Name: Regeneracja nabłonka jelit w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę badania regeneracji nabłonka jelit po napromieniowaniu gamma u myszy. Technika śledzenia liniowej pozwala analizować aktywację i migrację komórek macierzystych, dostarczając wiedzy o mechanizmach odbudowy tkanek jelitowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Stony Brook Cancer Center Histology Research Core za fachową pomoc w przygotowaniu próbek tkanek oraz Division of Laboratory Animal Resources na Uniwersytecie Stony Brook za pomoc w opiece nad zwierzętami i obchodzeniu się z nimi. Praca ta została wsparta grantami z National Institutes of Health DK124342 przyznanymi Agnieszce B. Białkowskiej oraz DK052230 dr. Vincentowi W. Yangowi.

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Protokół ten opisuje solidny i powtarzalny model obrażeń popromiennych. Pozwala na precyzyjną analizę zmian w nabłonku jelitowym w ciągu 7 dni po urazie. Co ważne, wybrane punkty czasowe odzwierciedlają kluczowe etapy urazu i charakteryzują się wyraźnymi zmianami w jelicie (faza urazu, apoptozy, regeneracji i normalizacji)60. Ten model napromieniania został ustalony i dokładnie oceniony, wykazując odpowiedni przejaw uszkodzenia naśladującego ten, którego doświadczają pacjenci poddawani radioterapi...

