Półautomatyczna i powtarzalna metoda biologiczna do ilościowego oznaczania depozycji wapnia in vitro
2 czerwca 2022
Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie. Zwapnienie naczyń krwionośnych w znacznym stopniu przyczynia się do obciążenia chorobowością i śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych. Protokół ten opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania wytrącania wapnia za pośrednictwem komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.
Nasza metoda pozwala na pomiar skłonności do zwapnienia próbek pobranych od pacjentów przy użyciu ludzkich komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Przyczyni się to do przyspieszenia badań nad zaburzeniami zwapnienia naczyń krwionośnych, pomagając w opracowaniu nowych terapii. Technika ta wykorzystuje detekcję opartą na fluorescencji, która zwiększa czułość i umożliwia pomiar próbek w czasie, zmniejszając w ten sposób potrzebę powtórzeń i zwiększając ich odporność.
Na początek hoduj ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych na niepowlekanych kolbach do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Podziel komórki po osiągnięciu 70 do 90% zbieżności. Aby podzielić, umyj HVSMC dwukrotnie za pomocą PBS.
Dodaj trypsynę i inkubuj przez 2 do 5 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zahamuj reakcję trypsyny, dodając pożywkę zawierającą surowicę. Odwirować komórki przez 4 minuty przy 350 RCF i ponownie zawiesić osad w pożywce konserwacyjnej.
Po przygotowaniu komórek do podziału, jak pokazano, policz i zasiej komórki na 48-dołkowej płytce, aby rozpocząć eksperyment zwapnienia. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, delikatnie umyj komórki dwukrotnie PBS, ostrożnie odsysając cały pozostały PBS po drugim płukaniu. Delikatnie dodaj pożywkę do zwapnienia i kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
Sprawdzaj codziennie pod mikroskopem świetlnym, aż do momentu wystąpienia zwapnienia. Aby wykryć zwapnienie za pomocą obrazowania, otwórz oprogramowanie i wybierz Protokoły i Utwórz nowy. Wybierz opcję Procedura i kliknij przycisk Ustaw temperaturę.
Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a gradient na 1 stopień Celsjusza w wyskakującym okienku i kliknij OK. Wybierz typ blachy z menu rozwijanego. Dodaj krok obrazowania, klikając pozycję Obraz. Wybierz odwrócony imager i kliknij przycisk OK. Dodaj trzy kanały obrazowania i ustaw je na DAPI, RFP i Bright Field.
Zaznacz pole Montaż i ustaw żądaną liczbę i lokalizację obrazów. Zmień Nakładanie się, aby reprezentowało lepsze pokrycie każdej studni. Wybierz, które studnie mają zostać zobrazowane.
Otworzy się nowe okno, w którym można wybrać interesujące Cię studnie. Kliknij przycisk Opcje ostrości, aby ustawić tryb ostrości. Otworzy się nowe okno.
Ustaw każdy kanał indywidualnie. Zazwyczaj studnie są automatycznie skoncentrowane na kanale DAPI. Ustaw wszystkie inne kanały na Stała wysokość ogniskowej od pierwszego kanału i ustaw, klikając przycisk OK. Zamknij okno.
Rozpocznij kroki wstępnego ustawiania redukcji danych, klikając opcję Redukcja danych i wybierając opcję Wstępne przetwarzanie obrazu. Zaakceptuj ustawienia domyślne, wybierając przycisk OK. Skonfiguruj krok, aby policzyć komórki, wybierając pozycję Analiza komórkowa. Wybierz TsF DAPI Images z menu rozwijanego kanału.
Ustaw dalsze szczegóły po wykonaniu obrazowania. Przygotuj analizę sygnału zapytania ofertowego, wybierając Statystykę w wyskakującym oknie Krok Etykieta i wybierz TsF RFP jako kanał wejściowy. Zaznacz pola Górna wartość i Dolna wartość.
Zaznacz pole Całkowita powierzchnia na dolnej liście. Wybierz opcję Brak w kolumnie Color Effect (Efekt kolorystyczny). W wyskakującym okienku kliknij Niestandardowe i zaznacz pole Tło.
Naciśnij przycisk OK. Aby uzyskać uczciwy odczyt, znormalizuj sygnał RFP na komórkę, naciskając Współczynnik po lewej stronie. W oknie podręcznym wybierz opcję Kwantyfikacja zapytania ofertowego Łączna powierzchnia. W polu Data Input 1 (Wejście danych 1) z menu rozwijanego i wybierz opcję Cell Count (Liczba komórek) jako Data Input 2 (Dane wejściowe 2).
