Name: In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj metodę rekonstrukcji cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych. Technika ta umożliwia tworzenie biomimetycznych struktur błon komórkowych z wysoką wydajnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy finansowanie ARO MURI W911NF-14-1-0403 dla M.P.M., National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 dla M.P.M., National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 oraz Human Frontiers Science Program (HFSP) grant numer RGY0073/2018 dla M.P.M. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy ARO, NIH lub HFSP. S.C. potwierdza owocne dyskusje z V. Yadavem, C. Muresanem i S. Amirim.

1. Przygotowanie i roztworów białkowych
<ol>
	<li>Przygotować wodny wewnętrzny bufor niepolimeryzacyjny (INP) o całkowitej objętości 5 ml, mieszając 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sacharozy i 0,2 mM ATP.</li>
	<li>Przygotować mieszankę białkową (PM), dodając białka do buforu INP w temperaturze 4 °C o następujących stężeniach: 11,2 μM niefluorescencyjnej G-aktyny, 2,8 μM aktyny znakowanej fluorescencyjnie i 0,24 μM Arp2/3 (tabela materiałów). Aby utworzyć warstwę F-aktyny, dodaj 100 nM żelsoliny, 4 μM kofiliny i 2,2 μM VCA-His do PM. W ramach eksperymentu kontrolnego zastąp PM barwnikiem fluorescencyjnym o stężeniu 100 μg/ml (tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotować wodny bufor do polimeryzacji wewnętrznej (IP) (wodny) w całkowitej objętości 5 ml, mieszając 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP i 80 mM sacharozy.</li>
	<li>Przygotować bufor końcowy (FB), mieszając bufor INP (zawierający PM) i bufor IP w stosunku objętościowym 1:1, aby uzyskać wewnętrzny roztwór wodny o całkowitej objętości 30 μl, który zostanie zamknięty w liposomie.</li>
	<li>Przygotować wodny bufor zewnętrzny (OB) o całkowitej objętości 150 μl, mieszając 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glukozy i 0,1 mg/ml β-kazeiny. 
	UWAGA: Osmolarność OB można regulować za pomocą glukozy, aby zapewnić, że ciśnienie osmotyczne OB jest nieco większe niż FB (20-60 mOsm). Gęstość FB powinna być nieco wyższa niż OB.</li>
</ol>
2. Przygotowanie liposomów w oparciu o techniki emulsji odwróconej
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę lipidów i olejów
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl 25 mg/ml L-α-fosfatydylocholiny (niefluorescencyjny PC jaj, zwany również EPC, zawierający 1% DHPE) do szklanej fiolki. Odparować chloroform z argonem, pozostawiając suchy, stały film lipidowy (2,5 mg) na dnie fiolki.
		<ol>
			<li>Aby utworzyć warstwę F-aktyny, należy dodać sól niklu sukcynylo-1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-{[n(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacetynowy] sukcynylo} soli niklowej (DOGS-NTA-Ni) w stosunku 10:1 EPC do DOGS-NTA-Ni i wymieszać przed odparowaniem chloroformu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodać 2 ml oleju mineralnego i sonikować mieszaninę lipidów i oleju w temperaturze pokojowej w kąpieli przez 1 godzinę w celu ponownego zawieszenia lipidów. 
		UWAGA: Mieszanina lipidów i oleju po sonikacji może być przechowywana przez 1 tydzień w temperaturze 4 °C. Przed użyciem zaleca się ponowne sonikację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować końcowy bufor w emulsji olejowej (FB/olej) do przygotowania jednowarstwowych kropelek lipidów zawierających interesujące białko.
	<ol>
		<li>Do 100 μl mieszaniny lipidowo-olejowej pobranej w plastikowej tubie dodaj 10 μl FB. Upewnij się, że FB jest w jednej kropli.</li>
		<li>Za pomocą szklanej strzykawki narysuj mieszaninę lipid-olej-FB i delikatnie zasysaj w górę i w dół wiele razy, aby ją zemulgować; najpierw narysuj niewielką ilość mieszaniny lipidów i olejów, a następnie kroplę FB, umieszczając końcówkę strzykawki na obrzeżach kropli, aby rozbić ją na drobne kropelki. Powtarzaj aspirację w górę iw dół, aż powstanie biaława i mętna emulsja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 30 μl OB w osobnej plastikowej tubie. Umieść 30 μl mieszaniny lipidów i oleju na wierzchu OB i pozostaw na ~ 10 minut, aby wytworzyć monowarstwę lipidową na granicy faz. 