Nabłonek ludzkiego jelita pokryłby w przybliżeniu powierzchnię połowy boiska do badmintona, gdyby był całkowicie płaski1. Zamiast tego ta pojedyncza warstwa komórek oddzielająca ludzi od zawartości ich jelit jest zagęszczona w serię przypominających palce wypustek, kosmków i wgłębień, krypt, które maksymalizują powierzchnię jelit. Komórki nabłonka różnicują się wzdłuż osi krypta-kosmki. Biopsy składają się głównie z enterocytów wchłaniających składniki odżywcze, komórek kubkowych wydzielających śluz i komórek enteroendokrynnych wytwarzających hormony, podczas gdy krypty składają się głównie z komórek Panetha wytwarzających defensynę, aktywnych i rezerwowych komórek macierzystych oraz komórek progenitorowych2,3,4,5. Co więcej, dwukierunkowa komunikacja, jaką te komórki mają z komórkami zrębu i komórkami odpornościowymi leżącego poniżej przedziału mezenchymalnego i mikrobiotą światła, generuje złożoną sieć interakcji, która utrzymuje homeostazę jelit i ma kluczowe znaczenie dla powrotu do zdrowia po urazie6,7,8.
Nabłonek jelitowy jest najszybciej samoodnawiającą się tkanką w ludzkim ciele, z szybkością wymiany 2-6 dni9,10,11. Podczas homeostazy aktywne komórki macierzyste u podstawy krypt jelitowych (komórki kolumnowe podstawy krypty), oznaczone ekspresją receptora 5 sprzężonego z białkiem G bogatym w leucynę (LGR5), szybko się dzielą i dostarczają komórki progenitorowe, które różnicują się we wszystkie inne linie nabłonka jelitowego. Jednak ze względu na wysoki współczynnik mitotyki, aktywne komórki macierzyste i ich bezpośredni przodkowie są szczególnie wrażliwe na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem gamma i ulegają apoptozie po napromieniowaniu5,12,13,14. Po ich utracie, rezerwowe komórki macierzyste i komórki niemacierzyste (subpopulacja komórek progenitorowych i niektóre kończnie zróżnicowane komórki) w kryptach jelitowych ulegają aktywacji i uzupełniają podstawowy przedział krypty, który może następnie odtworzyć populacje komórek kosmków, a tym samym zregenerować nabłonek jelitowy15. Korzystając z technik śledzenia linii, wiele grup badawczych wykazało, że rezerwowe (spoczynkowe) komórki macierzyste są zdolne do wspierania regeneracji po utracie aktywnych komórek macierzystych13,16,17,18,19,20,21,22. Komórki te charakteryzują się obecnością onkogenu białka 1 kompleksu polycomb (Bmi1), genu odwrotnej transkryptazy telomerazy myszy (mTert), homeoboxu chmielu (Hopx) i bogatego w leucynę genu białka powtórzeń 1 (Lrig1). Ponadto wykazano, że komórki inne niż komórki macierzyste są zdolne do uzupełniania krypt jelitowych po urazie23,24,25,26,27,28,29,30,31. W szczególności wykazano, że komórki progenitorowe komórek wydzielniczych i enterocytów ulegają oddyferencjonowaniu po urazie, powracają do komórek macierzystych i wspomagają regenerację nabłonka jelitowego. Ostatnie badania zidentyfikowały komórki wykazujące ekspresję wielu markerów, które mają zdolność nabywania cech podobnych do łodygi po urazie (takich jak DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Co zaskakujące, Yu i wsp. wykazali, że nawet dojrzałe komórki Panetha (LYZ+) mogą przyczyniać się do regeneracji jelit37. Ponadto, oprócz wywołania apoptozy komórek nabłonka jelitowego i zakłócenia funkcji bariery nabłonkowej, napromieniowanie powoduje dysbiozę flory jelitowej, aktywację komórek odpornościowych i zainicjowanie odpowiedzi prozapalnej oraz aktywację komórek mezenchymalnych i zrębowych38,39.
Promieniowanie gamma jest cennym narzędziem terapeutycznym w leczeniu raka, szczególnie w przypadku guzów jelita grubego40. Jednak napromienianie znacząco wpływa na homeostazę jelit poprzez indukowanie uszkodzenia komórek, co prowadzi do apoptozy. Narażenie na promieniowanie powoduje liczne zaburzenia, które spowalniają powrót pacjenta do zdrowia i objawiają się uszkodzeniem błony śluzowej i stanem zapalnym w ostrej fazie oraz biegunką, nietrzymaniem moczu, krwawieniem i długotrwałym bólem brzucha. Ten wachlarz objawów jest określany jako toksyczność promieniowania żołądkowo-jelitowego. Dodatkowo, progresja zwłóknienia przezściennego i/lub stwardnienia naczyniowego wywołana promieniowaniem może objawić się dopiero po latach od leczenia38,41. Równocześnie z samym urazem, promieniowanie indukuje odpowiedź naprawczą w komórkach jelitowych, która aktywuje szlaki sygnałowe odpowiedzialne za inicjowanie i koordynowanie regeneracji42. Choroba jelita cienkiego wywołana promieniowaniem może pochodzić z radioterapii miednicy lub jamy brzusznej dostarczanej innym narządom (takim jak szyjka macicy, prostata, trzustka, odbytnica)41,43,44,45,46. Uszkodzenie jelit spowodowane napromienianiem jest zatem poważnym problemem klinicznym, a lepsze zrozumienie wynikającej z tego patofizjologii prawdopodobnie przyczyni się do rozwoju interwencji mających na celu złagodzenie powikłań żołądkowo-jelitowych związanych z radioterapią. Istnieją inne techniki, które pozwalają na zbadanie regeneracji nabłonka jelitowego poza promieniowaniem. Opracowano transgeniczne i chemiczne modele myszy do badania stanu zapalnego i jego późniejszej regeneracji47. Siarczan sodu dekstranu (DSS) wywołuje stan zapalny w jelicie i prowadzi do rozwoju cech podobnych do nieswoistych zapaleń jelit48. Połączenie leczenia DSS z prorakotwórczym związkiem azoksymetanu (AOM) może spowodować rozwój raka związanego z zapaleniem jelita grubego48,49. Uraz wywołany reperfuzją niedokrwienną jest kolejną metodą stosowaną do badania potencjału regeneracyjnego nabłonka jelitowego. Ta technika wymaga doświadczenia i wiedzy chirurgicznej50. Co więcej, wyżej wymienione techniki powodują inne rodzaje urazów niż promieniowanie i mogą prowadzić do zaangażowania różnych mechanizmów regeneracji. Ponadto modele te są czasochłonne, a technika promieniowania jest dość krótka. Ostatnio metody in vitro wykorzystujące enteroidy i kolonoidy generowane z jelita grubego i okrężnicy są stosowane w połączeniu z uszkodzeniem popromiennym do badania mechanizmów regeneracji jelit51,52. Jednak techniki te nie oddają w pełni modelowanego przez nie narządu53,54.
