+cord+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue.</a> Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Coraz więcej literatury podkreśla rolę mieliny w funkcjonowaniu mózgu 13,16,21,28. Co więcej, wiemy, że grubość mielinizacji i wzorzec mielinizacji mogą się zmieniać w kilku stanach neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (omówione w29), starzenie się (omówione w30), autyzm20,31 ...

Potencjały czynnościowe są podstawową jednostką informacji w mózgu, a propagacja potencjału czynnościowego przez aksony stanowi jeden z filarów przetwarzania informacji1,2,3. Neurony zazwyczaj odbierają aferentne dane wejściowe z wielu innych neuronów i integrują te dane wejściowe w danym wąskim oknie czasowym4,5. W związku z tym mechanizmy propagacji potencjału czynnościowego w aksonach spotkały się ze znacznym zainteresowaniem badaczy.
Podczas propagacji przez akson, potencjał czynnościowy jest wielokrotnie regenerowany wzdłuż aksonu, aby zapewnić niezawodne propagację6. W większości neuronów kręgowców szczękowych (gnathostomów) aksony są otoczone osłonką mieliny, która jest substancją bogatą w lipidy wytwarzaną przez pobliskie oligodendrocyty lub komórki Schwanna, które są typami komórek glejowych (recenzja w7,8). Ta osłonka mielinowa izoluje elektrycznie akson, zmniejszając jego pojemność i umożliwiając wydajną, szybką i wydajną propagację potencjału czynnościowego przy mniejszym zużyciu energii. Mielina nie pokrywa aksonu równomiernie, ale otacza akson w segmentach, które mają krótkie przerwy między nimi, zwanych węzłami Ranviera (recenzja w9,10). Zarówno grubość mielinizacji, która kontroluje poziom izolacji elektrycznej aksonu, jak i odstępy między węzłami Ranviera, które kontrolują częstotliwość, z jaką potencjały czynnościowe są regenerowane wzdłuż aksonu, wpływają na szybkość propagacji potencjału czynnościowego (przejrzane w11).
Istnieje obszerna literatura sugerująca, że grubość mielinizacji wpływa na szybkość propagacji potencjału czynnościowego w aksonach12,13,14. Co więcej, zmiany w mielinizacji aksonów mogą powodować szereg deficytów OUN15,16,17,18,19,20,21. Nic więc dziwnego, że wiele wysiłków badawczych skupia się na pomiarze i charakterystyce mielinizacji aksonów. Pomiary grubości mieliny są najczęściej wykonywane za pomocą mikroskopii elektronowej, techniki, która wymaga znacznej ilości przygotowania tkanek i jest trudna do zastosowania w połączeniu z immunohistochemią. Istnieje jednak również szybsza i prostsza technika pomiaru mielinizacji aksonów, która opiera się na koherentnej spektroskopii Ramana Antystokesa (CARS). Laser CARS może być dostrojony do różnych częstotliwości, a po dostrojeniu do częstotliwości, które są odpowiednie do wzbudzania lipidów, mielina może być obrazowana bez potrzeby stosowania dodatkowych etykiet22. Obrazowanie lipidów można połączyć ze standardową immunohistochemią, dzięki czemu lipidy mogą być obrazowane razem z kilkoma kanałami fluorescencyjnymi23. Obrazowanie mielinizacji za pomocą CARS jest znacznie szybsze niż mikroskopia elektronowa, a jego rozdzielczość, choć niższa niż EM, jest wystarczająca do wykrycia nawet niewielkich różnic w mielinizacji w tym samym typie aksonów.