	UWAGA: Jeśli lipidy są naładowane lub białko jest włączone, czas trwania tego kroku powinien zostać wydłużony38.</li>
	<li>Przygotuj liposomy
	<ol>
		<li>Ostrożnie dodać 50 μl emulsji FB/olejowej (krok 2.2) do górnej fazy olejowej rurki z kroku 2.3.</li>
		<li>Odwirować plastikową probówkę o sile 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zmieniaj czas i prędkość wirowania, aby zoptymalizować tworzenie liposomów. 
		UWAGA: Po odwirowaniu górna faza olejowa powinna być klarowna, a dolna OB (zawierająca liposomy) powinna być lekko mętna.</li>
		<li>Ostrożnie usuń fazę olejową za pomocą pipety. W razie potrzeby zassać dodatkową objętość. Upewnij się, że nie umieszczasz końcówki pipety z boku probówki, aby uniknąć tworzenia menisku oleju na wierzchu fazy liposomowej.</li>
		<li>Za pomocą nowej pipety powoli wsuń końcówkę pipety w pozostałą dolną fazę i odessaj objętość wodną, aby zebrać liposomy. 
		UWAGA: Lepiej jest stracić objętość niż włączyć olej. Włączenie oleju spowoduje pęknięcie liposomów, a składniki wewnętrzne zostaną uwolnione do zewnętrznego bufora. Odetnij końcówkę pipety, aby zmniejszyć ścinanie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obserwacja mikroskopowa
<ol>
	<li>Wlać 100 μl OB do studzienki komory inkubacyjnej (4-dołkowa płytka zawierająca 12 mm okrągłe szkiełka nakrywkowe). Delikatnie umieść zebrane liposomy (krok 2.4.4) w OB, a następnie umieść kolejne szkiełko nakrywkowe na wierzchu komory. 
	UWAGA: OB zawiera β-kazeinę, która pasywuje powierzchnię szkła i minimalizuje przywieranie między liposomami20.</li>
	<li>Obserwuj liposomy za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu obiektywu zanurzonego w oleju 63x. Użyj linii laserowych 488 nm, 647 nm i 561 nm, aby obserwować odpowiednio fluorescencyjnie znakowany lipid, kapsułkowany barwnik fluorescencyjny i kapsułkowaną aktynę znakowaną fluorescencyjnie. Uchwyć interesujące Cię klatki i zapisz obrazy w formacie TIFF.</li>
	<li>Przetwarzaj i analizuj obrazy w ImageJ/Fiji39. Dla nowych użytkowników ImageJ/Fiji dostępny jest samouczek online (patrz Spis materiałów).
	<ol>
		<li>Otwórz plik TIFF za pomocą oprogramowania ImageJ/Fiji.</li>
		<li>Przejdź do opcji Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast. Dostosuj jasność i kontrast obrazu do żądanej skali, dostosowując ustawienia Minimum i Maksimum oraz suwaki Jasność i Kontrast.</li>
		<li>Kliknij narzędzie Zaznaczanie prostokąta na pasku narzędzi i wybierz obszar zainteresowania (ROI). Przejdź do opcji Image > Crop, aby przyciąć ROI.</li>
		<li>Przejdź do pozycji Analizuj > ustaw skalę. W wyskakującym okienku wprowadź 1.0 w polu Pixel Aspect Ratio (Współczynnik proporcji pikseli) i ustaw μm jako jednostkę długości. W polu Odległość w pikselach wprowadź szerokość obrazu w pikselach. W polu Znana odległość wprowadź rzeczywistą szerokość obrazu w mikronach.</li>
		<li>Aby zmierzyć rozmiar liposomu, Korzystając z narzędzia Zaznaczanie owalu na pasku narzędzi, narysuj okrąg wzdłuż krawędzi liposomu. Przejdź do opcji Analizuj > Zmierz, aby zmierzyć obszar okręgu, na podstawie którego można obliczyć średnicę liposomu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

O powodzeniu wysokiej wydajności liposomów podczas procesu przygotowania decyduje kilka kluczowych kroków. Aby całkowicie rozpuścić film lipidowy w oleju, próbka musi być poddana sonikacji, aż film lipidowy na dnie szklanej fiolki całkowicie zniknie. Po sonikacji, mieszanina lipid-olej musi być przechowywana przez noc w temperaturze pokojowej w ciemnych warunkach, aby cząsteczki lipidów mogły się dalej rozproszyć29. Mieszaninę można przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia. Podczas przygotowyw...