Przedstawiony protokół zawiera opis mysiego modelu uszkodzenia spowodowanego promieniowaniem gamma w połączeniu z modelem genetycznym, który po leczeniu tamoksyfenem pozwala na śledzenie linii pochodzących z populacji rezerwowych komórek macierzystych (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Model ten wykorzystuje napromieniowanie całego ciała 12 Gy, które indukuje wystarczająco znaczące uszkodzenie jelit, aby aktywować rezerwowe komórki macierzyste, jednocześnie umożliwiając późniejsze badanie zdolności regeneracyjnych jelit w ciągu 7 dni od urazu55.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>309659-16G Igły wielokrotnego użytku do karmienia małych zwierząt: Prosta</td> igła <td>VWR</td><td>20068-630-27G</td><td></td></tr> <tr><td>x 1/2"</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>305109-28G x 1/2" Monoject 1mL strzykawka insulinowa</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr> 1188128012-5-etynylo-2<tr><td>&prime;-deoksyurydyna (EdU)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc284628A</td><td>10 mg/ml w sterylnym DMSO: woda (1:4 v/v), podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20& deg; C</td></tr><tr><td>Azer Naukowy&nbsp; 10% neutralna buforowana formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213-B6.129X1-GT</td><td></td></tr><tr><td>(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>Szczep laboratoryjny Jackson</td><td>#:006148</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-BMI1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td><td>Szczep laboratoryjny Jackson</td><td>#:010531</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej frakcja V, szok termiczny</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak anty-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10638-Olej</td><td></td></tr> <tr><td>kukurydziany</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267-Komora</td><td></td></tr> <tr><td>demaskatorska</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012-Dimetylosulfotlenek</td><td></td></tr> <tr><td>(DMSO)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td>światłoczuła</td></tr><tr><td>proteinaza bez DNaz K</td><td>Invitrogen</td><td>C10618H</td><td>rozcieńczony 25x w DPBS</td></tr><tr><td>Osioł anty-kurczak AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher Scientific Mikroskop</td> fluorescencyjny <td>S176</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 90i Jasne i fluorescencyjne światło, z obiektywami: 10X, 20X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Aqueous Mounting Medium</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Cell 40 Exactor</td><td>Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0,759 Gy min-1</td></tr><tr><td>Goat anty-królik AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny, skrzela nr 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Mikrotom rotacyjny firmy Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-900-668</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrat (bis-benzymid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3569</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-603-252-In</td><td></td></tr> <tr><td>situ Zestaw do wykrywania śmierci komórek, Fluoresceina (Roche)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Węglan litu (proszek/certyfikowany ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>L119-500</td><td>0,5 g/1 l dH2O</td></tr><tr><td>Luer-Lok Strzykawka sterylna, jednorazowa, 10 ml</td><td>VWR</td><td>89215-218-metanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Products&nbsp; Alkohol etylowy, 200 PROOF</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Kwas octowy klasy ACS</td><td>Capitol Scientific</td><td>AAP-281000ACSCSLT-Królik</td><td></td></tr> <tr><td>anty-Ki67</td><td>BioCare Medical</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Medium montażowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator-Genie firmy Scientific Industries do pieczenia szkiełek pod kątem 65 stopni</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny cytrynian sodu</td> Zestaw preparacyjny ze stali nierdzewnej <td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprowadnice</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus [rozmiar: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR&</td><td>nbsp; 48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>30 mg/ml w sterylnym oleju kukurydzianym, najlepiej świeży lub krótkotrwały do przechowywania w temperaturze -20&deg; C, światłoczułe</td></tr><tr><td>uchwyty Tissue-Tek 24-Slide z odłączanym uchwytem</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Krawędź akumulatora&nbsp; Ostrza niskoprofilowe</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Ręczny zestaw do barwienia szkiełek</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia Tissue-Tek, zielone z pokrywką</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia Tissue-Tek, białe z pokrywką</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do obróbki Unisette</td><td>VWR</td><td>87002-292-VWR</td><td></td></tr> <tr><td>Okulary Micro Cover</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

