Name: Wytwarzanie i stosowanie suchych makroporowatych rusztowań alginianowych do transdukcji wirusowej limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania suchych makroporowatych rusztowań alginianowych Drydux do transdukcji wirusowej limfocytów T. Protokół zapewnia ponad 85% wydajność transdukcji, oferując tańszą alternatywę dla standardowych metod w terapii CAR-T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health poprzez przyznanie grantów o numerach R37-CA260223, R21CA246414. Dziękujemy rdzeniowi cytometrii przepływowej NCSU za szkolenie i wskazówki dotyczące analizy cytometrii przepływowej. Schematy zostały stworzone za pomocą Biorender.com

Wszystkie procedury z udziałem ludzkich komórek pierwotnych i wektorów retrowirusowych zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Stanowego Karoliny Północnej i zatwierdzone przez Biuro ds. Zdrowia i Bezpieczeństwa Środowiskowego. Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej zakupiono jako kożuchy ze źródeł komercyjnych. Pierwotne komórki ludzkie muszą zostać wyizolowane z frakcji kożuchy ludzkiej i wymagają zezwolenia na poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 oraz szczegółowych standardowych procedur operacyjnych i zgody instytucji, w której mają być prowadzone prace. Wektory wirusowe, w tym supernatanty wektorów retrowirusowych używane do transdukcji, przygotowane zgodnie z wcześniejszym opisem19, mogą być klasyfikowane jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 1 lub poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 w zależności od kodowanego białka i wymagają zatwierdzenia przez odpowiedni instytucjonalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego.
1. Tworzenie makroporowatych rusztowań alginianowych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 0,4% (wagowo na objętość) glukonianu wapnia D, dodając sterylnie przefiltrowaną wodę dejonizowaną do glukonianu wapnia D w zlewce. Mieszać na średnich obrotach, aż glukonian wapnia się rozpuści (~1,5 h), sterylnie przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby sprawdzania pH roztworu.</li>
	<li>Przygotować roztwór 2% (wagowo na objętość) alginianu w zakręcanej fiolce lub zlewce. Ostrożnie dodaj ultraczysty alginian do naczynia i dodaj sterylnie przefiltrowaną wodę dejonizowaną do alginianu. Wybierz jak największy mieszadło, które nie będzie utrudniało mieszania i dodaj go do naczynia. 
	UWAGA: Informacje na temat rodzaju ultraczystego alginianu użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów oraz na stronie internetowej Novamatrix20. Różne alginiany nie zostały zbadane dla tych rusztowań, ponieważ mogą one prowadzić do niepożądanych zmian w porowatości i biokompatybilności rusztowań9,10,11.</li>
	<li>Mieszać roztwór na wysokich obrotach, aż alginian się rozpuści (~1 h). Jeśli po bokach naczynia znajdują się duże grudki, przechyl naczynie, aby je usunąć. Niewielkie ilości alginianu po bokach rozpuszczą się podczas mieszania i nie są powodem do niepokoju. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby sprawdzania pH roztworu.</li>
	<li>Gdy alginian się rozpuści, zmniejsz prędkość mieszania, powoli dodaj równą objętość 0,4% glukonianu wapnia D do roztworu alginianu, aby zapobiec tworzeniu się usieciowanych grudek i energicznie mieszaj przez 15 minut.</li>
	<li>Przechylić zlewkę lub fiolkę na bok, aby usunąć wszelkie grudki, które mogły się utworzyć. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie homogenizatora. Ostateczne rozwiązanie powinno być optycznie jasne.</li>
	<li>Odpipetować żądaną objętość roztworu do każdego dołka płytki 48-dołkowej lub 24-dołkowej. Użyj 300 μl/dołek dla płytki 48-dołkowej i 1 ml/dołek dla płytki 24-dołkowej. Rzucaj powoli i często zmieniaj końcówki, ponieważ roztwór będzie lepki i przyklei się do końcówki.</li>
	<li>Przykryj talerze pokrywkami i zamroź przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj płytkę do liofilizatora, zdejmując pokrywkę i zabezpieczając górę chusteczkami i gumkami. Umieścić płytki w kolbach liofilizatora o pojemności od 750 ml do 2 000 ml i umieścić na liofilizatorze na 72 godziny.</li>
	<li>Po 72 godzinach wyjmij płytkę z liofilizatora i załóż pokrywkę. Uszczelnić płytkę i przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania, przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C należy zamknąć próżniowo płytkę. Przechowywać w suchym miejscu do czasu, gdy będzie potrzebna. 
	UWAGA: Przygotować dodatkowy roztwór alginianu wapnia ze względu na błąd objętości (niektóre przyklejają się do ścianek fiolki, końcówki pipet). Na przykład, aby zrobić cztery rusztowania na 24-dołkowej płytce, wymagane są 4 ml połączonego roztworu (2 ml alginianu + 2 ml glukonianu wapnia D), ale zaleca się przygotowanie 2,5 ml 2% roztworu alginianu i 2,5 ml 0,4% roztworu glukonianu wapnia D.</li>
</ol>
2. Transdukcja
<ol>
	<li>Zagęszczanie supernatantu wirusowego przy użyciu filtrów 100 kDa
	<ol>
		<li>Nawilżaj filtr odśrodkowy przez 2 minuty 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wyrzuć PBS.</li>
		<li>Zagęścić zawiesinę wirusa, dodając 2 ml zawiesiny wirusa (1 × 106 TU/ml) i przepuszczając ją przez filtr odśrodkowy o stężeniu 1 500 × g przez 10 minut w wahadłowym wirniku kubełkowym. 
		UWAGA: Potrzeba od jednego do dwustu mikrolitrów skoncentrowanego wirusa na rusztowanie.</li>
		<li>Wirować przez kilka dodatkowych minut, jeśli objętość stężonej zawiesiny wirusa jest większa niż 200 μl.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.1.1-2.1.3 dla każdego rusztowania. 
		UWAGA: Dopuszczalne jest również zagęszczenie dużego zapasu wirusa i pobranie 100-200 μl podwielokrotności z zagęszczonego zapasu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewaj razem aktywowane komórki i wirusa.