Na koniec wybierz nazwę nowego zestawu danych i naciśnij dwukrotnie przycisk OK. Wybierz opcję Efekt kolorystyczny, jak pokazano wcześniej, a następnie kliknij OK.In lewym górnym rogu, wybierz opcję Plik i zapisz plik jako typ pliku Protokół. Zapisuj obserwacje dla każdego punktu czasowego po wystąpieniu pierwszego przypadku zwapnienia.
Naciśnij Czytaj teraz w oprogramowaniu startowym i kliknij Istniejący protokół. Wybierz protokół utworzony w poprzednim kroku. Program poprosi o zapisanie eksperymentu.
Można to zrobić na tym etapie lub później ręcznie, klikając przycisk Zapisz w lewym górnym rogu. Wyskakujące okienko poprosi o poczekanie, aż system się nagrzeje. Włącz kontroler dwutlenku węgla i ustaw go na 5%Gdy system osiągnie ustawioną temperaturę, pojawi się monit o włożenie tabliczki i przeczytanie.
Naciśnij przycisk Anuluj. Płytkę należy przetransportować z inkubatora do imagera w bezpiecznym pudełku, aby uniknąć pęknięcia i rozlania, i jest zgodna z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi transportu żywych komórek w razie wypadku. Umieść płytkę w czytniku płytek.
Kliknij Procedura. W wyskakującym oknie wybierz opcję Preset Imaging Step (Krok obrazowania ustawień wstępnych). Najpierw dostosuj ostrość i ekspozycję na kanale DAPI.
Usuń zaznaczenie pola Automatyczna ekspozycja przy wszystkich kanałach, a następnie kliknij ikonę mikroskopu obok kanału DAPI. Otworzy się nowe okno. Wybierz studnię, aby skierować ostrość.
Jeśli sygnał jest już widoczny, najpierw kliknij Autofokus, a następnie Automatyczna ekspozycja. Jeśli nie, najpierw zwiększ ekspozycję i powtórz autofokus i automatyczną ekspozycję. Ekspozycję można dostosować ręcznie, wybierając menu rozwijane Ekspozycja.
Sprawdź ustawienia w wielu dołkach, a następnie zapisz ustawienia. Dostosuj ekspozycję w ten sam sposób dla wszystkich kanałów. W przypadku kanału zapytania ofertowego należy zacząć od studni o średnim lub wysokim zwapnieniu.
Zamknij okno procedury i wybierz zielony przycisk Czytaj teraz na górnym pasku zadań. Zapisz eksperyment zgodnie ze wskazówkami oprogramowania. Powtórz ten proces dla każdego punktu czasowego.
Podczas gdy system odczytuje płytę, wszystkie obrazy są automatycznie przetwarzane w tle. Dostosuj ustawienia liczby komórek, wybierając obrazy TsF DAPI do wyświetlenia. Wybierz wybraną studnię, klikając dwukrotnie.
Pojawi się nowe okno. Wybierz jeden z obrazów. Wybierz kartę Analiza w oknie podręcznym.
Wybierz opcję Cellular Analysis Cell Count (Liczba komórek analizy komórkowej) i kliknij przycisk OK. Usuń zaznaczenie kanałów RFP i Bright Field. Zaznacz pole Podświetl obiekty. Kliknij przycisk Opcje, aby otworzyć menu.
Dostosuj próg rozmiaru i intensywności, aby uwzględnić wszystkie jądra, ale wykluczyć zanieczyszczenia, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Zastosuj zmiany w lewym dolnym rogu, aby zastosować ustawienia do wszystkich obrazów. Podobnie, wybierz dobrze zakończony obraz ze średnim lub wysokim stopniem zwapnienia. Aby jak najlepiej dostosować stosunek sygnału do szumu, kliknij kartę Analiza w menu Zadanie.
Wybierz opcję Image Statistics (Statystyki obrazu). Usuń zaznaczenie kanału DAPI i Bright Field. Kliknij przycisk Opcje, aby otworzyć menu.
Zaznacz pole Wartości odstające od normy. Aby ustawić niesubiektywną wartość progową dla sygnału nad tłem, wybierz narzędzie Linia z paska zadań. Pojawi się okno.
Narysuj linię przechodzącą przez plamę sygnału, uwzględniając obszar tła. Dostosuj górne i dolne wartości progów. Licz sygnał tylko powyżej tła i wykluczaj, jeśli znajdują się tam szczątki lub artefakty.
