Name: Badanie czynników wpływających na antynagrodę w zachowaniach uzależniających za pomocą anatomicznie specyficznych metod ekspresji genów jednokomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę mikrofluidycznej RT-qPCR do analizy ekspresji genów w pojedynczych neuronach i komórkach glejowych. Technika ta umożliwia badanie neurozapalnych mechanizmów uzależnienia z wysoką czułością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prezentowana tutaj praca została sfinansowana przez NIH HLB U01 HL133360 przyznany JS i RV, NIDA R21 DA036372 przyznany JS i EVB, T32 AA-007463 przyznany Janowi Hoekowi na rzecz SJO'S, oraz National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.

<ol><li>Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.samhsa.gov/data/">https://www.samhsa.gov/data/</a> (2020).</li>
<li>Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml">https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml</a> (2020).</li>
<li>Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattick%2C+RP+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22">Cochrane Database of Systematic Reviews</a>. Mattick, R. P. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).</li>
<li>Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methadone+maintenance+therapy+versus+no+opioid+replacement+therapy+for+opioid+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).</li>
<li>Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+treatment+of+alcohol+dependence%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Psychiatry+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review.</a> International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).</li>
<li>Holmes, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lancet+Psychiatry+Commission+on+psychological+treatments+research+in+tomorrow%27s+science%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow's science.</a> The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).</li>
<li>Ford, C. L., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+opportunities+for+circuit-based+social+neuroscience%3A+advancing+21st+century+psychiatry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry.</a> Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).</li>
<li>Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychological+treatments%3A+A+call+for+mental-health+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Psychological treatments: A call for mental-health science.</a> Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).</li>
<li>Miranda, A., Taca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+with+percutaneous+electrical+nerve+field+stimulation+is+associated+with+reduction+in+signs+and+symptoms+of+opioid+withdrawal%3A+a+multisite%2C+retrospective+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Drug+and+Alcohol+Abuse%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment.</a> The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).</li>
<li>Metz, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ibudilast+on+the+subjective%2C+reinforcing%2C+and+analgesic+effects+of+oxycodone+in+recently+detoxified+adults+with+opioid+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence.</a> Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).</li>
<li>Heinzerling, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((placebo-controlled+trial+of+targeting+neuroinflammation+with+ibudilast+to+treat+methamphetamine+use+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).</li>
<li>Bogenschutz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psilocybin-assisted+treatment+for+alcohol+dependence%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study.</a> Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+in+alcohol+and+opioid+withdrawal+syndromes+suggest+common+negative+reinforcement+mechanisms+involving+the+interoceptive+antireward+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+neuroscience%3A+A+growing+frontier+in+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Biocell%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness.</a> Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+glia+and+neuron+gene+expression+in+the+central+amygdala+in+opioid+withdrawal+suggests+inflammation+with+correlated+gut+dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+scale+neuronal+and+glial+gene+expression+and+putative+cell+phenotypes+and+networks+in+the+nucleus+tractus+solitarius+in+an+alcohol+withdrawal+time+series%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790(2021).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+laser+capture+microdissection+and+microfluidic+qpcr+to+analyze+transcriptional+profiles+of+single+cells%3A+A+systems+biology+approach+to+opioid+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60612(2020).</li>
<li>Achanta, S., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+high-throughput+qRT-PCR+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Protocols.io%22%5BJournal%5D)">Single cell high-throughput qRT-PCR protocol.</a> Protocols.io. , (2020).</li>
<li>O'Sullivan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interoceptive+antireward+pathway+and+gut+dysbiosis+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychiatry%2C+Depression+%26+Anxiety%22%5BJournal%5D)">The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction.</a> Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+analysis+reveals+novel+neuronal+phenotypes+and+interaction+networks+involved+in+the+central+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).</li>
<li>Staehle, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+patterns+of+gene+expression+in+the+dorsal+vagal+complex+and+the+central+nucleus+of+the+amygdala+-+Non-rhythm-generating+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala - Non-rhythm-generating brain regions.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 375(2020).</li>
<li>Réus, G. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+inflammation+and+microglial+activation+in+the+pathophysiology+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders.</a> Neuroscience. 300, 141-154 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+astrocytes+in+major+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders.</a> Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).</li>
<li>Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+gene+regulatory+network+phenotypes+underlying+single+cell+transcriptional+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).</li>
<li>Lieber, C. S., DeCarli, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+alcohol+feeding+and+liver+injury+in+the+baboon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Primatology%22%5BJournal%5D)">An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon.</a> Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).</li>
<li>Lieber, C. S., Decarli, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+chronic+ethanol+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Animal models of chronic ethanol toxicity.</a> Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+drive+cell+phenotype+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Inputs drive cell phenotype variability.</a> Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%3A+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition</a>. , Academic Press. Elsevier Inc. (1982).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zaburzenia związane z używaniem alkoholu pozostają chorobą trudną do leczenia. Nasza grupa podeszła do tego zaburzenia, badając procesy antynagradzania z perspektywy neuronauki systemowej. Zmierzyliśmy zmiany ekspresji genów w pojedynczych neuronach NTS i mikrogleju w szeregu czasowymodstawienia alkoholu 16. NTS został wybrany ze względu na jego znaczącą rolę w dysregulacji autonomicznej, która występuje w alkoholowym zespole abstynencyjnym. Łączymy LCM z jednokomórkowym mikroprzepływowym RT-qPCR,...

