Name: Półautomatyczna i powtarzalna metoda biologiczna do ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Poznaj półautomatyczną metodę ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro przy użyciu ludzkich komórek mięśniowych gładkich naczyń krwionośnych. Technika fluorescencyjna zwiększa czułość pomiarów i umożliwia badania longitudinalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały sfinansowane przez programy Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy grantowej Marie Skłodowska-Curie nr 722609 i 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Badania te były wspierane przez BioSPX. WJ-D otrzymał dofinansowanie od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) TRR219 - numer identyfikacyjny projektu 322900939 i numer identyfikacyjny projektu 403041552

1. Wysiewanie, utrzymanie i indukcja zwapnienia komórek
<ol>
	<li>Do hodowli komórek pierwotnych użyj komory z laminarnym przepływem powietrza, rękawic i sterylnego sprzętu. Dezynfekuj ręce i miejsce pracy przed i po wykonaniu jakichkolwiek prac. Traktować wszystkie pierwotne komórki i pożywki hodowlane jako potencjalne zagrożenie biologiczne, chyba że udowodniono inaczej. Najlepiej autoklawować nadmiar komórek i pożywek przed utylizacją. Nie inaktywuj chemicznie i nie sterylizuj w autoklawie, ponieważ spowoduje to uwolnienie toksycznych oparów.</li>
	<li>Hodowla hVSMC na niepowlekanych płytkach do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Rutynowo utrzymuj hVSMC w pożywce wzrostowej składającej się z pożywki M199 uzupełnionej 10%-20% FBS i 1% Pen/Strep i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Podziel komórki przy zbieganiu 70%-90%.
	<ol>
		<li>Aby podzielić, umyj hVSMC 2x za pomocą PBS. Dodać trypsynę i inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdzić, czy komórki nie oderwały się pod mikroskopem.</li>
		<li>Hamować reakcję trypsyny, dodając pożywkę zawierającą surowicę. Odwirować komórki przy 350 x g przez 4 minuty i ponownie zawiesić osad w pożywce konserwującej. hVSMC są zgodne ze schematem podziału 1:2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby rozpocząć eksperyment zwapnienia, przygotuj komórki zgodnie z instrukcjami do podziału (Krok 1.4.1). Po ponownym zawieszeniu należy policzyć komórki i nasiona na 48-dołkowej płytce o gęstości 10-15 x 103 komórki/cm2. Wysiewaj komórki, unikając korzystania z zewnętrznych dołków, zgodnie z zaleceniami na rysunku uzupełniającym 1.</li>
	<li>Pozwól komórkom przylegać i regenerować się przez 24 godziny (przez noc) podczas inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Delikatnie umyj komórki 2x PBS, ostrożnie odsysając wszystkie pozostałe PBS po 2popłuczeniu.</li>
	<li>Delikatnie dodać pożywkę do zwapnienia i dalej inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Pożywka do zwapnienia musi zawierać bodziec zwapnieniowy, znakowany fluorescencyjnie fetuiną-A (np. białkiem czerwonej fluorescencji [RFP]) (1 μg/ml) oraz barwnik jądrowy HOECHST 33342 (0,1 μg/ml) lub podobny żywy fluorescencyjny barwnik jądrowy. Nie używaj DAPI, ponieważ jest on nieprzepuszczalny.</li>
	<li>Sprawdzaj codziennie pod mikroskopem świetlnym, aż do momentu wystąpienia zwapnienia. 
	UWAGA: Uwagi dotyczące hodowli komórkowej i utrzymania hVMSC znajdują się w pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>
2. Wykrywanie zwapnień za pomocą obrazowania
UWAGA: Poniższy protokół zawiera ogólne kroki, które należy podjąć podczas przygotowania, obrazowania i analizy danych. Zrzuty ekranu zawierające instrukcje dotyczące każdego kroku przy użyciu zautomatyzowanej platformy obrazowania i odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów) znajdują się w Pliku Uzupełniającym 2 i Pliku Uzupełniającym 3. Do zastosowania tego protokołu można użyć innych instrumentów do obrazowania i narzędzi do przetwarzania obrazu. Jednak wielokrotne obrazowanie w tym samym miejscu w każdym odwiercie ma kluczowe znaczenie dla uzyskania miarodajnych danych. Stworzenie protokołu zwapnienia i ponownego wykorzystania obrazu na każdym etapie obrazowania jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych wyników. Przy pierwszym zastosowaniu tej metody wykonaj poniższe czynności, aby przygotować się przed obrazowaniem.
<ol>
	<li>Konfiguracja protokołu
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie, a następnie wybierz Protokoły i Utwórz nowy.</li>
		<li>Wybierz opcję Procedura i kliknij przycisk Ustaw temperaturę. W wyskakującym okienku ustaw temperaturę na 37 °C, a gradient na 1 °C, a następnie kliknij przycisk OK. Wybierz typ blachy z menu rozwijanego. Dodaj krok obrazowania, klikając pozycję Obraz. Wybierz odwrócony imager i kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Dodaj trzy kanały obrazowania i ustaw je na DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) i jasne pole. Zaznacz pole Montaż i ustaw żądaną liczbę i lokalizację obrazów. 2 x 2 dla płytki 48-dołkowej jest częstym wyborem. Zmień nakładanie się, aby zapewnić lepsze pokrycie każdej studni. Wybierz, które studnie mają zostać zobrazowane. Otworzy się nowe okno, w którym można wybrać interesujące Cię studnie.</li>