	<ol>
		<li>Dla każdego rusztowania należy przygotować podwielokrotność, zawieszając 1 ×10 6 aktywowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w 50 μl kompletnej pożywki do hodowli komórkowych (250 ml pożywki Clicka + 250 ml pożywki RPMI 1640 + 50 ml płodowej surowicy bydlęcej + 5 ml substytutu glutaminy + 5 ml penicyliny/streptomycyny). 
		UWAGA: Patrz Plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z protokołem aktywacji PBMC.</li>
		<li>Dodać skoncentrowany supernatant wirusowy (~2 × 106 TU, MOI 2) do zawiesiny komórek. Całkowita objętość zawiesiny wirusa komórkowego nie powinna przekraczać 200 μl dla rusztowania 48-dołkowego lub 350 μl dla rusztowania 24-dołkowego.</li>
		<li>Dodaj mieszaninę komórkowo-wirusową kroplami na szczyt suchego rusztowania. Do eksperymentów z kontrolą ujemną należy użyć kompletnych pożywek do hodowli komórkowych zamiast skoncentrowanego wirusa. Dodaj zawiesinę komórkową na szczyt suchego rusztowania.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.2.1-2.2.3 dla każdego rusztowania.</li>
		<li>Inkubować rusztowania w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 45-60 minut. Usunąć rusztowania z inkubatora; w tym czasie rusztowania w pełni wchłoną roztwór.</li>
		<li>Aby indukować proliferację, dodać do każdej studzienki kompletne pożywki do hodowli komórkowych uzupełnione IL-15 (5 ng/ml) i IL-7 (10 ng/ml); Można również stosować IL-2. Dodać 500 μl do każdego rusztowania 48-dołkowego lub 1 ml do każdego rusztowania 24-dołkowego.</li>
		<li>Inkubować rusztowania w temperaturze 37 °C przez 72 godziny. W miarę namnażania się komórek pożywka zmieni kolor na pomarańczowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odizoluj komórki od rusztowań do analizy.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 0,5 M EDTA do 0,25 M EDTA w 1x PBS.</li>
		<li>Usuń nadmiar pożywki z każdej studzienki i zbierz do oddzielnych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Aby wyizolować komórki z rusztowania, dodaj 0,25 M EDTA do każdego rusztowania. Dodać 300 μl do rusztowań 48-dołkowych lub 1 ml do rusztowań 24-dołkowych. Pozostaw talerz na 3-4 minuty lub delikatnie mieszaj.</li>
		<li>Gdy rusztowanie jest już w większości rozpuszczone, delikatnie wsuwaj i wyjmuj pipetą z wnętrza studzienki. Do całkowitego rozpuszczenia rusztowania może być konieczne wykonanie kilku etapów pipetowania. Jeśli nie rozpuści się w ciągu 10 minut, dodaj kolejne 200 μl 0,25 M EDTA.</li>
		<li>Gdy rusztowanie całkowicie się rozpuści, przenieś roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.3.4 i 2.3.5 dla każdego rusztowania.</li>
		<li>Umyć komórki dwukrotnie, dodając 12 ml PBS do każdej probówki wirówkowej i odwirowując przy 400 × g przez 5 minut. Na dnie każdej probówki utworzy się osad komórkowy. Odessać supernatant i powtórzyć pranie. Należy uważać, aby całkowicie zassać supernatant przy każdym płukaniu, ponieważ bardzo ważne jest usunięcie całego EDTA.</li>
		<li>Po drugim przemyciu PBS osad komórkowy jest teraz gotowy do analizy. Postępuj zgodnie z odpowiednim protokołem wymaganym do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+for+glioblastoma%3A+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anticancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li>
<li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma%3A+recent+clinical+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li>
<li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li>
<li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+CAR+T-cells+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy%3A+A+new+era+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li>
<li>Lee, H. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%3A+Journal+of+the+International+Association+of+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li>
<li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+in+human+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li>
<li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Alginates+in+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li>
<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%3A+properties+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li>
<li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering%3A+part+1.+Structure%2C+gelation+rate+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li>
<li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+nondairy+beverages%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Plant-Based+Fermented+Food+and+Beverage+Technology%2C+Second+Edition%22%5BJournal%5D)">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li>
<li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation%2C+tissue+retention+and+systemic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li>
<li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li>
<li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li>
<li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275(2020).</li>
<li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li>
<li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li>
<li>PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022).</li>
<li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li>
<li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084(2022).</li>
<li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true</a> (2022).</li>
<li>Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+alginate%2Fhydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%3A+Preparation%2C+characterization%2C+andin+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li>
<li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+poly%28ethylene+glycol%29+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620(2012).</li>
</ol>