Uzależnienie pozostaje rosnącym wyzwaniem w krajach rozwiniętych1,2. Pomimo znacznych postępów naukowych i klinicznych, wskaźniki uzależnień nadal rosną, podczas gdy skuteczność uznanych metod leczenia pozostaje w najlepszym razie stabilna3,4,5. Jednak postępy w biotechnologii i podejściach naukowych doprowadziły do powstania nowych metod i hipotez w celu dalszego zbadania patofizjologii uzależnienia od substancji6,7,8. Rzeczywiście, ostatnie odkrycia sugerują, że nowatorskie koncepcje i paradygmaty leczenia mogą prowadzić do przełomów o społecznych, ekonomicznych i politycznych konsekwencjach9,10,11,12.
Badaliśmy antynagrodę w odstawieniu uzależnienia od alkoholu i opioidów13,14,15,16. Metody są kluczowe dla tego paradygmatu17,18. Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LCM) może wybrać pojedyncze komórki o wysokiej swoistości anatomicznej. Ta funkcja jest integralną częścią hipotezy neurozapalenia przeciw nagrodzie, ponieważ zarówno glej, jak i neurony mogą być zbierane i analizowane z tego samego podjądra neuronalnego u tego samego zwierzęcia13,14,15,16,19. Istotną część transkryptomu wybranych komórek można następnie zmierzyć za pomocą wysokoprzepustowej mikroprzepływowej ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), dostarczając wielowymiarowych zestawów danych do analizy obliczeniowej dającej wgląd w sieci funkcjonalne20,21.
Pomiar podzbioru transkryptomu w neuronach i gleju w określonym jądrze mózgu generuje zestaw danych, który jest solidny zarówno pod względem liczby próbek, jak i mierzonych genów, a także jest czuły i specyficzny. Narzędzia te są optymalne dla systemowego podejścia neurologicznego do chorób psychicznych, ponieważ glej, głównie astrocyty i mikroglej, wykazały centralną rolę w chorobach neurologicznych i psychiatrycznych w ciągu ostatniej dekady22,23. Nasze podejście może mierzyć ekspresyjną odpowiedź gleju i neuronów jednocześnie w licznych receptorach i ligandach zaangażowanych w lokalną sygnalizację parakrynną. Rzeczywiście, sygnalizację można wywnioskować z tych zestawów danych przy użyciu różnych metod ilościowych, takich jak logika rozmyta24. Co więcej, identyfikacja subfenotypów komórkowych w neuronach lub gleju i ich funkcji może dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób komórki mózgowe w określonych jądrach organizują się, reagują i rozregulowują na poziomie pojedynczej komórki. Dynamikę tego układu funkcjonalnego można również modelować za pomocą eksperymentów szeregów czasowych16. Wreszcie, modele zwierzęce mogą być zaburzone anatomicznie lub farmakologicznie, aby nadać mechanistyczny warunek podejściu tego systemu.
Reprezentatywny eksperyment: 
Poniżej przedstawiamy przykład zastosowania tych metod. W tym badaniu badano ekspresję genów neuronalnych i mikrogleju szczurów w jądrze pojedynczym (NTS) w odpowiedzi na uzależnienie od alkoholu i późniejsze odstawienie16. Kohorty szczurów składały się z 1) kontrolnej, 2) zależnej od etanolu (EtOH), 3) 8-godzinnego odstawienia (Wd), 4) 32-godzinnego odstawienia i 5) 176-godzinnego Wd (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Po szybkiej dekapitacji pnie mózgu oddzielono od przodomózgowia i poddano kriosekcji, a plastry wybarwiono pod kątem neuronów dodatnich pod względem hydroksylazy tyrozynowej (TH +) i mikrogleju (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B). LCM wykorzystano do zbierania zarówno neuronów TH+, jak i TH- oraz mikrogleju. Wszystkie komórki pochodziły z NTS i były analizowane jako próbki z puli 10 komórek. Cztery mikroprzepływowe matryce dynamiczne RT-qPCR o wymiarach 96 x 96 przeprowadzono na platformie RT-qPCR mierzącej 65 genów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B-C). Dane znormalizowano przy użyciu metody -ΔΔCt i przeanalizowano za pomocą R, a selekcję pojedynczych komórek zwalidowano za pomocą markerów molekularnych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D-E). Walidacja techniczna została następnie zweryfikowana za pomocą replik technicznych analizowanych w ramach pojedynczej partii i między partiami (<silna klasa="xfig">Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Neurony TH+ i TH- zorganizowane w różne subfenotypy z podobnymi klastrami genów zapalnych, ale różniącymi się klastrami receptora (R) kwasu γ-aminomasłowego (GABA) (R) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4 i <silna klasa = "xfig">Rysunek 5). Subfenotypy, które miały podwyższoną ekspresję klastrów genów zapalnych, były nadreprezentowane po 32 godzinach Wd, podczas gdy ekspresja receptora GABA (GABAR) pozostawała niska po długotrwałym odstawieniu alkoholu (176 godzin Wd). Praca ta przyczynia się do hipotezy antynagrody uzależnienia od alkoholu i opioidów, która zakłada, że przechwytujące sprzężenie zwrotne z wnętrzności podczas odstawienia przyczynia się do rozregulowania trzewno-emocjonalnych jąder neuronalnych (tj. NTS i ciała migdałowatego), co skutkuje poważniejszymi następstwami autonomicznymi i emocjonalnymi, które przyczyniają się do uzależnienia od substancji (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6).

