Badanie czynników wpływających na antynagrodę w zachowaniach uzależniających za pomocą anatomicznie specyficznych metod ekspresji genów jednokomórkowych
4 sierpnia 2022
Połączenie mikrodysekcji laserowej i mikroprzepływowego RT-qPCR zapewnia anatomiczną i biotechniczną specyfikę pomiaru transkryptomu w pojedynczych neuronach i gleju. Zastosowanie kreatywnych metod z systemowym podejściem biologicznym do chorób psychicznych może prowadzić do przełomów w zrozumieniu i leczeniu, takich jak hipoteza neurozapalenia i nagrody w uzależnieniu.
Protokół jest bardzo czuły i umożliwia wysokoprzepustowe przechwytywanie profilu ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki. Technika ta zapewnia zarówno anatomiczną swoistość przestrzenną, jak i molekularną w rozdzielczości pojedynczej komórki. Po pobraniu mózgu, wybraniu pojedynczych komórek i przygotowaniu mRNA, wstrzyknij płyn z linii kontrolnej do chipa qPCR w celu przygotowania.
Włóż chip qPCR do mieszalnika mikroprzepływowego. Wybierz skrypt Prime i uruchom program. Po zakończeniu programu należy wyjąć zagruntowany chip qPCR i odpipetować sześć mikrolitrów reakcji z płytki próbki PCR do odpowiedniego dołka na próbkę w zagruntowanym chipie qPCR.
Teraz odpipetuj sześć mikrolitrów reakcji z płytki testowej PCR do odpowiedniego dołka testowego w zagruntowanym chipie qPCR. Następnie włóż chip do mieszalnika mikroprzepływowego. Wybierz skrypt Load Mix i uruchom program.
Włącz mikroprzepływową platformę RT-qPCR i rozgrzej żarówkę. Wyjmij chip qPCR z mieszalnika mikroprzepływowego i odklej naklejkę ochronną od spodu chipa. Otwórz mikroprzepływową platformę RT-qPCR i załaduj chip qPCR do platformy.
Uruchom oprogramowanie do zbierania danych, klikając Rozpocznij nowy przebieg. Sprawdź kod kreskowy chipa i typ chipa. Następnie kliknij Dalej.
Wybierz plik uruchamiania chipa i przeglądaj lokalizację pliku dla magazynu zbierania danych. Następnie kliknij Typ aplikacji i wybierz Ekspresja genów. Wybierz ROX jako odniesienie pasywne, pojedynczą sondę i EVAGreen jako typ sondy.
Kliknij, aby wybrać program cykli termicznych i wybierz Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. Plik pcl. Pobierz oprogramowanie do analizy danych.
Uruchom oprogramowanie, aby przeanalizować mikroprzepływowy eksperyment RT-qPCR. Kliknij Chip Run i otwórz ChipRun. bml , który został utworzony przez eksperymentatora.
Pojawi się okno wyświetlające szczegóły eksperymentu, w tym pasywne odniesienie, sondę i program termiczny PCR. Na karcie Chip Explorer (Eksplorator wiórów) kliknij opcję Sample Plate Setup (Ustawienia płytki próbki) i utwórz nowy szablon płytki próbki. Skopiuj i wklej przykładowe etykiety do arkusza kalkulacyjnego oprogramowania zgodnie z projektem eksperymentalnym.
Wprowadź nazwę próbki i stężenie RNA używane dla próbek wzorcowych. Teraz zmapuj przykładową konfigurację, klikając mapę w menu zadań i wybierając SBS96-Left.dsp. Następnie wybierz opcję Widoki szczegółów, aby zaktualizować te zmiany w pliku, a następnie kliknij przycisk Analizuj.
Wybierz opcję Detector Plate Setup (Konfiguracja płytki detektora) i utwórz nową płytkę testową. Wybierz odpowiedni typ i format kontenera. Wklej nazwy testów zgodnie z projektem eksperymentalnym i kliknij Analizuj.
W okienku ustawień analizy kliknij opcję Użytkownik i ustaw dopasowanie na automatyczne. Teraz ręcznie przejrzyj każdą reakcję w chipie 96x96. Wizualizacja krzywych amplifikacji i topnienia w celu określenia, czy każda reakcja przebiegała zgodnie z oczekiwanym wzorcem qPCR.