P.A. i Y.B. są wynalazcami patentów związanych z wykorzystaniem biomateriałów do wytwarzania terapii komórkowych CAR-T. Y.B. otrzymuje sponsorowany przez przemysł grant badawczy związany z technologią terapii komórkami CAR-T (niezwiązany z tą pracą). Wszyscy pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Terapia komórkowa CAR-T cieszy się coraz większym zainteresowaniem zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i komercyjnych. Pomimo sukcesu, jaki terapia komórkowa CAR-T odniosła w leczeniu nowotworów krwi, wysokie koszty procedury ograniczają jej zastosowanie. Przedstawiony tutaj protokół wprowadza nową metodę wirusowego transferu genów limfocytów T bez konieczności spinokulacji płytek pokrytych retronektyną. Produkcja suchych makroporowatych rusztowań alginianowych do pośredniczenia w transdukcji jest stosunkowo prosta ...

Immunoterapia stała się rewolucyjnym paradygmatem leczenia nowotworów ze względu na swoją zdolność do specyficznego celowania w guzy, ograniczania cytotoksyczności poza docelowej oraz zapobiegania nawrotom. W szczególności terapią, która zyskała popularność dzięki sukcesom w leczeniu chłoniaków i białaczek, jest terapia komórkami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR-T). FDA zatwierdziła pierwszą terapię komórkami CAR-T w 2017 roku, a od tego czasu zatwierdzono kolejne cztery terapie CAR-T1,2,3,4,5. Receptory CAR posiadają domenę rozpoznawania antygenu, składającą się zazwyczaj z jednoczynnikowego fragmentu zmiennego przeciwciała monoklonalnego, który jest specyficzny dla antygenu związanego z nowotworem3,4. Gdy CAR wchodzi w interakcję ze swoim antygenem związanym z nowotworem, komórki CAR-T ulegają aktywacji, co prowadzi do odpowiedzi przeciwnowotworowej obejmującej uwalnianie cytokin, degranulację cytolityczną, ekspresję czynników transkrypcyjnych oraz proliferację limfocytów T. Aby wytworzyć komórki CAR-T, od pacjenta pobiera się krew w celu pozyskania jego limfocytów T. Receptory CAR są wprowadzane do limfocytów T pacjenta metodą genetyczną przy użyciu wirusa. Komórki CAR-T są namnażane in vitro, a następnie infundowane z powrotem do organizmu pacjenta2,3,4,6. O sukcesie generowania komórek CAR-T decyduje wydajność transdukcji, która określa liczbę limfocytów T zmodyfikowanych genetycznie w komórki CAR-T.
Obecnie złotym standardem w generowaniu komórek CAR-T jest spinokulacja aktywowanych limfocytów T i wirusa na płytkach pokrytych retronektyną7,8. Transdukcja rozpoczyna się w momencie, gdy cząsteczki wirusa wiążą się z powierzchnią limfocytów T. Retronektyna sprzyja kolokalizacji wirusa i komórek poprzez zwiększenie wydajności wiązania między cząsteczkami wirusa a komórkami, co nasila transdukcję7,8. Retronektyna nie działa skutecznie samodzielnie i musi być stosowana w połączeniu ze spinokulacją, która usprawnia transfer genów poprzez koncentrację cząsteczek wirusa i zwiększenie przepuszczalności powierzchni limfocytów T, co ułatwia infekcję wirusową8. Pomimo sukcesu spinokulacji na płytkach pokrytych retronektyną, jest to proces złożony, wymagający wielu cykli wirowania i kosztownych odczynników. W związku z tym wysoce pożądane są alternatywne, szybsze i tańsze metody wirusowego transferu genów.
Alginian jest naturalnym anionowym polisacharydem szeroko stosowanym w przemyśle biomedycznym ze względu na niski koszt, dobry profil bezpieczeństwa oraz zdolność do tworzenia hydrożeli po zmieszaniu z kationami dwuwartościowymi9,10,11,12. Alginian jest polimerem zgodnym z zasadami GMP i jest ogólnie uznawany za bezpieczny (GRAS) przez FDA13. Sieciowanie alginianu kationami prowadzi do powstania stabilnych hydrożeli często wykorzystywanych w leczeniu ran, dostarczaniu małocząsteczkowych leków chemicznych i białek oraz w transporcie komórek9,10,11,12,14,15,16. Ze względu na doskonałe właściwości żelujące alginian jest preferowanym materiałem do tworzenia porowatych rusztowań metodą liofilizacji10,17. Te właściwości alginianu sprawiają, że jest on atrakcyjnym kandydatem do produkcji rusztowania, które może pośredniczyć w wirusowym transferze genów do aktywowanych komórek.