<table><tbody><tr><td>< silny> znieczulający: < / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml jednorazowa strzykawka z igłą 27 GA x 0,5 "</td><td>Exel int</td><td>260040</td><td></td></tr><tr><td>Śmiertelny +</td> <td>Vortech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgery: < / mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nożyczki sprężynowe - 8mm Cutting Edge</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta standardowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Perfuzja: </mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehydu</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF994 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatyki Kelly'ego</td><td>Fine Science Tools</td><td>13019-14</td><td></td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówka igły, precyzyjny ślizg 23 GA x 1"</td><td>BD</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Monobazowa pompa fosforanu potasu</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>o zmiennym przepływie lub równoważna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Rozwarstwienie: </mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL fiolka z 4% PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bochem Chemical Spoon 180mm</td><td>Bochem</td><td>230331000</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15011-12</td><td></td></tr><tr><td>Para cienkich (Graefe) pęset</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Płytka szklana lub plastikowa taca, około 10" x 10"</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pęseta standardowa</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne - Blunt</td><td>Fine Science Narzędzia</td><td>14000-20</td><td></td></tr><tr><td>Krojenie: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, roślina</td><td>RPI</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000s płytka wiertnicza</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Alkalia Sci.</td><td>TPN1048-NT</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Barwienie: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB Media:</td><td></td><td></td> <td>1 n 1,000 ml miliporów H2O</td></tr><tr><td>Buforowane fosforanem (PB):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monobase fosforanu potasu</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma life science</td><td>A2153-100g</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>x100-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Nissl 435/455</td><td>Invitrogen</td><td>N21479</td><td></td></tr><tr><td>SAMOCHODY:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APE&nbsp; pikoszmaragdowy laser</td><td>Angewandte Physik & Elektronik&nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy GmbH (420-520 nm)</td><td>Filtr pasmowo-przepustowy Chroma Technology</td><td>HQ470/100m-2P</td><td></td></tr><tr><td>(500-530 nm)</td><td>Filtry pasmowo-przepustowe Chroma Technology</td><td>HQ515/30m-2P</td><td></td></tr><tr><td>(640-680 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ660/40m-2P</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>dichroiczny longpass 565 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>565dcxr</td><td></td></tr><tr><td>dichroiczny longpass 585 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>585dcxr</td><td></td></tr><tr><td>dichroiczny shortpass 750 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>T750spxrxt</td><td></td></tr><tr><td>szklane naczynie hodowlane</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr> szklany <tr><td>ciężarek (pręt boro 10 mm x 10 mm)</td><td>Allen Scientific Wielofotonowy</td> krótkoprzepustowy filtr emisyjny Glass Inc <td></td><td></td></tr><tr><td>680 nm</td><td>Technologia Chroma</td><td>ET680sp-2p8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii ramana (cars) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Koherentna anty-Stokesowska spektroskopia Ramana (CARS) jest techniką klasycznie stosowaną przez chemików i fizyków do wytwarzania spójnego sygnału sygnaturowych drgań molekuł. Jednak te sygnatury wibracyjne są również charakterystyczne dla cząsteczek w tkance anatomicznej, takiej jak mózg, co czyni je coraz bardziej użytecznymi i mającymi zastosowanie w zastosowaniach neuronauki. Na przykład CARS może mierzyć lipidy poprzez specyficzne wzbudzanie wiązań chemicznych w tych cząsteczkach, co pozwala na ilościowe określenie różnych aspektów tkanki, takich jak mielina zaangażowana w neurotransmisję. Ponadto, w porównaniu z innymi technikami zwykle stosowanymi do ilościowego oznaczania mieliny, CARS można również skonfigurować tak, aby był kompatybilny z technikami immunofluorescencyjnymi, co pozwala na koznakowanie z innymi markerami, takimi jak kanały sodowe lub inne składniki transmisji synaptycznej. Zmiany mielinizacyjne są z natury ważnym mechanizmem w chorobach demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane lub inne schorzenia neurologiczne, takie jak zespół łamliwego chromosomu X lub zaburzenia ze spektrum autyzmu, to nowy obszar badań. Podsumowując, CARS może być wykorzystany w innowacyjny sposób, aby odpowiedzieć na palące pytania w neuronauce i dostarczyć dowodów na mechanizmy leżące u podstaw wielu różnych schorzeń neurologicznych.