		<li>Kliknij przycisk Opcje ostrości, aby ustawić tryb ostrości. Otworzy się nowe okno. Ustaw każdy kanał indywidualnie. Zazwyczaj studnie są automatycznie skupiane na kanale "DAPI". Ustaw wszystkie inne kanały na Stała wysokość ogniskowej od pierwszego kanału i ustaw, klikając OK. Zamknij okno.</li>
		<li>Rozpocznij kroki wstępnego ustawiania redukcji danych, klikając opcję Redukcja danych i wybierając opcję Wstępne przetwarzanie obrazu. Ustawienie tego kroku zmniejsza tło fluorescencyjne. Zaakceptuj ustawienia domyślne, wybierając przycisk OK. Zostanie utworzony nowy zestaw obrazów z prefiksem "TSF". Oryginalne obrazy zostaną zachowane.</li>
		<li>Skonfiguruj krok, aby policzyć komórki, wybierając pozycję Analiza komórkowa. Wybierz obrazy TSF DAPI z menu rozwijanego Kanał. Ustaw dalsze szczegóły po wykonaniu obrazowania. Ten krok można również uznać za redukcję danych; Zawsze upewnij się, że zachowujesz oryginalne obrazy.</li>
		<li>Przygotuj analizę sygnału zapytania ofertowego (zwapnienia), wybierając opcję Statystyki. W wyskakującym oknie oznacz etykietę Krok i wybierz TSF RFP jako kanał wejściowy. Zaznacz pola Górna wartość i Dolna wartość. Zaznacz pole Całkowita powierzchnia na dolnej liście. Wybierz opcję Brak w kolumnie Color Effect (Efekt kolorystyczny). W wyskakującym okienku kliknij Niestandardowe i zaznacz pole Tło. Spowoduje to oznaczenie kolorami wyników od niskiego do wysokiego w celu łatwej oceny. Naciśnij przycisk OK.</li>
		<li>Aby uzyskać rzetelny odczyt, znormalizuj sygnał RFP na komórkę. W ten sposób całkowity obszar jest dzielony na komórkę. Aby skonfigurować ten krok, naciśnij Proporcje po lewej stronie. W wyskakującym oknie wybierz z menu rozwijanego opcję Wprowadzanie danych 1 Kwantyfikacja zapytania ofertowego: Całkowita powierzchnia. Następnie wybierz opcję Liczba komórek jako dane wejściowe 2.</li>
		<li>Na koniec wybierz nazwę nowego zestawu danych i ponownie naciśnij OK i OK. Wybierz opcję Color Effect (Efekt kolorystyczny) zgodnie z wcześniejszym opisem. W lewym górnym rogu wybierz pozycję Plik i zapisz plik jako protokół (typ pliku .prt).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Codziennie po wystąpieniu pierwszego zwapnienia
	<ol>
		<li>Dla każdego punktu czasowego powtórz te kroki. W oprogramowaniu startowym naciśnij Czytaj teraz i Istniejący protokół.... Wybierz protokół, który został utworzony w poprzednim kroku. Program poprosi o zapisanie eksperymentu. Można to zrobić na tym etapie, ale także w każdym późniejszym kroku ręcznie, klikając przycisk Zapisz w lewym górnym rogu.</li>
		<li>Pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o poczekanie, aż system się nagrzeje. Włącz regulator gazu CO2 i ustaw go na 5%.</li>
		<li>Gdy system osiągnie ustawioną temperaturę, pojawi się monit o włożenie płytki i przeczytanie. Naciśnij przycisk Anuluj. Dzieje się tak dlatego, że dla każdego punktu czasowego ekspozycja każdego fluorochromu musi być dostosowana indywidualnie.</li>
		<li>Płytkę należy przetransportować z inkubatora do imagera w bezpiecznym pudełku, które jest odporne na stłuczenie i rozlanie oraz jest zgodne z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi transportu żywych komórek w razie wypadku. Umieść płytkę w czytniku płytek.</li>
		<li>Po anulowaniu kliknij Procedura. W wyskakującym oknie wybierz opcję Pre-Set Imaging Step (Wstępnie ustawiony krok obrazowania). Najpierw dostosuj ostrość i ekspozycję na kanale DAPI. Usuń zaznaczenie pola Auto Exposure (Automatyczna ekspozycja) przy wszystkich kanałach. Następnie kliknij ikonę mikroskopu obok kanału DAPI. Otworzy się nowe okno.</li>
		<li>Wybierz studnię, na której chcesz się skupić. Na tym etapie użyj studzienki o średnim lub wysokim zwapnieniu. Jeśli sygnał jest już widoczny, najpierw kliknij Autofokus, a następnie Autoekspozycja. Jeśli nie, najpierw zwiększ ekspozycję i powtórz Autofokus i Autoekspozycja. W razie potrzeby ekspozycję można dostosować ręcznie, wybierając menu rozwijane ekspozycji. Sprawdź ustawienia w wielu dołkach. Gdy będziesz zadowolony, zapisz ustawienia.</li>
		<li>Dostosuj ekspozycję w ten sam sposób dla wszystkich kanałów. 
		UWAGA: Nie skupiaj się na innych kanałach; Dostosuj tylko ekspozycję. Płaszczyzna ostrości powinna być taka sama dla wszystkich kanałów.</li>
		<li>Zamknij okno procedury. Wybierz zielony przycisk Czytaj teraz na górnym pasku zadań. Zapisz eksperyment zgodnie ze wskazówkami oprogramowania. 
		UWAGA: Oprogramowanie będzie teraz automatycznie odczytywać wszystkie wybrane studnie w wybranych ustawieniach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
UWAGA: Szczegółowe zrzuty ekranu dotyczące sposobu przeprowadzania analizy danych za pomocą zautomatyzowanej platformy obrazowania i odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (szczegóły w Tabeli Materiałów), znajdują się w Pliku Uzupełniającym 4. W przypadku korzystania z alternatywnych przyrządów do obrazowania lub oprogramowania analitycznego, obrazy powinny zostać wyeksportowane i przetworzone wsadowo, upewniając się, że ekspozycja, próg fluorescencji lub intensywność są dostosowane równomiernie dla wszystkich obrazów w zestawie danych porównawczych.
<ol>