regeneracja nabłonka jelit w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

Nabłonek jelitowy składa się z pojedynczej warstwy komórek, ale zawiera wiele typów komórek ostatecznie zróżnicowanych, które są generowane przez aktywną proliferację jelitowych komórek macierzystych znajdujących się na dnie krypt jelitowych. Jednak w przypadku ostrego uszkodzenia jelit te aktywne jelitowe komórki macierzyste ulegają śmierci komórkowej. Napromienianie promieniami gamma jest szeroko stosowaną metodą leczenia raka jelita grubego, która, choć skuteczna terapeutycznie, ma efekt uboczny w postaci wyczerpania aktywnej puli komórek macierzystych. Rzeczywiście, pacjenci często doświadczają zespołu promieniowania żołądkowo-jelitowego podczas radioterapii, częściowo z powodu aktywnego wyczerpania komórek macierzystych. Utrata aktywnych jelitowych komórek macierzystych w kryptach jelitowych aktywuje pulę typowo spoczynkowych rezerwowych jelitowych komórek macierzystych i indukuje odróżnicowanie komórek wydzielniczych i prekursorowych enterocytów. Gdyby nie te komórki, nabłonek jelitowy nie byłby w stanie zregenerować się po radioterapii i innych tego typu poważnych uszkodzeniach tkanek. Nowe postępy w technologiach śledzenia linii umożliwiają śledzenie aktywacji, różnicowania i migracji komórek podczas regeneracji i zostały z powodzeniem wykorzystane do badania tego zjawiska w jelitach. Badanie to ma na celu przedstawienie metody analizy komórek w nabłonku jelitowym myszy po urazie popromiennym.

Zastosowanie całkowitego naświetlania ciała (TBI) dawką 12 Gy w połączeniu z mysią genetyczną analizą śledzenia linii komórkowych pozwala na dokładną analizę skutków uszkodzeń radiacyjnych w jelitach. Na początku myszy Bmi1-CreER;Rosa26eYFP otrzymały pojedynczy wtrysk tamoksyfenu, który indukuje ekspresję wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (EYFP) w populacji rezerwowych komórek macierzystych Bmi1+. Dwa dni po wtrysku tamoksyfenu myszy poddano naświetlaniu lub procedurz...

Przewód pokarmowy jest jednym z najbardziej wrażliwych organów na uszkodzenia podczas radioterapeutycznego leczenia raka. Jest to jednocześnie układ narządów o jednej z najwyższych zdolności regeneracyjnych po takich zniewagach. Przedstawiony protokół opisuje skuteczną metodę badania zdolności regeneracyjnych nabłonka jelitowego.

Regeneracja nabłonka jelit w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