Jedną z największych zalet mikroskopii CARS nad innymi technikami jest kompatybilność z obrazowaniem fluorescencyjnym23. <silna klasa="xfig">Rysunek 1 pokazuje widma CARS w porównaniu do Nissl oznaczone markerem immunofluorescencyjnym, wykazujące niewielkie/żadne nakładanie się widm. Rysunek 2 ilustruje zestaw laserowy dla CARS w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Rysunek 3 przedstawia dwa reprezentatywne obrazy, jeden jako poj...

Wizualizacja mielinizacji jest ważnym celem dla wielu badaczy zajmujących się układem nerwowym. CARS to technika kompatybilna z immunofluorescencją, która może natywnie obrazować lipidy w tkankach, takich jak mózg, oświetlając wyspecjalizowane struktury, takie jak mielina.

Zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii Ramana (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Technika ta może obrazować mielinę w skrawkach tkanki mózgowej. Mielinizacja odgrywa ważną rolę w przewodzeniu potencjałów czynnościowych, a zrozumienie mieliny pomoże nam zrozumieć funkcjonowanie mózgu. Główną przewagą techniki CARS nad np. mikroskopią elektronową jest to, że CARS jest techniką mikroskopii świetlnej i można ją łatwo łączyć z innymi obrazami fluorescencyjnymi, takimi jak stosowane w immunohistochemii.Kilka schorzeń jest spowodowanych zmianami w mielinizacji, na przykład stwardnienie rozsiane, starzenie się i autyzm. Zrozumienie tych zmian pomoże nam zrozumieć podstawowe schorzenia. W tym przypadku laser CARS jest dostrojony do obrazowania lipidów, a konkretnie wiązań CH2.W mózgu największym źródłem lipidów jest mielina. Jest to więc technika obrazowania mieliny w tkance mózgowej. Powinno być możliwe zastosowanie tej samej metody w przypadku innych typów tkanek, gdy interesujące jest obrazowanie lipidów.Dostrajanie i wyrównywanie lasera CARS wymaga znacznej wiedzy specjalistycznej i najlepiej jest wykonywać je ekspert w dziedzinie lasera lub mikroskopii świetlnej. Po przygotowaniu tkanek zgodnie z opisem w manuskrypcie, wybarwić swobodnie pływające skrawki na pożywki z niselem i przeciwciałami w celu wizualizacji ciał komórkowych, a następnie inkubować skrawki na standardowej wytrząsarce laboratoryjnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przed umieszczeniem próbek pod mikroskopem włącz i rozgrzej laser CARS przez co najmniej godzinę, a następnie ustaw laser CARS, nakładając się przestrzennie na wiązki laserowe pompy i stokes, a następnie wyreguluj opóźnienie między dwiema wiązkami lasera.Pokoloruj optykę kondensatora i membranę mikroskopu do obrazowania CARS do przodu, a następnie wyreguluj zewnętrzny peryskop, aby wyśrodkować przestrzennie nakładające się dwa lasery na lustra głowicy skanującej mikroskopu. Aby uzyskać najlepsze wykrywanie CARS bez deskanowania. Upewnij się, że skraplacz jest zwabiony kolorem.W przypadku immunofluorescencji, obrazowania konfokalnego i obrazowania samochodów laser CARS należy wyposażyć zarówno w detektory niedeskanowane forward jak i epi CARS, poprzez włączenie mikroskopu konfokalnego wyposażonego w widzialne lasery do obrazowania fluorescencyjnego. Teraz umieść skrawki w naczyniu hodowlanym z dnem szkiełka nakrywkowego i PBS, aby uniknąć wysuszenia tkanki. Użyj również szklanego ciężarka, aby utrzymać chusteczkę w pobliżu szkiełka nakrywkowego.Korzystając z graficznego interfejsu użytkownika, ustaw parametry akwizycji obrazu dla konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego samochodów i pocisków. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu, ustaw ostrość próbki i uchwyć obrazy. Widma CARS wahają się od 640 do 660 nanometrów i wydaje się, że widma nie pokrywają się ze znacznikiem immunofluorescencyjnym znakowanym niselem, co wskazuje, że sygnały CARS mogą być używane z sygnałami immunofluorescencyjnymi.Nisel wykorzystano do wizualizacji ciał komórkowych mózgów myszoskoczka mongolskiego i myszy, a obrazowanie CARS wykorzystano do wizualizacji osłonki mielinowej, co wskazuje, że technika ta może być stosowana u różnych gatunków. Oba zestawy obrazów pokazują przekrój przyśrodkowego jądra ciała trapezoidalnego w pniu mózgu. Rozdzielczość CARS jest niższa niż w przypadku mikroskopu elektronowego i jest rzędu kilkuset nanometrów.Obrazy mogą być analizowane za pomocą standardowego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, w celu ilościowego określenia interesujących parametrów, na przykład grubości lub długości mieliny.