	<li>Podczas gdy system odczytuje płytę, wszystkie obrazy są automatycznie przetwarzane w tle. Dostosuj ustawienia liczby komórek, wybierając obrazy TSF DAPI do wyświetlenia. Wybierz wybraną studnię, klikając dwukrotnie. Pojawi się nowe okno. Wybierz jeden z obrazów.</li>
	<li>Wybierz kartę Analiza. W oknie podręcznym wybierz opcję Analiza komórkowa: Liczba komórek. Kliknij przycisk OK. Usuń zaznaczenie kanałów RFP i jasnego pola. Zaznacz pole Podświetl obiekty.</li>
	<li>Kliknij przycisk Opcje, aby otworzyć menu. Dostosuj próg wielkości i intensywności tak, aby obejmował wszystkie jądra, ale wykluczał szczątki. Kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Zastosuj zmiany w lewym dolnym rogu, aby przenieść ustawienia również do wszystkich innych obrazów.</li>
	<li>W podobny sposób, jak poprzednio, wybierz studzienkę i obraz o średnim lub wysokim stopniu zwapnienia, aby jak najlepiej dostosować stosunek sygnału do szumu; kliknij kartę Analiza w menu zadań.
	<ol>
		<li>Tym razem wybierz Statystyki obrazu. Usuń zaznaczenie kanału DAPI i jasnego pola. Kliknij przycisk Opcje, aby otworzyć menu. Zaznacz pole Wartości odstające od normy. Dostosuj górną i dolną wartość progu. Licz sygnał tylko wtedy, gdy znajduje się nad tłem i wyklucz, jeśli są tam szczątki/artefakty.</li>
		<li>Aby ustawić niesubiektywną wartość progową dla sygnału nad tłem, wybierz narzędzie linii z paska zadań. Pojawi się okno. Narysuj linię przechodzącą przez plamę sygnału, ale pamiętaj, aby uwzględnić również obszar tła. 
		UWAGA: W wyskakującym okienku pojawi się wykres przedstawiający szczyt reprezentujący sygnał powyżej linii tła. Wartość wysokości piku 25% reprezentuje zalecany próg. Zaleca się również pomiar wielu łatek sygnału, aby zapewnić wybór odpowiedniego progu. Podczas wybierania fragmentów sygnału, wybór regionów o bardzo wysokiej sile sygnału może skutkować progiem, który pomija średnie i/lub niższe sygnały. Dlatego zaleca się wybieranie plam o średnim lub niskim sygnale powyżej tła. Przykłady zbyt wysokich, zbyt niskich i dokładnych progów przedstawiono w pliku uzupełniającym 4.</li>
		<li>Gdy wszystko będzie zadowolone, kliknij OK i Zastosuj zmiany, aby przenieść ustawienia do wszystkich innych studzienek. Sprawdź, czy próg jest dokładnie wybrany w innych studzienkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ustawieniu liczby komórek i progów zapytania ofertowego wyeksportuj dane. Wybierz odpowiednią tabliczkę. W menu rozwijanym można wybrać wiele parametrów do eksportu. Istotne może być liczba komórek, obszar zapytania ofertowego i "obszar/komórka", który jest metryką używaną do porównywania grup. Kliknij przycisk Excel obok menu rozwijanego, aby wyeksportować dane bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego. 
	UWAGA: W menu rozwijanym obliczone wartości liczby komórek, całkowity obszar sygnału RFP (odzwierciedlający obszar zwapnienia), a także znormalizowany stosunek całkowitej powierzchni sygnału RFP na komórkę można teraz wybrać indywidualnie i wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego. Wyświetlaj wyniki jako stosunek całkowitej powierzchni sygnału RFP na komórkę i wizualizuj (np. wykresy słupkowe). Zastosuj niesparowany test t-Studenta, aby porównać dwie grupy lub niesparowany test ANOVA, aby porównać różne grupy w tym samym punkcie czasowym. Porównywanie tej samej grupy w różnych punktach czasowych może wymagać sparowanej analizy statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+calcium+independently+predicts+incident+premature+coronary+heart+disease+over+measured+cardiovascular+risk+factors%3A+mean+three-year+outcomes+in+the+Prospective+Army+Coronary+Calcium+%28PACC%29+project%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).</li>
<li>Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+calcification%2C+coronary+disease+risk+factors%2C+C-reactive+protein%2C+and+atherosclerotic+cardiovascular+disease+events+the+St.+Francis+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).</li>
<li>Detrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+calcium+as+a+predictor+of+coronary+events+in+four+racial+or+ethnic+groups%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups.</a> New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).</li>
<li>Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+propagation+of+vascular+calcification+is+regulated+by+a+concert+of+platelet-+and+smooth+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36(2018).</li>
<li>Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+arterial+remodeling%3A+focus+on+calcification-related+processes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694(2019).</li>
<li>Mollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+plaque+burden+in+patients+with+stable+and+unstable+coronary+artery+disease+using+multislice+CT+coronary+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22La+Radiologia+Medica%22%5BJournal%5D)">Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography.</a> La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).</li>
<li>Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+positively+remodeled+coronary+artery+lesions+by+multislice+CT+and+its+impact+on+cardiovascular+future+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Egyptian+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events.</a> The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26(2019).</li>