Napromienianie promieniami gamma jest szeroko stosowaną metodą leczenia raka jelita grubego. I chociaż jest skuteczny terapeutycznie, ma negatywny wpływ na przewód pokarmowy. Przedstawiony protokół opisuje skuteczną metodę badania aktywacji, różnicowania i migracji komórek podczas regeneracji po urazie popromiennym.Protokół ten opisuje solidny i powtarzalny model obrażeń popromiennych. Co ważne, model ten pozwala śledzić los komórek jelitowych po urazie, a tym samym zapewnia lepsze zrozumienie zdolności regeneracyjnych określonej subpopulacji komórek. Technika ta może wykorzystywać odrębne modele zwierzęce śledzące linię do badania zachowania w czasie rzeczywistym i interakcji różnych subpopulacji komórek po urazie.Niewielkie modyfikacje tego protokołu powinny pozwolić na zbadanie związków między mikrobiotą a różnymi populacjami komórek nabłonkowych, zrębowych i odpornościowych po urazie popromiennym. Na początek ponownie zawiesić tamoksyfen w proszku w sterylnym oleju kukurydzianym w stężeniu 30 mikrogramów na mikrolitr. Sonikuj przez trzy minuty w 30-sekundowych cyklach włączania i wyłączania z amplitudą 60%.Mieszaj na obracanie w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj EdU, dodając sterylne DMSO do proszku EdU. Dodaj 1/5 całkowitej objętości i powoli dodawaj pozostałą objętość sterylnej ultraczystej wody.Po całkowitym rozpuszczeniu podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Przygotuj odczynniki do pobierania i utrwalania tkanek, takie jak 70% etanol w wodzie, DPBS schłodzony do czterech stopni Celsjusza, bufor utrwalający Bouina i 10% buforowana formalina. Następnie przygotuj niezbędny sprzęt, taki jak zestaw do preparacji myszy, szalki Petriego, igła do zgłębnika o rozmiarze 16 przymocowana do 10-mililitrowej strzykawki i kasety histologiczne.Dwa dni przed ekspozycją na promieniowanie gamma należy przygotować zwierzęta doświadczalne do wstrzyknięcia tamoksyfenu. Zważ każde zwierzę i oblicz wymaganą dawkę. Zdezynfekuj okolice brzucha 70% etanolem.Następnie należy podać pojedynczą dawkę tamoksyfenu dootrzewnowo za pomocą igły o rozmiarze 27 dołączonej do jednomililitrowej strzykawki w celu wywołania rekombinacji za pośrednictwem Cre. Obserwacje zwierząt należy prowadzić przez następne 48 godzin, aby wykluczyć potencjalną toksyczność tamoksyfenu. Po 48 godzinach przenieść zwierzęta do pomieszczenia do napromieniania.Zdezynfekować komorę próbki w promienniku promieniowania gamma 70% roztworem etanolu. Umieścić matę chłonną i zwierzęta w komorze na próbkę. Umieść pokrywę i zamknij komorę.Zaprogramuj promiennik gamma tak, aby wystawiał zwierzęta na 12 szarych promieniowania całego ciała. Następnie przekręć kluczyk do pozycji początkowej i naciśnij start, aby rozpocząć ekspozycję. Opuść pomieszczenie na czas aktywnej ekspozycji.Po upływie ustawionego czasu urządzenie zatrzyma się automatycznie i zacznie emitować sygnał dźwiękowy. Wyłącz maszynę, przekręcając kluczyk do pozycji zatrzymania. Otwórz komorę na próbkę i zdejmij pokrywę.Przenieś zwierzęta do klatki i zdezynfekuj komorę na próbki 70% etanolem. Przenieś zwierzęta z powrotem do konwencjonalnego pomieszczenia i obserwuj ich stan po leczeniu. Codziennie monitoruj wagę zwierząt.Trzy godziny przed planowaną eutanazją należy zdezynfekować okolice brzucha i wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 100 mikrolitrów roztworu podstawowego EdU za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 28G. Po eutanazji zwierzęcia należy pobrać proksymalne jelita w różnych punktach czasowych po napromieniowaniu. Wypreparuj bliższą część jelita cienkiego i usuń przyczepione tkanki.Przepłucz tkankę zimnym DPBS za pomocą prostej igły do karmienia o rozmiarze 16 dołączonej do 10-mililitrowej strzykawki i utrwal tkankę za pomocą buforu utrwalającego Bouina. Przetnij jelita otwarte wzdłużnie i zwiń proksymalne jelita techniką szwajcarską. Umieść tkanki w kasecie histologicznej w pojemniku z 10% buforowaną formaliną i inkubuj przez 24 do 48 godzin w temperaturze pokojowej.Po inkubacji przenieś kasety histologiczne do 70% etanolu i zanurz tkankę w parafinie. Po zatopieniu umieść kasety histologiczne na lodzie na co najmniej godzinę. Następnie wytnij poziome odcinki o grubości pięciu mikronów za pomocą mikrotomu.Przenieś skrawki tkanek do łaźni wodnej rozgrzanej do 45 stopni Celsjusza i umieść skrawki na naładowanych szkiełkach. Pozostaw szkiełka na noc na stojaku w temperaturze pokojowej do wyschnięcia. Obrazy hematoksyliny i eozyny próbek jelita cienkiego wykazały homeostatyczny nabłonek jelitowy w godzinie zero, po którym nastąpiła utrata komórek w przedziałach krypty podczas fazy apoptozy.Po tym nastąpiła faza regeneracyjna, w której wysoce proliferacyjne komórki zasiedliły krypty, prowadząc do fazy normalizacji do siódmego dnia. Śledzenie linii przez EYFP wykazało, że podczas homeostazy komórki pochodzące z dodatnich rezerwowych komórek macierzystych Bmi1 były ograniczone do plus czterech do plus sześciu pozycji w kryptach. Barwienie EdU i Ki-67 wykazało normalną homeostazę jelitową u myszy napromieniowanych pozorem, rozciągającą się od aktywnych komórek macierzystych przez strefę amplifikacji tranzytu.Podczas fazy apoptozy liczba komórek EYFP-dodatnich zmniejszyła się, czemu towarzyszyła utrata komórek proliferacyjnych spowodowana uszkodzeniem popromiennym. W fazie regeneracyjnej zaobserwowano aktywację rezerwowych komórek macierzystych i szybką proliferację komórek Bmi1-dodatnich. Dalsza proliferacja i migracja przywróciły integralność nabłonka jelitowego.Barwienie TUNEL wykazało, że komórki apoptotyczne są nieobecne podczas homeostazy. Wzrost barwienia TUNEL zaobserwowano pod koniec fazy apoptozy. Podczas fazy regeneracyjnej barwienie TUNEL stale zmniejszało się w regenerujących się kryptach i było prawie nieobecne, gdy krypty się normalizowały.Technikę tę można połączyć z sekwencjonowaniem RNA, sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki, sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją lub analizą proteomiczną w celu uzyskania bardziej dogłębnej wiedzy na temat roli określonych linii komórkowych podczas regeneracji jelit po urazie. Naukowcy mogą badać interakcje między mikrobiotą a populacjami komórek nabłonkowych, zrębowych i odpornościowych w regeneracji jelit, aby poszerzyć wiedzę na temat zdolności regeneracyjnych nabłonka jelitowego.