Opisano tutaj protokół wytwarzania suchych makroporowatych rusztowań alginianowych, znanych jako rusztowania Drydux, które służą do statycznej transdukcji limfocytów T poprzez wirusowy transfer genów17,18. Proces wytwarzania tych rusztowań przedstawiono na Ryc. 1. Rusztowania te eliminują konieczność spinokulacji na płytkach pokrytych retronektyną. Makroporowate rusztowania alginianowe sprzyjają oddziaływaniu cząsteczek wirusowych i limfocytów T, co umożliwia wydajny transfer genów w jednym kroku, bez wpływu na funkcjonalność i żywotność zmodyfikowanych limfocytów T17. Przy prawidłowym zastosowaniu, makroporowate rusztowania alginianowe wykazują wydajność transdukcji na poziomie co najmniej 80%, co upraszcza i skraca proces transdukcji wirusowej.
<img alt="Proces produkcji i transdukcji rusztowania Drydux; sieciowanie alginianu wapniem, zastosowanie w hodowli komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat i harmonogram protokołu. (A) Harmonogram wytwarzania suchych makroporowatych rusztowań alginianowych. Alginian jest sieciowany D-glukonianem wapnia i mrożony przez noc. Zamrożone rusztowania są liofilizowane przez 72 h w celu utworzenia rusztowań Drydux. (B) Harmonogram transdukcji wirusowej aktywowanych komórek. Aktywowane komórki i wirus (MOI 2) są wysiewane na wierzch rusztowania i inkubowane w pożywce kompletnej uzupełnionej o IL-7 i IL-15. Rusztowania absorbują mieszaninę i wspomagają wirusowy transfer genów. EDTA jest stosowany do rozpuszczenia rusztowań i izolacji transdukowanych komórek. Po dwukrotnym przemyciu PBS, osad komórkowy może zostać wykorzystany do analizy. Skróty: PBS = fosforanowy bufor solny; PBMCs = mononuklearne komórki krwi obwodowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>UltraPure, pH 8,0</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Bez chlorku wapnia lub chlorku magnezu</td></tr><tr><td>3% kwas octowy z błękitem metylenowym</td><td>Stemcell Technologies Inc</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Aktywowane jednojądrzaste komórki krwi obwodowej</td> <td>-</td><td></td> <td>świeże lub mrożone</td></tr><tr><td>D-glukonian wapnia</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11649</td><td></td></tr><tr><td>CD28.2 Przeciwciało</td><td>BD</td><td>555725</td><td>1 mg / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD3</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-387</td><td>100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Click's Media</td><td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>DI Woda</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Cytvia</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Media</td><td>Cytvia</td><td>SH3009601</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej</td> <td>-</td><td></td> <td>świeże lub mrożone</td></tr><tr><td>PRONOVA UP MVG</td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>Alginian sodu</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>5 ng / ml</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>10 ng / ml</td></tr><tr><td>Retrowirus</td><td></td>-<td>-</td><td>1 x 106 TU/ Ml</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i stosowanie suchych makroporowatych rusztowań alginianowych do transdukcji wirusowej limfocytów t