Cytoszkielet aktynowy odgrywa fundamentalną rolę w konstruowaniu wewnątrzkomórkowej architektury komórki poprzez koordynację kurczliwości na poziomie molekularnym i generowanie siły1,2,3. W rezultacie, pośredniczy w wielu istotnych czynnościach komórkowych, w tym w deformacji komórek4,5, division6, migration7,8 i adhesion9. Rekonstrukcja in vitro sieci aktynowych zyskała ogromne zainteresowanie w ostatnich latach10,11,12,13,14,15,16,17. Celem rekonstytucji jest zbudowanie minimalnego modelu komórki pozbawionego złożonej regulacji biochemicznej, która istnieje w żywych komórkach. Zapewnia to kontrolowane środowisko do badania określonych aktywności wewnątrzkomórkowych i ułatwia identyfikację i analizę różnych składników cytoszkieletu aktynowego 18,19. Co więcej, enkapsulacja sieci aktynowych in vitro wewnątrz fosfolipidowych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV, liposomy) zapewnia ograniczoną, ale odkształcalną przestrzeń z półprzepuszczalną granicą. Naśladuje fizjologiczne i mechaniczne mikrośrodowisko maszynerii aktynowej w komórce9,20,21,22.
Wśród różnych metod przygotowania liposomów, metoda hydratacji filmu lipidowego (znana również jako metoda pęcznienia) jest jedną z najwcześniejszych technik23. Suchy film lipidowy nawadnia się z dodatkiem, tworząc błoniaste pęcherzyki, które ostatecznie stają się pęcherzykami24. Aby wytworzyć większe pęcherzyki z wyższą wydajnością, ulepszona metoda rozwijająca się od metody hydratacji filmu, znana jako metoda elektroformacji25, stosuje pole elektryczne prądu przemiennego, aby skutecznie promować proces hydratacji26. Głównymi ograniczeniami tych opartych na hydratacji metod enkapsulacji aktyny jest to, że mają niską skuteczność enkapsulacji wysoce skoncentrowanych białek i są kompatybilne tylko z określonymi składami lipidów24. Dla porównania, technika odwróconej emulsji ma mniej ograniczeń dotyczących składników lipidowych i stężeń białek20,27,28,29. W tej metodzie mieszanina białek do kapsułkowania jest dodawana do wewnętrznego buforu wodnego, który jest następnie emulgowany w roztworze oleju mineralnego zawierającym lipidy, tworząc jednowarstwowe kropelki lipidowe. Jednowarstwowe kropelki lipidów przechodzą następnie przez inny interfejs lipid/olej-woda poprzez wirowanie, tworząc dwuwarstwowe pęcherzyki lipidowe (liposomy). Technika ta okazała się jedną z najbardziej skutecznych strategii enkapsulacji aktyny24,30. Oddzielnie istnieje kilka metod urządzeń mikroprzepływowych, w tym pulsacyjne natryskiwanie31,32, przejściowe wyrzucanie membrany33 oraz metoda cDICE34. Podobieństwa między metodą emulsji odwróconej a metodą mikroprzepływową polegają na zastosowaniu rozpuszczalnika lipidowego (oleju) oraz wprowadzeniu granicy faz lipid/olej-woda w celu utworzenia zewnętrznej ulotki liposomów. W przeciwieństwie do tego, wytwarzanie liposomów metodą mikroprzepływową wymaga ustawienia urządzeń mikroprzepływowych i towarzyszy mu olej uwięziony między dwoma płatkami dwuwarstwy, co wymaga dodatkowego kroku do usunięcia oleju35.
W tym manuskrypcie użyliśmy techniki odwróconej emulsji do przygotowania liposomów otaczających spolimeryzowaną sieć F-aktyny, jak to było wcześniej używane22. Mieszaninę białek do enkapsulacji umieszczono najpierw w buforze o warunkach niepolimeryzujących, aby utrzymać aktynę w postaci globularnej (G). Cały proces przeprowadzono w temperaturze 4 °C, aby zapobiec wczesnej polimeryzacji aktyny, która została później wywołana przez ogrzanie próbki do temperatury pokojowej. Po osiągnięciu temperatury pokojowej aktyna polimeryzuje do postaci nitkowatej (F). Do wewnętrznego wodnego roztworu buforowego można dodać różne białka wiążące aktynę, aby zbadać funkcje i właściwości białka, dostarczając w ten sposób dalszych informacji na temat jego interakcji z siecią aktynową i powierzchnią błony. Metodę tę można również zastosować do enkapsulacji różnych interesujących białek36 i dużych obiektów (mikrocząstek, samobieżnych mikropływaków itp.) o rozmiarach zbliżonych do końcowych liposomów28,37.