<li>Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multislice+computed+tomographic+coronary+angiography+for+quantitative+assessment+of+culprit+lesions+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).</li>
<li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+calcification+in+end+stage+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Disorders+in+Hemodialysis%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular calcification in end stage renal disease.</a> Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).</li>
<li>Raggi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+calcification+predicts+risk+of+CVD+in+patients+with+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).</li>
<li>Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+smooth+muscle+cells+in+vascular+calcification%3A+implications+in+atherosclerosis+and+arterial+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness.</a> Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).</li>
<li>Yahagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+human+coronary+and+carotid+artery+atherosclerosis+and+vascular+calcification+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).</li>
<li>Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+calcification+in+type-2+diabetes+and+cardiovascular+disease%3A+Integrative+roles+for+OPG%2C+RANKL+and+TRAIL%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL.</a> Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).</li>
<li>Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+and+arterial+stiffening%3A+relevance+in+development%2C+aging%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease.</a> Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).</li>
<li>Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+mechanisms+of+vascular+calcification+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).</li>
<li>Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+models+for+studying+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Research models for studying vascular calcification.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204(2020).</li>
<li>Bowler, M. A., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+aortic+valve+calcification%3A+solidifying+a+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Gitelman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+automated+procedure+for+the+determination+of+calcium+in+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens.</a> Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).</li>
<li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+mediates+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+increased+release+of+Grp78+%28glucose-regulated+protein%2C+78+kDa%29-loaded+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).</li>
<li>Jaminon, A. M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+BioHybrid+assay%3A+combining+primary+human+vascular+smooth+muscle+cells+and+blood+to+measure+vascular+calcification+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity.</a> Cells. 10 (8), 2097(2021).</li>
<li>Reynolds, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+vascular+smooth+muscle+cells+undergo+vesicle-mediated+calcification+in+response+to+changes+in+extracellular+calcium+and+phosphate+concentrations%3A+a+potential+mechanism+for+accelerated+vascular+calcification+in+ESRD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).</li>
<li>Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+coronary+artery+calcification+and+its+association+with+mortality%2C+cardiovascular+events+in+patients+with+chronic+kidney+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+Failure%22%5BJournal%5D)">Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis.</a> Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).</li>
<li>Willems, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ucma%2FGRP+inhibits+phosphate-induced+vascular+smooth+muscle+cell+calcification+via+SMAD-dependent+BMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4961(2018).</li>
<li>Furmanik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen-forming+Nox5+links+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+switching+and+extracellular+vesicle-mediated+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification.</a> Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).</li>
<li>Virtanen, P., Isotupa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+properties+of+alizarin+red+S+for+growing+bone+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anatomica%22%5BJournal%5D)">Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro.</a> Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).</li>
<li>Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+extracellular+calcium+levels+induce+smooth+muscle+cell+matrix+mineralization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro.</a> Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).</li>
<li>Pasch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-based+test+measures+overall+propensity+for+calcification+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).</li>
</ol>