intestinal-epithelial-regeneration-in-response-to-ionizing-irradiation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) u ludzi jest częstym problemem klinicznym spowodowanym uszkodzeniem komórek nabłonkowych tworzących nefrony nerkowe, a AKI wiąże się z wysoką śmiertelnością na poziomie 50-70%1. Po zniszczeniu komórek nabłonkowych nefrony mają ograniczoną zdolność do regeneracji, choć mechanizmy i ograniczenia sterujące tym zjawiskiem pozostają słabo poznane. W niniejszym artykule wideo opisujemy naszą technikę celowanej ablacji laserowej komórek nefronu nerki w nerce zarodka ryby...

Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Opisano skuteczną metodę przeszczepiania tkanek o określonym i powtarzalnym rozmiarze pomiędzy planariami. Uwzględniono również opis tego, w jaki sposób technikę unieruchamiania stosowaną podczas transplantacji można zaadaptować, przy użyciu osłon ołowianych, do częściowego napromieniowania żywych zwierząt.

Unieruchomienie planarii, częściowe napromieniowanie i transplantacja tkanek

Przedstawiamy protokół do badania wzajemnych oddziaływań między napromieniowanym promieniowaniem rentgenowskim Caco-2 a komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC). Protokół rozpoczyna się od napromieniania Caco-2 i ustanowienia kokultury z PBMC; następnie regularnie przez 48 godzin mierzy się przeznabłonkowy opór elektryczny, a western blot wykonuje się zarówno w Caco-2, jak i PBMC.

Metoda wspólnej hodowli do badania przesłuchów między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia ważnych punktów końcowych i markerów proliferacyjnych uszkodzenia jelita cienkiego i hiperproliferacji kompensacyjnej przy użyciu modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią. Demonstrujemy wykrywanie proliferujących komórek za pomocą markera specyficznego dla cyklu komórkowego i przy użyciu masy jelita cienkiego, głębokości krypty i wysokości kosmków jako punktów końcowych.

Ważne punkty końcowe i markery proliferacyjne do oceny uszkodzenia jelita cienkiego i adaptacji przy użyciu mysiego modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Wykorzystanie trójwymiarowych kultur organotypowych do wizualizacji morfologii i funkcjonalnych markerów gruczołów ślinowych może dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów uszkodzenia tkanek po promieniowaniu. Opisano tutaj protokół cięcia, hodowli, napromieniania, barwienia i obrazowania skrawków gruczołów ślinowych o grubości 50–90 μm przed i po ekspozycji na promieniowanie jonizujące.

Radioterapia kultur organotypowych z modeli gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych Kluczowe cechy in vivo

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Tutaj prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów jelita po zranieniu wywołanym laserem. Poprzez wystawienie jelita myszy na działanie lasera wielofotonowego, utrata jednej lub wielu krypt jest indukowana lokalnie. Poprzez wielokrotne obrazowanie uszkodzonego obszaru przez miesiące, uchwycona jest dynamika regeneracji jelit w czasie rzeczywistym.

Ablacja laserowa i mikroskopia przyżyteczna w celu zbadania przebudowy jelit

Opisujemy protokół szczegółowo opisujący izolację mysich krypt okrężnicy w celu opracowania 3-wymiarowych kolonoidów. Ustalone okokrody mogą być następnie ostatecznie różnicowane, aby odzwierciedlić skład komórkowy nabłonka gospodarza przed otrzymaniem prowokacji zapalnej lub skierowaniem do utworzenia monowarstwy nabłonka.

Badanie nabłonkowego wpływu zapalenia jelit in vitro na ustalone mysie kolonoidy

Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.

Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Poznaj metodę badania regeneracji nabłonka jelit po napromieniowaniu gamma u myszy. Technika śledzenia liniowej pozwala analizować aktywację i migrację komórek macierzystych, dostarczając wiedzy o mechanizmach odbudowy tkanek jelitowych.

Regeneracja nabłonka jelit w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Przeglądaj więcej filmów