<table><tbody><tr><td>Sól niklu 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-{[n(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacetu]sukcynylo} sól niklu (DOGS-NTA-Ni)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>231615773</td><td>Nikel Lipid</td></tr><tr><td>1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan</td><td>Sigma</td><td>D27802-25G</td><td>DABCO</td></tr><tr><td>Białko aktynowe (>99% czystości): mięśnie szkieletowe królika</td><td>Cytoszkielet, Inc</td><td>AKL99-D</td><td>niefluorescencyjna G-aktyna</td></tr><tr><td>Białko aktyny (rodamina): mięśnie szkieletowe królika</td><td>Cytoszkielet, Inc</td><td>AR05</td><td>znakowana fluorescencyjnie aktyna</td></tr><tr><td>Adenozyna 5&-trifosforan Hydrat soli disodowej</td><td>Sigma</td><td>A2383-10G</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 barwnik</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>barwnik fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Andor iQ3</td><td>Oprogramowanie sterujące i akwizycyjne Andor Technologies</td><td></td><td></td> do mikroskopu konfokalnego</tr><tr><td>Arp2/3 Kompleks białkowy: Cytoszkielet mózgu świni</td>, <td>Inc</td><td>RP01P-A</td><td>Arp 2/3</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>10035048</td><td>Komory CaCl2</td></tr><tr><td>Chamlide (4-dołkowe na okrągłe szkiełko nakrywkowe 12 mm)</td><td>Komora inkubacyjna</td> <td>Quorum Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Białko kofiliny: ludzki rekombinowany</td><td>cytoszkielet, Inc</td><td>CF01-C</td><td>kofilina</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny (63-krotny obiektyw zanurzeniowy w oleju)</td><td>Andor Technologies</td><td>LEICA DMi8</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>glukoza</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>DOT Naukowy&nbsp;</td><td>DSD11000-10</td><td>Białko</td></tr><tr><td>żelsoliny DTT: rekombinowany cytoszkielet Homo Sapiens</td><td>, Inc</td><td>HPG6</td><td>gelsolin</td></tr><tr><td>Hamilton 1750 Strzykawka gazoszczelna, 500 i mikro; L, igła cementowana, 22 G, końcówka stożkowa 2"</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-07940-53</td><td>szklana strzykawka</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td></td><td></td><td>https://imagej.net/tutorials/</td></tr> <tr><td>L-alfa-fosfatydylocholina</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>97281442</td><td>EPC</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>7786303</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Olej mineralny, BioReagent, do biologii molekularnej, olej lekki</td><td>Sigma</td><td>8042475</td><td>olej mineralny</td></tr><tr><td>Fragment N-WASP WWA (aa400&ndash; 501, VCA-His)</td><td></td><td></td><td>VCA-His jest oczyszczany przy użyciu protokołu laboratoryjnego. Protokół może zostać dostarczony na uzasadnione żądanie</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>O12650</td><td>DHPE</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>7447407</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td>sacharoza</td></tr> <tr><td>i beta;-kazeina z mleka krowiego</td><td>Sigma</td><td>C6905-250MG</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Cytoszkielet aktynowy, główna mechaniczna maszyneria w komórce, pośredniczy w wielu istotnych fizycznych czynnościach komórkowych, w tym deformacji komórek, podziałach, migracjach i adhezji. Jednak badanie dynamiki i struktury sieci aktynowej in vivo jest skomplikowane ze względu na biochemiczną i genetyczną regulację w żywych komórkach. Aby zbudować minimalny model pozbawiony wewnątrzkomórkowej regulacji biochemicznej, aktyna jest zamknięta w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV, zwanych również liposomami). Liposomy biomimetyczne są wielkości komórki i ułatwiają ilościowy wgląd w mechaniczne i dynamiczne właściwości sieci cytoszkieletów, otwierając realną drogę dla oddolnej biologii syntetycznej. Do generowania liposomów do enkapsulacji stosuje się metodę emulsji odwróconej (zwaną również metodą przenoszenia emulsji), która jest jedną z najbardziej udanych technik kapsułkowania złożonych roztworów w liposomach w celu przygotowania różnych systemów naśladujących komórki. W tej metodzie do wewnętrznego buforu dodaje się mieszaninę interesujących białek, które są następnie emulgowane w roztworze oleju mineralnego zawierającym fosfolipidy, tworząc jednowarstwowe kropelki lipidów. Pożądane liposomy są generowane z jednowarstwowych kropelek lipidów przechodzących przez granicę lipidów/olej-woda. Metoda ta umożliwia enkapsulację skoncentrowanych polimerów aktyny do liposomów z pożądanymi składnikami lipidowymi, torując drogę do odtworzenia in vitro biomimikującej sieci cytoszkieletu.