<table><tbody><tr><td>20X Barwnik wiążący DNA</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>NA</td></tr><tr><td>2x Test GE Ładowanie odczynnika</td><td>Fluidigm</td><td>85000802-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>96.96 Dynamiczna tablica IFC do ekspresji genów (określana jako chip qPCR w tekście)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anti-Cd11&beta; Przeciwciało</td><td>Genway Biotech</td><td>CCEC48</td><td>Microglea Stain</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-NeuN, klon A60</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB377</td><td>Barwnik neuronalny</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko hydroksylazie tyrozyny</td><td>Abcam</td><td>ab112</td><td>Barwnik dla neuronów TH +</td></tr><tr><td>System mikrodysekcji ArcturusXT Laser Capture</td><td>Arcturus</td><td></td><td>NA NA</td></tr><tr><td>Biomark HD</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td>RT-qPCR platforma</td></tr><tr><td>Antygen surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; LCM0211</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellDirect Jednoetapowy zestaw qRT-PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11753500</td><td>Składniki roztworu buforowego do lizy</td></tr><tr><td>KomórkiBezpośrednie ponowne zawieszenie i Zestaw do lizy</td><td>ThermoFisher Scientific 11739010</td><td></td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>zawiesinowy zawiesiny DNA</td> do barwienia jądra <td>TEKnova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne ReadyProbe przeciwko oślicym, przeciwciało wtórne przeciwko królikowi IgG (H+L) ReadyProbe ReadyProbe, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37118</td><td>Seconadry </td></tr><tr><td>Egzonukleaza przeciwciała I</td><td>Nowy Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0293S</td><td>Urządzenie</td></tr> do <tr><td>ekstrakcji próbek NA ExtracSure</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0208</td><td>NA</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe FisherbrandTM Superfrost Plus</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>Szkiełka podstawowe</td></tr> zwykłe <tr><td>Rurka reakcyjna cienkościenna GeneAmp</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (H+L), rekombinowane przeciwciało wtórne Superclona, Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A28180</td><td>Seconadry Kontroler</td></tr><tr><td>przeciwciał IFC</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA RNaseOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix z Low Rox</td><td>Bio-Rad</td><td>PN 172-5211</td><td>NA</td></tr><tr><td>SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11754250</td><td>zawiera VILO i SuperScript</td></tr><tr><td>T4 Gen 32 Białko</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0300S</td><td>NA</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4391128</td><td>NA</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>TEKnova</td><td>T0225</td><td>NA</td></tr><tr><td>TempPlate 96-dołkowa płytka do PCR z półspódniczką, 0,2 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9700</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

badanie czynników wpływających na antynagrodę w zachowaniach uzależniających za pomocą anatomicznie specyficznych metod ekspresji genów jednokomórkowych

Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods

Rosnące wskaźniki zachowań uzależniających zmotywowały zarówno badaczy zdrowia psychicznego, jak i klinicystów do zrozumienia antynagrody i powrotu do zdrowia. To odejście od nagrody i rozpoczęcia wymaga nowych perspektyw, paradygmatów i hipotez, a także rozszerzenia metod stosowanych do badania uzależnienia. Tutaj podajemy przykład: podejście biologii systemowej do badania antynagrody, które łączy mikrodysekcję wychwytywania laserowego (LCM) i wysokoprzepustowe ilościowe reakcje łańcuchowe polimerazy z odwrotną transkrypcją mikroprzepływową (RT-qPCR). Zmierzono dynamikę sieci ekspresji genów i zidentyfikowano kluczowy czynnik powodujący rozregulowanie nerwowo-trzewne w odstawieniu alkoholu i opioidów, zapalenie nerwów. To połączenie technologii zapewnia anatomiczną i fenotypową specyficzność w rozdzielczości pojedynczej komórki z wysoką przepustowością czułości i specyficznymi pomiarami ekspresji genów, co daje zarówno zestawy danych generujące hipotezy, jak i możliwości mechanistyczne, które generują możliwości dla nowatorskich spostrzeżeń i terapii.

Walidacja zbierania pojedynczych komórek jest przeprowadzana wizualnie podczas procedur LCM. Jądra komórkowe są oceniane na stacji QC. Typ komórki można określić na podstawie emisji fluoroforu znakującego dany typ komórki oraz jej ogólnej morfologii. Jeśli na nakładce wybrano niepożądane komórki, ich materiał genetyczny może zostać zniszczony laserem UV na stacji QC. Niezbędna jest również dalsza walidacja za pomocą analizy molekularnej. W tym reprezentatywnym przykładzie16 wybrano dwa typy neuron...

Połączenie mikrodysekcji laserowej i mikroprzepływowego RT-qPCR zapewnia anatomiczną i biotechniczną specyfikę pomiaru transkryptomu w pojedynczych neuronach i gleju. Zastosowanie kreatywnych metod z systemowym podejściem biologicznym do chorób psychicznych może prowadzić do przełomów w zrozumieniu i leczeniu, takich jak hipoteza neurozapalenia i nagrody w uzależnieniu.

Badanie czynników wpływających na antynagrodę w zachowaniach uzależniających za pomocą anatomicznie specyficznych metod ekspresji genów jednokomórkowych

Increasing rates of addiction behavior have motivated mental health researchers and clinicians alike to understand antireward and recovery. This shift ...