Leon Schurgers otrzymał granty instytucjonalne od firm Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma i IDS. Leon Schurgers posiada udziały w firmie Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent jest współzałożycielem i udziałowcem CALCISCON AG.

W tym manuskrypcie opisano półautomatyczną metodę oznaczania zwapnienia in vitro . W przypadku tej metody należy zoptymalizować trzy krytyczne etapy zwapnienia hVSMC. Po pierwsze, gęstość komórkowa ma kluczowe znaczenie dla rozwoju zwapnienia hVSMC. Niskie zagęszczenie hVSMC spowoduje powolne zwapnienie i śmierć komórki lub jej brak z powodu braku kontaktu między komórkami i stresu, który jest indukowany w warunkach zwapnienia21. Wysokie zagęszczenie komórek powoduje nadmierną konfluencję...

Zwapnienie naczyń krwionośnych (VC) jest niezależnym czynnikiem ryzyka zachorowalności i śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych1,2,3. Długo uważany za pasywny proces chemiczny ektopowego osadzania minerałów, teraz wydaje się modyfikowalną reakcją na gojenie się tkanek, obejmującą aktywny udział różnych komórek, w tym aktywowanych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (hVSMC) jako czynnika napędzającego chorobę4,5. In vivo (in vivo) VC można mierzyć za pomocą wielopunktowej tomografii komputerowej jako oceny obciążenia miażdżycowego6,7,8. Obecnie trwa zmiana paradygmatu, w której nasilenie VC jest uznawane za czynnik ryzyka chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu II, przewlekłej choroby nerek i starzenia się9,10,11,12,13,14,15.
hVSMCs są najliczniejszym typem komórek w układzie sercowo-naczyniowym i głównym czynnikiem w rozwoju VC. Zwapnienie indukowane in vitro hVSMC jest szeroko stosowanym modelem choroby do badania chorób sercowo-naczyniowych16,17. Jednak większość protokołów wykrywania zwapnień in vitro wykorzystuje pomiary punktu końcowego, które mogą ograniczać pozyskiwanie danych, wymagać większego wykorzystania materiału komórkowego i mogą spowolnić badania. Typowe metody wykrywania zwapnienia hVSMC in vitro obejmują test o-krezolftaleiny, który mierzy rozpuszczone osadzanie wapnia w stosunku do białka całkowitego i wymaga lizy komórek18. Stosuje się również barwienie czerwienią alizarynową, które wiąże się bezpośrednio ze złogami wapnia na stałych komórkach lub tkankach19. Badanie zwapnienia hVSMC w czasie za pomocą o-krezolftaleiny lub czerwieni alizarynowej wymaga partii powtórzeń na punkt czasowy, co zwiększa zapotrzebowanie na materiał biologiczny, a co za tym idzie, zwiększa szansę na zmienność.
W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę zastosowania nowatorskiego testu, który wykorzystuje hVSMCs z sondą do obrazowania fluorescencyjnego do określenia progresji VC in vitro, a także funkcjonuje jako pojedynczy test zwapnienia w końcowym stadium. Wcześniej wykazaliśmy, że ten test jest bezpośrednio porównywalny z metodami o-krezolftaleiny i czerwieni alizaryny i może być używany do rozróżniania różnych warunków hodowli20. Oprócz pomiarów w czasie rzeczywistym, test ten może być wykorzystany do określenia skłonności próbek surowicy lub osocza jako markera zastępczego do rozwoju klinicznego VC20. Pomoże to w zastosowaniu strategii biologicznych nauk sercowo-naczyniowych i modelowania chorób. Dalszym zastosowaniem testu może być translacyjny system BioHybrid do oceny ciężkości lub progresji VC na podstawie składników krwi, takich jak surowica lub osocze.

<table><tbody><tr><td>Chlorek wapnia, 93%, bezwodny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>349615000</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-dołkowe przezroczyste płytki studzienne nasączone TC</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 System</td><td>BioTek, Abcoude, Holandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Merck</td><td>F7524-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin-A-Alexa Fluor-546</td><td>Przygotowane we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Gen5 v3.10</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Medium 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, trichlorowodorek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

półautomatyczna i powtarzalna metoda biologiczna do ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro

A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro

Zwapnienie naczyń obejmuje szereg patologii zwyrodnieniowych, w tym stan zapalny, zmiany w fenotypie komórkowym, śmierć komórki i brak inhibitorów zwapnienia, które jednocześnie prowadzą do utraty elastyczności i funkcji naczyń. Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do zachorowalności i śmiertelności w wielu patologiach, w tym przewlekłej chorobie nerek, cukrzycy i miażdżycy. Obecne modele badawcze do badania zwapnienia naczyń krwionośnych są ograniczone i są wykonalne tylko w późnych stadiach rozwoju zwapnienia in vivo. Narzędzia in vitro do badania zwapnienia naczyń wykorzystują pomiary punktu końcowego, zwiększając wymagania wobec materiału biologicznego i ryzykując wprowadzenie zmienności do badań naukowych. Demonstrujemy zastosowanie nowatorskiej sondy znakowanej fluorescencyjnie, która wiąże się z rozwojem zwapnienia in vitro na ludzkich komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych i określa rozwój zwapnienia in vitro w czasie rzeczywistym. W tym protokole opisujemy zastosowanie naszego nowo opracowanego testu zwapnienia, nowatorskiego narzędzia do modelowania chorób, które ma potencjalne zastosowania translacyjne. Przewidujemy, że ten test będzie miał znaczenie w szerszym spektrum badań nad osadzaniem się minerałów, w tym w zastosowaniach w badaniach nad kośćmi, chrząstkami lub zębami.