Jeśli krzywa wzmocnienia lub topnienia nie zgadza się z tym, czego się oczekuje, ta reakcja zakończy się niepowodzeniem. Po kontroli jakości wyeksportuj dane, wybierając plik, klikając przycisk eksportuj i zapisując zestaw danych jako plik csv. Ponieważ wyeksportowany plik csv zawiera zarówno macierz niepowodzenia pozytywnego, jak i macierz z nieprzetworzonymi wartościami CT, użyj macierzy niepowodzenia, aby zastąpić wszystkie komórki, które zakończyły się niepowodzeniem, w zestawie danych wartością NA. Pobierz najnowszą wersję oprogramowania Open Source R, a następnie pobierz aplikację R Studio.
W przypadku wyśrodkowania mediany użyj oprogramowania R, aby obliczyć medianę wartości CT obliczoną na podstawie wszystkich wartości CT dla pojedynczej próbki, a następnie odejmij wszystkie indywidualne wartości CT od tej mediany, aby uzyskać ujemną wartość CT delta. W celu normalizacji genów porządkowych oblicz średnią ekspresję genów porządkowych dla każdej próbki i użyj tej wartości do odjęcia poszczególnych wartości CT. Aby wygenerować ujemną wartość delta delta CT, uruchom kod w oprogramowaniu R.
Przekaż znormalizowany zestaw danych do języka R i przeanalizuj dane przy użyciu funkcji skalowania, wygeneruj skalowane dane, a następnie użyj funkcji mapy cieplnej języka R lub oddzielnego oprogramowania do wygenerowania mapy cieplnej. Aby uporządkować zestaw danych dla innych funkcji, oblicz korelacje Pearsona między każdym genem, po którym następuje funkcja topnienia. Wyeksportuj i prześlij te dane do oprogramowania sieci korelacji genów.
Neurony wykazywały podwyższoną ekspresję NeuN, a próbki mikrogleju wykazywały znaczącą ekspresję markerów mikrogleju Cd34 i Cx3xr1. Próbki neuronów Th+ wykazały znacznie podwyższoną ekspresję Th w porównaniu z próbkami neuronalnymi Th i mikrogleju. Neurony Th wykazywały znaczną ekspresję Gcg, co sugeruje, że próbki neuronów Th są wzbogacone o neurony, które wykorzystują Glp1 jako neuroprzekaźnik.
Liniowa analiza dyskryminująca wykazała, że te trzy typy komórek miały różne profile ekspresji genów we wszystkich 65 genach. Subfenotypy komórkowe próbek neuronów wzbogaconych w Glp1 za pomocą szeregu czasowego odstawienia alkoholu przedstawiono za pomocą map cieplnych. Subfenotyp A, który wykazuje wysoką ekspresję zapalnego klastra genów jeden, zwiększa się w stosunku w ośmiogodzinnym punkcie czasowym odstawienia i osiąga maksimum po 32 godzinach odstawienia.
Podfenotyp zapalny jest normalizowany do kontroli przez 176 godzin odstawienia. Subfenotyp B, który wykazuje wysoką ekspresję drugiego klastra genów receptora GABA, wykazuje ogólne zahamowanie ekspresji tego klastra genów przez warunek odstawienia 176 godzin. Ekspresję genów w poszczególnych próbkach połączono w średnie, tak aby można było zwizualizować ekspresję klastrów genów i lokalizację białka w tym transkryptie genu w całym szeregu czasowym.
Technikę tę można zastosować do dowolnego systemu biologicznego lub tkanki, aby zrozumieć odpowiedź komórkową na chorobę lub zaburzenie. Ma to na celu rozszyfrowanie odpowiedzi molekularnej w rozdzielczości pojedynczej komórki odnoszącej się do przestrzennej i anatomicznej architektury tkanki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wykorzystuje laserową mikrodysekcję uchwycenia oraz mikrofluidycyjną technikę RT-qPCR do analizy transkryptomów w pojedynczych neuronach i gleju. Podkreślono wysoką czułość i swoistość tej metody, która może przyczynić się do pogłębienia wiedzy na temat chorób psychiatrycznych związanych z neurozapaleniem, w szczególności w kontekście uzależnień.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza transkrypcyjna
- Zaburzenia psychiatryczne
Wstęp
- Zrozumienie wzorców ekspresji RNA w neuronach i komórkach glejowych jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów chorób psychiatrycznych.
- Poprzednim metodom brakowało zarówno specyficzności anatomicznej w przestrzeni, jak i specyficzności molekularnej.
- Neurostan zapalny został powiązany z hipotezą antynagrody w mechanizmach uzależnienia.
Cel badania
- Opracowanie czułej metody przechwytywania profili ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczych komórek.
- Analiza zależności między tymi zmianami molekularnymi a odpowiedziami behawioralnymi w stanach psychiatrycznych.
- Ocena roli neurostanu zapalnego w mechanizmach związanych z uzależnieniem.