Przygotowanie liposomów w oparciu o technikę odwróconej emulsji zostało przedstawione graficznie i schematycznie na Rysunku 1.
Najpierw przygotowano puste liposomy (~5-50 µm o średnicy), składających się z fosfolipidu (EPC) i lipidu fluorescencyjnego (DHPE). W ramach eksperymentu kontrolnego wewnątrz pustych liposomów zamknięto jasny, dalekoczerwony barwnik fluorescencyjny. To, czy na obwodzie kropli utworzyła się pomyślnie monowarstwa lipidowa, można było ustalić...

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Miara ta buduje minimalny model komórki pozbawiony skomplikowanych regulacji biochemicznych. Zastosowana technika może generować wysoką wydajność liposomów i mieć wysoką skuteczność enkapsulacji białek cytoszkieletu. Środek ten może być stosowany do kapsułkowania różnych białek i dużych obiektów, takich jak mikrocząsteczki i samodzielnie przygotowujących się mikropływaków.Osoba ma trudności ze zwiększeniem wydajności liposomu przez pierwsze kilka prób. Zaleca się regularne omawianie sekcji manuskryptu, aby uzyskać więcej szczegółów w celu zwiększenia wydajności. Na początek przygotuj wodny wewnętrzny bufor niepolimeryzacyjny o łącznej objętości pięciu mililitrów, mieszając 0,1 milimolowego CACL dwa, 10 milimolowe HEPES, jeden milimolowy DTT, 0,5 milimolowego DAPCO, 320 milimolową sacharozę i 0,2 milimolowego ATP.Przygotuj mieszankę białek, dodając białka do wewnętrznego buforu niepolimeryzacyjnego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby utworzyć warstwę aktyny, dodaj do mieszanki białkowej 100 nanomolowych gelelliny, cztery mikromolowe kaszlaliny i 2,2 mikromolowe VCA HEZ. W ramach eksperymentu kontrolnego zastąp mieszankę białek 100 mikrogramami na mililitr barwnika fluorescencyjnego.Przygotować wodny wewnętrzny bufor polimeryzacyjny w całkowitej objętości pięciu mililitrów, mieszając 100 milimolowy chlorek potasu. Czteromilimolowy chlorek magnezu, 10-milimolowy HEPES, jeden milimolowy DTT, 0,5-milimolowy DABCO, 10-milimolowy ATP i 80-milimolowa sacharoza. Przygotuj końcowy bufor, mieszając wewnętrzny bufor niepolimeryzacyjny i wewnętrzny bufor polimeryzacyjny w stosunku objętościowym jeden do jednego, aby uzyskać wewnętrzny roztwór wodny o łącznej objętości 30 mikrolitrów, który zostanie zamknięty w liposomie.Przygotować wodny bufor zewnętrzny o łącznej objętości 150 mikrolitrów, mieszając 10 milimolowych HEPES, 50 milimolowych chlorków potasu, dwóch milimolowych chlorków magnezu, 0,2 milimolowego chlorku wapnia, dwóch milimolowych ATP, jednego milimolowego DTT, 0,5 milimolowego DAPCO, 212 milimolowych glukozy i 0,1 miligrama na mililitr obudowy beta. Aby przygotować mieszaninę olejków lipidowych, zacznij od dodania 100 mikrolitrów po 25 miligramów na mililitr EGGPC do szklanej fiolki. Odparować chloroform za pomocą argonu, pozostawiając suchy, stały film lipidowy na dnie fiolki.Aby utworzyć warstwę aktyny, dodaj lipid niklu w stosunku 10 do jednego EGGPC do lipidu niklu i wymieszaj przed odparowaniem chloroformu. Dodaj dwa mililitry oleju mineralnego. Odparować chloroform i poddać sonikę mieszaniny olejków lipidowych w temperaturze pokojowej w kąpieli przez jedną godzinę w celu ponownego zawieszenia lipidów.Przygotować końcowy bufor w emulsji olejowej do przygotowania jednowarstwowych kropelek lipidów zawierających interesujące białko. Zacznij od pobrania 100 mikrolitrów mieszaniny olejów lipidowych do plastikowej probówki i dodaj 10 mikrolitrów końcowego buforu do mieszaniny olejów lipidowych. Upewnij się, że końcowy bufor znajduje się w jednej kropli.Za pomocą szklanej strzykawki narysuj najpierw niewielką ilość mieszaniny olejków lipidowych, a następnie ostatnią kropelkę buforową, umieszczając końcówkę strzykawki na obrzeżach kropli, aby rozbić ją na drobne kropelki. Delikatnie zasysaj wiele razy w górę iw dół, aż utworzy się mętna emulsja. Umieść 30 mikrolitrów zewnętrznego buforu w osobnej plastikowej tubie.Umieść 