Wynik obejmuje oryginalne obrazy jąder barwionych HOECHST, zwapnień znakowanych RFP oraz obrazy w świetle przechodzącym. Można wykryć i przeanalizować różne stopnie zwapnienia, od niskiego (Rysunek 2) do wysokiego (Rysunek 3). Zwapnienia można zazwyczaj zidentyfikować jako czarne drobinki w mikroskopii świetlnej (Rysunek 2D oraz Rysunek 3B, strzałki wskazują zwapnienia), co jest przydatne do wstępnej oc...

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Zwapnienie naczyń krwionośnych w znacznym stopniu przyczynia się do obciążenia chorobowością i śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych. Protokół ten opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania wytrącania wapnia za pośrednictwem komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Półautomatyczna i powtarzalna metoda biologiczna do ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro

Vascular calcification involves a series of degenerative pathologies, including inflammation, changes to cellular phenotype, cell death, and the absence ...

Nasza metoda pozwala na pomiar skłonności do zwapnienia próbek pobranych od pacjentów przy użyciu ludzkich komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Przyczyni się to do przyspieszenia badań nad zaburzeniami zwapnienia naczyń krwionośnych, pomagając w opracowaniu nowych terapii. Technika ta wykorzystuje detekcję opartą na fluorescencji, która zwiększa czułość i umożliwia pomiar próbek w czasie, zmniejszając w ten sposób potrzebę powtórzeń i zwiększając ich odporność.Na początek hoduj ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych na niepowlekanych kolbach do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Podziel komórki po osiągnięciu 70 do 90% zbieżności. Aby podzielić, umyj HVSMC dwukrotnie za pomocą PBS.Dodaj trypsynę i inkubuj przez 2 do 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zahamuj reakcję trypsyny, dodając pożywkę zawierającą surowicę. Odwirować komórki przez 4 minuty przy 350 RCF i ponownie zawiesić osad w pożywce konserwacyjnej.Po przygotowaniu komórek do podziału, jak pokazano, policz i zasiej komórki na 48-dołkowej płytce, aby rozpocząć eksperyment zwapnienia. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, delikatnie umyj komórki dwukrotnie PBS, ostrożnie odsysając cały pozostały PBS po drugim płukaniu. Delikatnie dodaj pożywkę do zwapnienia i kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Sprawdzaj codziennie pod mikroskopem świetlnym, aż do momentu wystąpienia zwapnienia. Aby wykryć zwapnienie za pomocą obrazowania, otwórz oprogramowanie i wybierz Protokoły i Utwórz nowy. Wybierz opcję Procedura i kliknij przycisk Ustaw temperaturę.Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a gradient na 1 stopień Celsjusza w wyskakującym okienku i kliknij OK. Wybierz typ blachy z menu rozwijanego. Dodaj krok obrazowania, klikając pozycję Obraz. Wybierz odwrócony imager i kliknij przycisk OK. Dodaj trzy kanały obrazowania i ustaw je na DAPI, RFP i Bright Field.Zaznacz pole Montaż i ustaw żądaną liczbę i lokalizację obrazów. Zmień Nakładanie się, aby reprezentowało lepsze pokrycie każdej studni. Wybierz, które studnie mają zostać zobrazowane.Otworzy się nowe okno, w którym można wybrać interesujące Cię studnie. Kliknij przycisk Opcje ostrości, aby ustawić tryb ostrości. Otworzy się nowe okno.Ustaw każdy kanał indywidualnie. Zazwyczaj studnie są automatycznie skoncentrowane na kanale DAPI. Ustaw wszystkie inne kanały na Stała wysokość ogniskowej od pierwszego kanału i ustaw, klikając przycisk OK. Zamknij okno.Rozpocznij kroki wstępnego ustawiania redukcji danych, klikając opcję Redukcja danych i wybierając opcję Wstępne przetwarzanie obrazu. Zaakceptuj ustawienia domyślne, wybierając przycisk OK. Skonfiguruj krok, aby policzyć komórki, wybierając pozycję Analiza komórkowa. Wybierz TsF DAPI Images z menu rozwijanego kanału.Ustaw dalsze szczegóły po wykonaniu obrazowania. Przygotuj analizę sygnału zapytania ofertowego, wybierając Statystykę w wyskakującym oknie Krok Etykieta i wybierz TsF RFP jako kanał wejściowy. Zaznacz pola Górna wartość i Dolna wartość.Zaznacz pole Całkowita powierzchnia na dolnej liście. Wybierz opcję Brak w kolumnie Color Effect (Efekt kolorystyczny). W wyskakującym okienku kliknij Niestandardowe i zaznacz pole Tło.Naciśnij przycisk OK. Aby uzyskać uczciwy odczyt, znormalizuj sygnał RFP na komórkę, naciskając Współczynnik po lewej stronie. W oknie podręcznym wybierz opcję Kwantyfikacja zapytania ofertowego Łączna powierzchnia. W polu Data Input 1 (Wejście danych 1) z menu rozwijanego i wybierz opcję Cell Count (Liczba komórek) jako Data Input 2 (Dane wejściowe 2).Na koniec wybierz nazwę nowego zestawu