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

Inżynieria genetyczna limfocytów T do terapii komórkowej CAR-T wysunęła się na pierwszy plan leczenia raka w ciągu ostatnich kilku lat. Limfocyty CAR-T są wytwarzane w wyniku transferu genów wirusa do limfocytów T. Obecny złoty standard transferu genów wirusa polega na spinokulacji płytek pokrytych retronektyną, co jest kosztowne i czasochłonne. Istnieje duże zapotrzebowanie na wydajne i opłacalne metody wytwarzania komórek CAR-T. Opisano tutaj metodę wytwarzania niedrogich, suchych makroporowatych rusztowań alginianowych, znanych jako rusztowania Drydux, które skutecznie promują transdukcję wirusa aktywowanych limfocytów T. Rusztowania są przeznaczone do stosowania zamiast złotego standardu spinokulacji płytek pokrytych retronektyną wysianych wirusem i upraszczają proces transdukcji komórek. Alginian jest sieciowany krzyżowo z D-glukonianem wapnia i zamrażany przez noc w celu stworzenia rusztowań. Zamrożone rusztowania są liofilizowane w liofilizatorze przez 72 godziny, aby zakończyć formowanie suchych rusztowań makroporowatych. Rusztowania pośredniczą w transferze genów wirusa, gdy wirus i aktywowane limfocyty T są wysiewane razem na rusztowaniu w celu wytworzenia genetycznie zmodyfikowanych komórek. Rusztowania wytwarzają >85% pierwotnej transdukcji limfocytów T, co jest porównywalne ze skutecznością transdukcji spinokulacji na płytkach pokrytych retronektyną. Wyniki te pokazują, że suche makroporowate rusztowania alginianowe stanowią tańszą i wygodniejszą alternatywę dla konwencjonalnej metody transdukcji.

Te makroporowate rusztowania alginianowe są łatwe w przygotowaniu i po wyjęciu z liofilizatora powinny mieć postać porowatych, puszystych i białych dysków. Choć nie badano tego w niniejszym eksperymencie, roztwór alginianu wapnia można odlewać do różnych form w celu stworzenia rusztowań o zróżnicowanych kształtach, w zależności od potrzeb użytkownika9,10. Rusztowania wykazują właściwości elektrostatyczne i mogą przylegać do pokrywy płytki wielodołkowej lub do pal...

To jest protokół tworzenia suchych makroporowatych rusztowań alginianowych, które pośredniczą w efektywnym transferze genów wirusowych, do wykorzystania w inżynierii genetycznej limfocytów T, w tym limfocytów T do terapii komórkami CAR-T. Wykazano, że rusztowania transdukują aktywowane pierwotne limfocyty T z transdukcją >85%.