30 mikrolitrów mieszaniny olejów lipidowych na wierzchu zewnętrznego bufora i pozostaw na około 10 minut, aby wytworzyć monowarstwę lipidową na granicy faz. Aby przygotować liposomy, ostrożnie dodaj 50 mikrolitrów końcowej emulsji oleju buforowego do górnej fazy olejowej probówki. Odwiruj plastikową probówkę o temperaturze 100 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zmieniaj czas i prędkość wirowania, aby zoptymalizować tworzenie liposomów. W razie potrzeby ostrożnie usunąć fazę olejową za pomocą pipety, zassać dodatkową objętość. Upewnij się, że nie umieszczasz końcówki pipety z boku probówki, aby uniknąć tworzenia menisku oleju na wierzchu fazy liposomowej.Za pomocą nowej pipety odetnij końcówkę pipety. Powoli włóż pipetę do pozostałej dolnej fazy i odessaj objętość wodną, aby zebrać liposomy. Wlać 100 mikrolitrów zewnętrznego buforu do studzienki komory inkubacyjnej.Delikatnie umieść zebrane liposomy w zewnętrznym buforze, a następnie umieść kolejne szkiełko nakrywkowe na górze komory. Obserwuj liposomy za pomocą mikroskopu konfokalnego za pomocą obiektywu zanurzeniowego z olejkiem 63x. Użyj linii laserowych o długości 488, 647 i 561 nanometrów.Aby obserwować odpowiednio znakowany fluorescencyjnie lipid, kapsułkowany barwnik fluorescencyjny i kapsułkowaną fluorescencyjnie znakowaną aktynę. Uchwyć interesujące Cię klatki i zapisz obrazy w formacie TIF. Przetwarzaj i analizuj obrazy na obrazie J.Zacznij od otwarcia pliku TIF za pomocą oprogramowania obrazu J.Przejdź do obrazu, a następnie kliknij dostosuj. Następnie jasność kontrastu, dostosuj jasność i kontrast obrazu do żądanej skali, dostosowując ustawienia minimalne i maksymalne oraz suwaki jasności i kontrastu. Kliknij narzędzie do zaznaczania prostokątów na pasku narzędzi i wybierz interesujący Cię obszar.Przejdź do obrazu, a następnie kliknij przytnij, aby przyciąć ROI. Przejdź do sekcji analizy, a następnie kliknij pozycję ustaw skalę. W wyskakującym okienku wprowadź 1.0 w polu proporcji pikseli i ustaw mikrometr jako jednostkę długości.W polu odległości w pikselach wprowadź szerokość obrazu w pikselach. W polu znana odległość wprowadź rzeczywistą szerokość obrazu w mikronach. Aby zmierzyć rozmiar liposomu, za pomocą narzędzia do zaznaczania owalu na pasku narzędzi narysuj okrąg wzdłuż krawędzi liposomu.Przejdź do analizy, a następnie kliknij zmierz, aby zmierzyć obszar koła, na podstawie którego można obliczyć średnicę liposomu. Pomyślne wytwarzanie liposomów jest weryfikowane poprzez wizualizację cienkiego okrągłego pierścienia, który jest zieloną fluorescencyjną dwuwarstwą lipidową. Pod laserem o długości fali 488 nanometrów przy użyciu mikroskopii konfokalnej w celu potwierdzenia enkapsulacji barwnika fluorescencyjnego.Środowisko wewnętrzne liposomów powinno być jednolicie fluorescencyjne pod laserem o długości 647 nanometrów. Powstawanie liposomów można uwidocznić za pomocą cienkich zielonych okrągłych pierścieni. Odtworzony afekt w sieciach wewnątrz liposomów jest niejednorodny, objawiający się jako rozgałęzione struktury sieciowe włókien aktynowych.Architektura rozgałęzień została wywołana przez wprowadzenie kompleksu ARP dwa trzy, który jednocześnie kontroluje zarodkowanie i rozgałęzianie włókien aktynowych, wraz z VCA HEZ. Cienka, ale gęsto rozgałęziona warstwa aktyny tworzy się na wewnętrznej płeszce dwuwarstwy liposomów, którą można uwidocznić jako fluorescencyjną. Mieszanina końcowego buforu lipidowego audio musi być zwykle pompowana tam iz powrotem przez szklaną strzykawkę, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza.Po przetworzeniu mieszanina musi być biaława. Technika ta utorowała drogę do zbudowania minimalistycznego modelu komórki, pozbawionego skomplikowanych regulacji biochemicznych. Dzięki temu systemowi naśladującemu komórki naukowcy mogą badać mechaniczne i dynamiczne właściwości białek cytoszkieletu, nukleatora i silnika molekularnego.