danych i naciśnij dwukrotnie przycisk OK. Wybierz opcję Efekt kolorystyczny, jak pokazano wcześniej, a następnie kliknij OK.In lewym górnym rogu, wybierz opcję Plik i zapisz plik jako typ pliku Protokół. Zapisuj obserwacje dla każdego punktu czasowego po wystąpieniu pierwszego przypadku zwapnienia.Naciśnij Czytaj teraz w oprogramowaniu startowym i kliknij Istniejący protokół. Wybierz protokół utworzony w poprzednim kroku. Program poprosi o zapisanie eksperymentu.Można to zrobić na tym etapie lub później ręcznie, klikając przycisk Zapisz w lewym górnym rogu. Wyskakujące okienko poprosi o poczekanie, aż system się nagrzeje. Włącz kontroler dwutlenku węgla i ustaw go na 5%Gdy system osiągnie ustawioną temperaturę, pojawi się monit o włożenie tabliczki i przeczytanie.Naciśnij przycisk Anuluj. Płytkę należy przetransportować z inkubatora do imagera w bezpiecznym pudełku, aby uniknąć pęknięcia i rozlania, i jest zgodna z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi transportu żywych komórek w razie wypadku. Umieść płytkę w czytniku płytek.Kliknij Procedura. W wyskakującym oknie wybierz opcję Preset Imaging Step (Krok obrazowania ustawień wstępnych). Najpierw dostosuj ostrość i ekspozycję na kanale DAPI.Usuń zaznaczenie pola Automatyczna ekspozycja przy wszystkich kanałach, a następnie kliknij ikonę mikroskopu obok kanału DAPI. Otworzy się nowe okno. Wybierz studnię, aby skierować ostrość.Jeśli sygnał jest już widoczny, najpierw kliknij Autofokus, a następnie Automatyczna ekspozycja. Jeśli nie, najpierw zwiększ ekspozycję i powtórz autofokus i automatyczną ekspozycję. Ekspozycję można dostosować ręcznie, wybierając menu rozwijane Ekspozycja.Sprawdź ustawienia w wielu dołkach, a następnie zapisz ustawienia. Dostosuj ekspozycję w ten sam sposób dla wszystkich kanałów. W przypadku kanału zapytania ofertowego należy zacząć od studni o średnim lub wysokim zwapnieniu.Zamknij okno procedury i wybierz zielony przycisk Czytaj teraz na górnym pasku zadań. Zapisz eksperyment zgodnie ze wskazówkami oprogramowania. Powtórz ten proces dla każdego punktu czasowego.Podczas gdy system odczytuje płytę, wszystkie obrazy są automatycznie przetwarzane w tle. Dostosuj ustawienia liczby komórek, wybierając obrazy TsF DAPI do wyświetlenia. Wybierz wybraną studnię, klikając dwukrotnie.Pojawi się nowe okno. Wybierz jeden z obrazów. Wybierz kartę Analiza w oknie podręcznym.Wybierz opcję Cellular Analysis Cell Count (Liczba komórek analizy komórkowej) i kliknij przycisk OK. Usuń zaznaczenie kanałów RFP i Bright Field. Zaznacz pole Podświetl obiekty. Kliknij przycisk Opcje, aby otworzyć menu.Dostosuj próg rozmiaru i intensywności, aby uwzględnić wszystkie jądra, ale wykluczyć zanieczyszczenia, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Zastosuj zmiany w lewym dolnym rogu, aby zastosować ustawienia do wszystkich obrazów. Podobnie, wybierz dobrze zakończony obraz ze średnim lub wysokim stopniem zwapnienia. Aby jak najlepiej dostosować stosunek sygnału do szumu, kliknij kartę Analiza w menu Zadanie.Wybierz opcję Image Statistics (Statystyki obrazu). Usuń zaznaczenie kanału DAPI i Bright Field. Kliknij przycisk Opcje, aby otworzyć menu.Zaznacz pole Wartości odstające od normy. Aby ustawić niesubiektywną wartość progową dla sygnału nad tłem, wybierz narzędzie Linia z paska zadań. Pojawi się okno.Narysuj linię przechodzącą przez plamę sygnału, uwzględniając obszar tła. Dostosuj górne i dolne wartości progów. Licz sygnał tylko powyżej tła i wykluczaj, jeśli znajdują się tam szczątki lub artefakty.Kliknij przycisk OK i zastosuj zmiany, aby przenieść ustawienia do wszystkich innych studni. Upewnij się, że próg jest dokładnie wybrany w innych studzienkach. Po ustawieniu liczby komórek i progów zapytania ofertowego wyeksportuj dane.Kliknij przycisk Excel obok menu rozwijanego, aby wyeksportować dane bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego. Wykryto i przeanalizowano różne etapy zwapnienia, od niskiego do wysokiego. Zwapnienia zauważono jako czarne plamki przy użyciu mikroskopii świetlnej, które były przydatne do wstępnej oceny i określenia, kiedy rozpocząć obrazowanie.Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, przetworzone obrazy zapytania ofertowego przeanalizowano w celu ilościowego określenia zwapnienia. Dane uzyskano poprzez porównanie dwóch lub więcej warunków w tym samym punkcie czasowym. Dane znormalizowano do liczby komórek jako obszaru zwapnienia na komórkę.Dane zostały również przedstawione jako szereg czasowy pokazujący ten sam stan w różnych punktach czasowych. Ważne jest, aby wyniki po redukcji i analizie danych nadal odzwierciedlały to, co można było zobaczyć przed transformacją obrazu i progowaniem.