Wytwarzanie i stosowanie suchych makroporowatych rusztowań alginianowych do transdukcji wirusowej limfocytów T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

W tym filmie opisano protokół tworzenia i używania suchych makroporowatych rusztowań alginianowych znanych jako Drydux, które skutecznie promują transdukcję aktywowanych limfocytów T. Drydux jest przeznaczony do stosowania zamiast złotego standardu spinokulacji płytek pokrytych retronektyną wysianych wirusem i upraszcza proces transdukcji komórek. Drydux ma wydajność transdukcji porównywalną do spinokulacji na płytkach pokrytych retronektyną i służy jako tańsza i wygodniejsza alternatywa dla konwencjonalnej metody transdukcji.Najpierw przygotuj 0,4% roztwór D-glukonianu wapnia. Dodaj sterylną przefiltrowaną wodę demineralizowaną do D-glukonianu wapnia w zlewce. Mieszaj na średnich obrotach, aż glukonian wapnia się rozpuści, co zajmuje około 1 1/2 godziny.Po rozpuszczeniu sterylnie przefiltrować roztwór D-glukonianu wapnia. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj 2% roztwór alginianu.Można to osiągnąć za pomocą fiolki z zakrętką lub zlewki. Oba zostaną tutaj pokazane. Ostrożnie dodaj ultraczysty alginian do naczynia.Do alginianu dodać odpowiednią ilość wody DI. Wybierz jak największy mieszadło, które nie będzie utrudniało mieszania i dodaj go do naczynia. Mieszać roztwór na wysokich obrotach, aż alginian się rozpuści, co trwa około godziny.Jeśli z boku naczynia znajdują się duże grudki alginianu, przechyl naczynie na bok, aby je usunąć. Małe grudki rozpuszczą się w ciągu godziny i nie są powodem do niepokoju. Gdy 2% roztwór alginianu się rozpuści, zmniejsz prędkość mieszania.Powoli dodawać równą objętość roztworu D-glukonianu wapnia do roztworu alginianu. Powolne dodawanie go pomoże zapobiec tworzeniu się sieciujących się grudek. Po dodaniu roztworu glukonianu wapnia zwiększ prędkość mieszania i energicznie mieszaj przez 15 minut.Przechyl naczynie na bok, aby usunąć wszelkie grudki, które mogły się utworzyć. Po energicznym mieszaniu przez 15 minut upewnij się, że w roztworze nie ma grudek. Odpipetować roztwór do płytki 48- lub 24-dołkowej.W przypadku płytki 48-dołkowej należy odpipetować 300 mikrolitrów do każdego dołka. Upewnij się, że rzucasz powoli i często zmieniasz końcówki, ponieważ roztwór będzie lepki i może przykleić się do końcówki. W przypadku płytki 24-dołkowej należy odpipetować jeden mililitr do każdej studzienki.Również w tym przypadku odlewać powoli i często zmieniać końcówki pipet. Przykryj płytki dołka pokrywką i zamroź przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przygotuj płytki do liofilizatora, zdejmując pokrywki i zabezpieczając górę chusteczkami i gumkami.Umieść płytki w probówce liofilizatora i nałóż na liofilizator na 72 godziny. Po 72 godzinach wyjmij płytkę z liofilizatora. Rusztowania są teraz gotowe do użycia w transporcie.Jeśli rusztowania nie są używane od razu, uszczelnij płytkę Parafilmem i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna. W przypadku długotrwałego przechowywania zaleca się uszczelnienie próżniowe płytki oprócz uszczelnienia za pomocą Parafilm. Zagęścić supernatant wirusa, odwirowując dwa mililitry roztworu wirusowego przez filtr odśrodkowy o stężeniu 1,500 g przez 10 minut.Potrzeba od 100 do 200 mikrolitrów skoncentrowanego wirusa na rusztowanie. Wirować przez kilka dodatkowych minut, jeśli objętość stężonego roztworu wirusa jest większa niż 200 mikrolitrów. Dla każdego rusztowania należy wykonać porcję 1 miliona aktywowanych limfocytów T zawieszonych w 50 mikrolitrach kompletnej pożywki do hodowli komórkowych.Dodać skoncentrowany wirus do zawiesiny komórkowej. Całkowita objętość zawiesiny wirusa komórkowego nie powinna przekraczać 200 mikrolitrów w przypadku rusztowania 48-dołkowego lub 350 mikrolitrów w przypadku rusztowania 24-dołkowego. Dodaj mieszaninę wirusów komórkowych kroplami na szczyt suchego rusztowania.Do eksperymentów z kontrolą ujemną należy użyć kompletnych pożywek do hodowli komórkowych zamiast skoncentrowanego wirusa. Dodaj tę zawiesinę komórkową na szczyt suchego rusztowania. Inkubować rusztowania w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut.Usuń rusztowania z inkubatora. W tym czasie rusztowania powinny w pełni wchłonąć roztwór. Aby wywołać proliferację, dodaj do każdej studzienki kompletne pożywki do hodowli komórkowych uzupełnione IL-7 i IL-15.Można również stosować IL-2. W przypadku rusztowania 24-dołkowego dodaj jeden mililitr. W przypadku rusztowania 48-dołkowego dodaj 500 mikrolitrów.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Komórki będą się namnażać w ciągu 72 godzin, co może zmienić kolor podłoża na pomarańczowy. Usuń nadmiar pożywki z każdej studzienki.Aby wyizolować komórki z rusztowania, dodaj 0,25 molowego roztworu EDTA do każdego rusztowania. Dodaj jeden mililitr dla rusztowań 24-dołkowych lub 300 mikrolitrów dla rusztowań 48-dołkowych. Pozostaw talerz na stole lub delikatnie mieszaj przez trzy do czterech minut.Po całkowitym rozpuszczeniu delikatnie wlej i wyjmij pipetą do studzienki. Do całkowitego rozpuszczenia rusztowania może być konieczne wykonanie kilku etapów pipetowania. Przenieś roztwór do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Umyj komórki dwukrotnie PBS. Dodaj 12 mililitrów PBS do każdej probówki wirówkowej. Wirować przy 400 g przez pięć minut.Na dnie rurki utworzy się osad komórkowy. Odessać roztwór sklarowanego osadu i powtórzyć pranie. Uważaj, aby całkowicie usunąć supernatant przy każdym praniu, ponieważ bardzo ważne jest, aby pozbyć się całego EDTA.Po ponownym umyciu PBS osad komórkowy jest gotowy do analizy. Do określenia wydajności transdukcji każdej grupy wykorzystano cytometrię przepływową. Komórki nietransdukowane zastosowano jako kontrolę ujemną i nie wykazały transdukcji.Komórki wysiane na rusztowaniach bez retrowirusa GFP również nie wykazywały transdukcji. Grupa Drydux, która miała aktywowane komórki wysiane na suche makroporowate rusztowania alginianowe, wykazała 85% transdukcję, nieco niższą niż grupa RetroNectin. Wyniki te pokazują, że rusztowania Drydux skutecznie transdukują komórki poprzez retrowirusowy transfer genów bez konieczności spinokulacji płytek pokrytych retronektyną.Rusztowania Drydux wykazują wysoką wydajność transdukcji porównywalną z RetroNektyną, stanowiąc alternatywną metodę transdukcji limfocytów T. Ze względu na niski koszt produkcji rusztowań Drydux, proces ten może znacznie obniżyć koszty terapii komórkami T CAR.