Zastosowane metody
- Zastosowano mikrofluidyczną metodę RT-qPCR, umożliwiającą wysokoprzepustowe gromadzenie danych z pojedynczych komórek.
- Pojedyncze komórki zostały wyizolowane z tkanki mózgowej po pobraniu w celu przygotowania i analizy mRNA.
- Wprowadzono szczegółowe protokoły nasycania chipa, gromadzenia danych oraz ich analizy.
- Dane o ekspresji genów zostały zwalidowane i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania statystycznego.
Główne wyniki
- Neurony wykazywały podwyższoną ekspresję NeuN, natomiast mikroglej wykazywał znaczną ekspresję Cd34 i Cx3xr1.
- Zidentyfikowano różne podtypy na podstawie profili ekspresji genów, szczególnie w odpowiedzi na zespół odstawienny i neurozapalenie.
- Na podstawie analiz map ciepła sformułowano kluczowe wnioski dotyczące klastrów genów oraz ich regulacji podczas stresu związanego z odstawieniem.
Wnioski
- Badanie wykazuje, że połączenie tych metod pozwala na głębsze zrozumienie specyficznych dla danego typu komórek reakcji na neurostan zapalny.
- Uzyskane informacje mogą pomóc w opracowaniu celowanych podejść terapeutycznych w przypadku zaburzeń psychiatrycznych związanych z uzależnieniami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Profilowanie ekspresji genów w pojedynczych komórkach z zachowaniem specyficzności anatomicznej umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie odkrywania celów neuropsychiatrycznych, szczególnie w odniesieniu do szlaków uzależnień i układów antynagrody. Podejście to dostarcza wysokorozdzielczych informacji na temat czynników napędzających procesy neurozapalne, co zwiększa pewność prognostyczną na styku patologii molekularnej i fenotypów behawioralnych. Integracja tych metod z wczesnymi etapami poszukiwania nowych leków usprawnia selekcję projektów w portfolio oraz zapewnia ciągłość translacyjną w rozwoju leków oddziałujących na OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących neurostanów zapalnych i mechanizmów antynagrodowych z rozdzielczością do pojedynczych komórek.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie ekspresji genów ze specyficznością anatomiczną i fenotypową.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku celów w ośrodkowym układzie nerwowym zaangażowanych w uzależnienie i zespoły odstawienne.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie rozwoju celów neuropsychiatrycznych.
Przesiewy i opracowanie testów analitycznych
- Przygotowuje zwalidowane systemy komórkowe do późniejszego przesiewania transkryptomicznego i fenotypowego.
- Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki ekspresji genów w celu standaryzacji testów.
- Umożliwia wysokoprzepustową analizę sieci genów w określonych typach komórek.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na szlaki neurozapalne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje odkrycia na poziomie molekularnym z istotnymi dla choroby układami neuroanatomicznymi w modelach uzależnień.
- Zapewnia ciągłość procesu od fazy odkrycia po przedkliniczną walidację biomarkerów neurozapalnych.
- Stanowi podstawę do podejmowania decyzji o rozwoju programów terapeutycznych w obszarze OUN w oparciu o analizę ryzyka.
- Usprawnia rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez mapowanie ekspresji genów w odniesieniu do fenotypów zespołu odstawiennego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając wysokoprzepustową, anatomicznie precyzyjną analizę ekspresji genów w tkankach OUN.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w mechanizmach neurostanu zapalnego i antynagrody.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane o ekspresji genów do opracowywania testów i przesiewania związków.
- Analityka: Generuje skalowalne zbiory danych do analizy sieci, tworzenia map ciepła i statystycznego porównywania fenotypów komórkowych.
- Badania translacyjne: Łączy sygnatury molekularne ze stanami odstawiennymi istotnymi dla choroby i dopasowaniem biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do transkryptomiki pojedynczych komórek w różnych modelach OUN i chorób.
Wpływ Operacyjny i Przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w OUN.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w analizie ekspresji genów na poziomie pojedynczych komórek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod kątem kapitałowym zarządzanie portfolio w badaniach i rozwoju (R&D) w obszarze neuropsychiatrii.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki terapeutyczne w obszarze OUN.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie laserowej mikrodysekcji (LCM) oraz mikrofluidycznych platform RT-qPCR.
- Wymaga rozbudowanej infrastruktury analitycznej do wysokoprzepustowego przetwarzania danych i analizy sieciowej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i normalizacji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda możliwa do adaptacji w różnych tkankach OUN i modelach chorobowych po odpowiedniej optymalizacji.
- Zależna od dostępu do specjalistycznej aparatury oraz wsparcia bioinformatycznego.