Protokół jest bardzo czuły i umożliwia wysokoprzepustowe przechwytywanie profilu ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki. Technika ta zapewnia zarówno anatomiczną swoistość przestrzenną, jak i molekularną w rozdzielczości pojedynczej komórki. Po pobraniu mózgu, wybraniu pojedynczych komórek i przygotowaniu mRNA, wstrzyknij płyn z linii kontrolnej do chipa qPCR w celu przygotowania.Włóż chip qPCR do mieszalnika mikroprzepływowego. Wybierz skrypt Prime i uruchom program. Po zakończeniu programu należy wyjąć zagruntowany chip qPCR i odpipetować sześć mikrolitrów reakcji z płytki próbki PCR do odpowiedniego dołka na próbkę w zagruntowanym chipie qPCR.Teraz odpipetuj sześć mikrolitrów reakcji z płytki testowej PCR do odpowiedniego dołka testowego w zagruntowanym chipie qPCR. Następnie włóż chip do mieszalnika mikroprzepływowego. Wybierz skrypt Load Mix i uruchom program.Włącz mikroprzepływową platformę RT-qPCR i rozgrzej żarówkę. Wyjmij chip qPCR z mieszalnika mikroprzepływowego i odklej naklejkę ochronną od spodu chipa. Otwórz mikroprzepływową platformę RT-qPCR i załaduj chip qPCR do platformy.Uruchom oprogramowanie do zbierania danych, klikając Rozpocznij nowy przebieg. Sprawdź kod kreskowy chipa i typ chipa. Następnie kliknij Dalej.Wybierz plik uruchamiania chipa i przeglądaj lokalizację pliku dla magazynu zbierania danych. Następnie kliknij Typ aplikacji i wybierz Ekspresja genów. Wybierz ROX jako odniesienie pasywne, pojedynczą sondę i EVAGreen jako typ sondy.Kliknij, aby wybrać program cykli termicznych i wybierz Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. Plik pcl. Pobierz oprogramowanie do analizy danych.Uruchom oprogramowanie, aby przeanalizować mikroprzepływowy eksperyment RT-qPCR. Kliknij Chip Run i otwórz ChipRun. bml , który został utworzony przez eksperymentatora.Pojawi się okno wyświetlające szczegóły eksperymentu, w tym pasywne odniesienie, sondę i program termiczny PCR. Na karcie Chip Explorer (Eksplorator wiórów) kliknij opcję Sample Plate Setup (Ustawienia płytki próbki) i utwórz nowy szablon płytki próbki. Skopiuj i wklej przykładowe etykiety do arkusza kalkulacyjnego oprogramowania zgodnie z projektem eksperymentalnym.Wprowadź nazwę próbki i stężenie RNA używane dla próbek wzorcowych. Teraz zmapuj przykładową konfigurację, klikając mapę w menu zadań i wybierając SBS96-Left.dsp. Następnie wybierz opcję Widoki szczegółów, aby zaktualizować te zmiany w pliku, a następnie kliknij przycisk Analizuj.Wybierz opcję Detector Plate Setup (Konfiguracja płytki detektora) i utwórz nową płytkę testową. Wybierz odpowiedni typ i format kontenera. Wklej nazwy testów zgodnie z projektem eksperymentalnym i kliknij Analizuj.W okienku ustawień analizy kliknij opcję Użytkownik i ustaw dopasowanie na automatyczne. Teraz ręcznie przejrzyj każdą reakcję w chipie 96x96. Wizualizacja krzywych amplifikacji i topnienia w celu określenia, czy każda reakcja przebiegała zgodnie z oczekiwanym wzorcem qPCR.Jeśli krzywa wzmocnienia lub topnienia nie zgadza się z tym, czego się oczekuje, ta reakcja zakończy się niepowodzeniem. Po kontroli jakości wyeksportuj dane, wybierając plik, klikając przycisk eksportuj i zapisując zestaw danych jako plik csv. Ponieważ wyeksportowany plik csv zawiera zarówno macierz niepowodzenia pozytywnego, jak i macierz z nieprzetworzonymi wartościami CT, użyj macierzy niepowodzenia, aby zastąpić wszystkie komórki, które zakończyły się niepowodzeniem, w zestawie danych wartością NA. Pobierz najnowszą wersję oprogramowania Open Source R, a następnie pobierz aplikację R Studio.W przypadku wyśrodkowania mediany użyj oprogramowania R, aby obliczyć medianę wartości CT obliczoną na podstawie wszystkich wartości CT dla pojedynczej próbki, a następnie odejmij wszystkie indywidualne wartości CT od tej mediany, aby uzyskać ujemną wartość CT delta. W celu normalizacji genów porządkowych oblicz średnią ekspresję genów porządkowych dla każdej próbki i użyj tej wartości do odjęcia poszczególnych wartości CT. Aby wygenerować ujemną wartość delta delta CT, uruchom kod w oprogramowaniu R.Przekaż znormalizowany zestaw danych do języka R i przeanalizuj dane przy użyciu funkcji skalowania, wygeneruj skalowane dane, a następnie użyj funkcji mapy cieplnej języka R lub oddzielnego oprogramowania do wygenerowania mapy cieplnej. Aby uporządkować zestaw danych dla innych funkcji, oblicz korelacje Pearsona między każdym genem, po którym następuje funkcja topnienia. Wyeksportuj i prześlij te dane do oprogramowania sieci korelacji genów.Neurony wykazywały podwyższoną ekspresję NeuN, a próbki mikrogleju wykazywały znaczącą ekspresję markerów mikrogleju Cd34 i Cx3xr1. Próbki neuronów Th+ wykazały znacznie podwyższoną ekspresję Th w porównaniu z próbkami neuronalnymi Th i mikrogleju. Neurony Th wykazywały znaczną ekspresję Gcg, co sugeruje, że próbki neuronów Th są wzbogacone o neurony, które wykorzystują Glp1 jako neuroprzekaźnik.Liniowa analiza dyskryminująca wykazała, że te trzy typy komórek miały różne profile ekspresji genów we wszystkich 65 genach. Subfenotypy komórkowe próbek neuronów wzbogaconych w Glp1 za pomocą szeregu czasowego odstawienia alkoholu przedstawiono za pomocą map cieplnych. Subfenotyp A, który wykazuje wysoką ekspresję zapalnego klastra genów jeden, zwiększa się w stosunku w ośmiogodzinnym punkcie czasowym odstawienia i osiąga maksimum po 32 godzinach odstawienia.Podfenotyp zapalny jest normalizowany do kontroli przez 176 godzin odstawienia. Subfenotyp B, który wykazuje wysoką ekspresję drugiego klastra genów receptora GABA, wykazuje ogólne zahamowanie ekspresji tego klastra genów przez warunek odstawienia 176 godzin. Ekspresję genów w poszczególnych próbkach połączono w średnie, tak aby można było zwizualizować ekspresję klastrów genów i lokalizację białka w tym transkryptie genu w całym szeregu czasowym.Technikę tę można zastosować do dowolnego systemu biologicznego lub tkanki, aby zrozumieć odpowiedź komórkową na chorobę lub zaburzenie. Ma to na celu rozszyfrowanie odpowiedzi molekularnej w rozdzielczości pojedynczej komórki odnoszącej się do przestrzennej i anatomicznej architektury tkanki.