a-semi-automated-reproducible-biological-based-method-to-quantify

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

W tym filmie opisujemy test resorpcji osteoklastycznej in vitro na płytkach hodowlanych pokrytych fosforanem wapnia, hodowanych z ludzkimi osteoklastami pochodzącymi z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Osteoklasty tworzą charakterystyczny pierścień aktynowy na pokrytej fosforanem wapnia matrycy płytki hodowli komórkowej i degradują macierz w regionie pierścienia aktynowego, uwalniając jony wapnia i fosforanu, co powoduje powstawanie wyraźnych wgłębień resorpcyjnych w zdegradowanej...

Test resorpcyjny: technika in vitro do ilościowego określania aktywności resorpcyjnej dojrzałych osteoklastów przy użyciu płytek hodowlanych pokrytych fosforanem wapnia

W tym filmie opisujemy metodę wykrywania złogów wapnia wydzielanych przez osteoblasty za pomocą barwnika anionowego, Alizarin Red S. Wyhodowane osteoblasty są najpierw barwione, a następnie barwnik jest odzyskiwany w celu kolorymetrycznego oznaczania ilościowego depozytów wapnia lub stopnia mineralizacji osteoblastów.

Test mineralizacji in vitro: metoda kolorymetryczna do ilościowego oznaczania złogów wapnia w osteoblastach na substytucie przeszczepu kostnego przez barwienie i ekstrakcję czerwieni alizarynowej

Ten film demonstruje technikę oceny zwapnienia komórek śródmiąższowych zastawki aortalnej in vitro. Test pomaga określić ilościowo stężenie wapnia za pomocą odczynnika arsenazo III, barwnika wrażliwego na wapń, który reaguje z jonami wapnia, tworząc fioletowy kompleks wapniowo-arsenazowy.

Test zwapnienia do pomiaru stężenia wapnia w komórkach śródmiąższowych zastawki aortalnej

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Ten artykuł opisuje zastosowanie krioanalitycznej mikroskopii elektronowej do ilościowego pomiaru całkowitej zawartości i dystrybucji wapnia w rozdzielczości subkomórkowej w fizjologicznie zdefiniowanych próbkach biologicznych.

Pomiar całkowitego wapnia w neuronach za pomocą mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej

Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.

zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty

Ten artykuł opisuje izolację komórek mysiej zastawki aortalnej za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy. Izolowane komórki zastawki myszy są ważne dla wykonywania różnych testów, takich jak test zwapnienia in vitro, oraz dla badania szlaków molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki aortalnej.

Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną procedurę testową dla testów resorpcyjnych z użyciem płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia.

Prosty protokół testu wgłębnego do wizualizacji i ilościowego określenia resorpcji osteoklastycznej in vitro

Ten artykuł przedstawia metodologię uzyskiwania i oceny zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację mysich aort, a następnie ekstrakcję zwapniałych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu obserwacji potencjału mineralizacji.

Analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo

Obrazowanie żywymi komórkami sygnalizacji wapnia jest szeroko wykorzystywane do badania mobilizacji wapnia w stabilnych liniach komórkowych hodowanych w monowarstwach. Protokół ten opisuje obrazowanie fluorescencji żywych komórek sygnalizacji wapnia z użyciem barwników komórek żywych na złożonych, pierwotnych tkankach, a także wykorzystuje oprogramowanie uczenia maszynowego do ilościowego określania intensywności fluorescencji tysięcy pojedynczych komórek jednocześnie, co usprawnia analizy.

Obrazowanie wapnia oparte na fluorescencji w pierwotnych hodowlach nabłonka dróg oddechowych z wykorzystaniem zautomatyzowanej segmentacji komórek

Poznaj półautomatyczną metodę ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro przy użyciu ludzkich komórek mięśniowych gładkich naczyń krwionośnych. Technika fluorescencyjna zwiększa czułość pomiarów i umożliwia badania longitudinalne.

Półautomatyczna i powtarzalna metoda biologiczna do ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro

Przeglądaj więcej filmów