Kliknij przycisk OK i zastosuj zmiany, aby przenieść ustawienia do wszystkich innych studni. Upewnij się, że próg jest dokładnie wybrany w innych studzienkach. Po ustawieniu liczby komórek i progów zapytania ofertowego wyeksportuj dane.
Kliknij przycisk Excel obok menu rozwijanego, aby wyeksportować dane bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego. Wykryto i przeanalizowano różne etapy zwapnienia, od niskiego do wysokiego. Zwapnienia zauważono jako czarne plamki przy użyciu mikroskopii świetlnej, które były przydatne do wstępnej oceny i określenia, kiedy rozpocząć obrazowanie.
Aby poprawić stosunek sygnału do szumu, przetworzone obrazy zapytania ofertowego przeanalizowano w celu ilościowego określenia zwapnienia. Dane uzyskano poprzez porównanie dwóch lub więcej warunków w tym samym punkcie czasowym. Dane znormalizowano do liczby komórek jako obszaru zwapnienia na komórkę.
Dane zostały również przedstawione jako szereg czasowy pokazujący ten sam stan w różnych punktach czasowych. Ważne jest, aby wyniki po redukcji i analizie danych nadal odzwierciedlały to, co można było zobaczyć przed transformacją obrazu i progowaniem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę ilościowego wyznaczania osadzania wapnia przez komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego. Ma na celu zwiększenie badań nad zaburzeniami stwardniania naczyń, które są istotnym czynnikiem chorób układu krążenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Choroby układu krążenia
- Stwardnienie naczyń
- Techniki hodowania komórek
Tło
- Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na świecie.
- Stwardnienie naczyń jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do wskaźników zapadalności i śmiertelności z powodu chorób układu krążenia.
- Rozumienie osadzania wapnia może pomóc w opracowaniu nowych terapii.
- Obrazowanie fluorescencyjne zwiększa wrażliwość pomiaru stwardniania.
Cel badania
- Wyznaczanie skłonności do stwardniania w próbkach pacjentów.
- Pomoc w badaniach nad zaburzeniami stwardniania naczyń.
- Poprawa solidności wyników eksperymentalnych.
Stosowane metody
- Hodować komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych człowieka (HVSMC) na niepokrytych kolbach.
- Utrzymywać komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.
- Dzielić komórki po osiągnięciu 70 do 90% pokrycia.
- Przemywać HVSMC buforem PBS przed podziałem.
Główne wyniki
- Metoda umożliwia wrażliwe pomiary osadzania wapnia.
- Zmniejsza potrzebę powtórzeń w eksperymentach.
- Ułatwia przeprowadzanie długoterminowych badań nad stwardnieniem.
- Wspiera rozwój nowych strategii terapeutycznych.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę badania stwardniania naczyń.
- Może znacząco przyczynić się do lepszego zrozumienia chorób układu krążenia.
- Przyszłe badania mogą prowadzić do innowacyjnych terapii zaburzeń naczyniowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative, reproducible measurement of calcium deposition in human vascular smooth muscle cells addresses a critical gap in early-stage vascular calcification research. This semi-automated, fluorescence-based assay enables real-time, longitudinal assessment, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking in disease modeling. The method enhances portfolio decision-making by providing robust, scalable data for target validation and translational research in cardiovascular and mineralization disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of calcification pathways and cellular mechanisms in human-relevant systems.
- Supports functional target validation by quantifying dynamic mineral deposition over time.
- Facilitates predictive confidence in disease modeling for vascular and mineralization disorders.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible quantification of calcification for assay development.
- Delivers quantitative, cell-normalized outputs suitable for compound screening and comparative studies.
- Reduces biological material requirements and experimental variability through longitudinal measurement.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant calcification processes observed in clinical pathology.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting vascular calcification.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing robust, quantitative endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based quantification method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for vascular and mineralization research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking by enabling real-time monitoring of calcification.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible outputs for compound evaluation and condition comparison.
- Analytics: Generates quantitative, cell-normalized data for robust statistical analysis and cross-condition benchmarking.
- Translational Research: Bridges in vitro modeling with disease-relevant endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, semi-automated platform adaptable to other mineralization research areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in calcification research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of in vitro assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of vascular and mineralization programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence imaging, and quantitative image analysis.
- Needs access to automated imaging platforms and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and mineralization models with protocol optimization.
- Dependent on rigorous thresholding and normalization to ensure data integrity.