investigating-drivers-antireward-addiction-behavior-with-anatomically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Ten artykuł opisuje, jak mikrowstrzykiwać wektory wirusowe do mózgu myszy, a następnie testować w warunkowym paradygmacie preferencji miejsca, który obejmuje fazę przejęcia, wyginięcia i przywrócenia.

Stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą

Ten manuskrypt opisuje protokół, który stosuje kompleksowe profilowanie do analizy programów transkrypcyjnych indukowanych w określonych jądrach mózgowych gryzoni zgodnie z paradygmatami behawioralnymi. W niniejszym artykule podejście to zostało zilustrowane w kontekście profilowania genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę, z wykorzystaniem mikroprzepływowych macierzy qPCR.

Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Tutaj prezentujemy protokół Fluorescencji Aktywowanego Sortowania Komórek (FACS) do badania molekularnych zmian w zespołach neuronalnych wyrażających Fos zarówno ze świeżej, jak i mrożonej tkanki mózgowej. Zastosowanie zamrożonej tkanki pozwala na izolację FACS wielu obszarów mózgu podczas wielu sesji, aby zmaksymalizować wykorzystanie cennych zwierząt osobistych.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

Opisujemy protokół wywoływania nagradzających i nienagradzających doświadczeń u muszek owocowych (Drosophila melanogaster) przy użyciu dobrowolnego spożycia etanolu jako miary zmian w stanach nagrody.

Prosty sposób na zmierzenie zmian w zachowaniu związanym z poszukiwaniem nagrody za pomocą Drosophila melanogaster

Ten artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie nagrań amperometrycznych o stałym potencjale przy użyciu elektrod z włókna węglowego i technologii biosensorów enzymatycznych do pomiaru uwalniania dopaminy i glutaminianu z wysoką rozdzielczością czasową podczas naturalnego zachowania nagradzającego u samicy chomika.

Pomiar in vivo zmian w neuroprzekaźnikach zewnątrzkomórkowych podczas naturalnie nagradzających zachowań u samic chomików syryjskich

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Poznaj metodę mikrofluidycznej RT-qPCR do analizy ekspresji genów w pojedynczych neuronach i komórkach glejowych. Technika ta umożliwia badanie neurozapalnych mechanizmów uzależnienia z wysoką czułością.

Badanie czynników wpływających na antynagrodę w zachowaniach uzależniających za pomocą anatomicznie specyficznych metod ekspresji genów jednokomórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Badanie czynników wpływających na antynagrodę w zachowaniach uzależniających za pomocą anatomicznie specyficznych metod ekspresji genów jednokomórkowych

Przeglądaj więcej filmów