in-vitro-reconstitution-actin-cytoskeleton-inside-giant-unilamellar

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Wczesne funkcje endosomów zależą od polimeryzacji F-aktyny. W tym miejscu opisujemy oparty na mikroskopii test in vitro, który odtwarza zarodkowanie i polimeryzację F-aktyny na wczesnych błonach endosomalnych w probówkach, czyniąc w ten sposób tę złożoną serię reakcji podatną na manipulacje biochemiczne i genetyczne.

In vitro Polimeryzacja F-aktyny na wczesnych endosomach

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Ten artykuł przedstawia prostą metodę szybkiego wytwarzania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych z zamkniętymi białkami cytoszkieletu. Metoda ta okazuje się przydatna do oddolnego odtwarzania struktur cytoszkieletu w zamknięciu i interakcjach cytoszkielet-błona.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Ten protokół opisuje metodę odwróconej emulsji używaną do hermetyzacji systemu ekspresji bezkomórkowej (CFE) w gigantycznym pęcherzyku jednowarstwowym (GUV) w celu zbadania syntezy i włączenia modelowego białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej.

Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

Ten artykuł przedstawia metodę przygotowywania złożonych wielowarstwowo-jednowarstwowych pęcherzyków (cGUVs) o strukturze pęcherzyka w pęcherzyku, z dostosowaną przewodnością elektryczną w regionach wewnętrznym, pierścieniowym i zewnętrznym. Elektroformacja syntetyzuje proste GUV, które są przekształcane w stomatocyty i cGUV za pomocą wstrząsu osmotycznego, zapewniając wartościowy model do badania biofizyki komórek z jądrami.

Synteza złożonych gigantycznych jednowarstwowych pęcherzyków: Biomimetyczny model komórek z jądrem

Ten artykuł przedstawia prostą jednoetapową rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzyków. Metodę tę można uogólnić i zastosować do enkapsulacji lub uwięzienia szerokiego zakresu biomolekuł.

Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

Tutaj opisujemy proste metody przygotowania pęcherzyków, enkapsulacji maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej oraz monitorowania produkcji białek. Powstałe w ten sposób systemy bezkomórkowe mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do budowania coraz bardziej złożonych mimik komórkowych.

Enkapsulacja bezkomórkowej maszynerii transkrypcyjnej i translacyjnej w pęcherzykach do budowy mimiki komórkowej

Poznaj metodę rekonstrukcji cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych. Technika ta umożliwia tworzenie biomimetycznych struktur błon komórkowych z wysoką wydajnością.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Przeglądaj więcej filmów