fabrication-use-dry-macroporous-alginate-scaffolds-for-viral

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje procedurę wytwarzania mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą elektrorozpylania. Te mikronośniki symulują natywne mikrośrodowisko specyficzne dla tkanek i są stabilne w długoterminowych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro.

Wytwarzanie rusztowań biologicznych przez elektronatryskiwanie: technika generowania rusztowań mikronośnikowych pochodzących z zewnątrzkomórkowej macierzy tkanki pozbawionej komórek

Celem tego protokołu jest produkcja specyficznych dla patogenów klinicznych limfocytów T przy użyciu laboratoryjnego, zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, które zawiera zamknięty system wychwytywania cytokin i nie wymaga dedykowanego personelu ani korzystania z urządzenia GMP. Wygenerowane limfocyty T specyficzne dla wirusa cytomegalii pp65 mogą być bezpośrednio podawane pacjentom.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych

Poznaj metodę wytwarzania suchych makroporowatych rusztowań alginianowych Drydux do transdukcji wirusowej limfocytów T. Protokół zapewnia ponad 85% wydajność transdukcji, oferując tańszą alternatywę dla standardowych metod w terapii CAR-T.

Wytwarzanie i stosowanie suchych makroporowatych rusztowań alginianowych do transdukcji wirusowej limfocytów T

Przeglądaj więcej filmów