coherent-anti-stokes-raman-spectroscopy-cars-application-for-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Źródło: Espinoza, R., et al. Dwukolorowe, stymulowane w czasie rzeczywistym obrazowanie rozpraszania Ramana mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek. J. Vis. exp. (2022).  Film przedstawia dwukolorowe, stymulowane rozpraszanie Ramana (SRS) wycinków tkanki mózgowej myszy. Dwie zsynchronizowane wiązki laserowe są kierowane na przekrój tkanki w celu wzbudzenia drgań molekularnych, co powoduje względną zmianę intensywności wiązek. Lipidy i białka w tkance są wykrywane za pomocą różnych par...

Dwukolorowe, stymulowane obrazowanie rozpraszania Ramana tkanki mózgowej myszy

Źródło: McCullagh, E. A., et al. Koherentna spektroskopia Ramana Antystokesa (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne i koherentną spektroskopię Ramana antystokesa (CARS) w celu wizualizacji architektury neuronalnej w tkance mózgowej gryzoni. Barwienie Nissl znakuje ciała komórkowe poprzez wiązanie się z rybosomalnym RNA, podczas gdy obrazowanie CARS celuje w mielinę bogatą w lipidy za pomocą sygnałów indukowanych...

Koherentna spektroskopia Ramana antystokesa do wizualizacji mielinizowanych neuronów w tkance mózgowej myszy

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) jest potężną, nieniszczącą i bezznacznikową techniką obrazowania. Jednym z pojawiających się zastosowań jest stymulowana histologia Ramana, w której dwukolorowe obrazowanie SRS w przejściach Ramana białek i lipidów jest wykorzystywane do generowania obrazów pseudo-hematoksyliny i eozyny. W tym miejscu demonstrujemy protokół dwukolorowego obrazowania SRS w czasie rzeczywistym w diagnostyce tkanek.

Dwukolorowe, stymulowane rozpraszaniem Ramana w czasie rzeczywistym mózgu myszy w celu diagnozowania tkanek

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Korzystając z platformy multimodalnej łączącej metody obrazowania optycznego bez znaczników, opracowaliśmy protokół do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej i metabolizmu. Dzięki obrazowaniu za pomocą fluorescencji wielofotonowej, generowania drugiej harmonicznej i wymuszonej mikroskopii rozpraszania Ramana możemy uzyskać całościowy przegląd środowiska komórkowego i molekularnego.

Multimodalna platforma obrazowania optycznego do badania metabolizmu komórkowego

Poznaj zastosowanie spektroskopii CARS do obrazowania mieliny w tkance mózgowej. Ta metoda pozwala wizualizować otoczki mielinowe i łączyć je z immunofluorescencją w badaniach nad stwardnieniem rozsianym i autyzmem.

Zastosowanie koherentnej antystokesowskiej spektroskopii Ramana (CARS) do obrazowania mielinizacji w wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów