Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych

Rak piersi jest powszechną i śmiertelną chorobą o ograniczonych strategiach zapobiegawczych, które wiążą się z poważnymi negatywnymi skutkami ubocznymi. Aby zapewnić metodę o zmniejszonych skutkach ubocznych, opracowaliśmy technikę doprzewodowego wstrzykiwania roztworu ablacyjnego na bazie etanolu do drzewa przewodowego sutka szczura, która pozwala na jednoczesne obrazowanie in vivo i profilaktykę raka piersi. Opiera się to na wcześniejszych pracach na myszach, u których wstrzyknięcie bezpośrednio do otworu sutka pozwala na celowanie w komórki nabłonka sutka przy minimalnym uszkodzeniu tkanki pobocznej.

Zarówno myszy, jak i szczury mają gruczoły sutkowe zawierające pojedyncze drzewo przewodowe pochodzące z otworu sutkowego. Szczury są większe od myszy i pozwalają na wstrzyknięcie większej objętości etanolu w celu zbadania sukcesu ablacji, aby udowodnić skalowalność modelu. Kolejnym udoskonaleniem tej metody jest dodanie etylocelulozy do roztworu ablacyjnego.

Etyloceluloza była wcześniej stosowana w innych podejściach klinicznych w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się etanolu z dala od docelowego obszaru. Osiąga się to poprzez charakter związku, który powoduje, że żeluje się, gdy styka się z płynem w tkance. Istnieje pięć kluczowych kroków związanych z tą metodą profilaktyki raka piersi z weryfikacją obrazu.

Musimy najpierw zacząć podawać zwierzętom karprofen doustnie, używając kubków z żelem sukralozowym przygotowanych w laboratorium. To rozszerzone leczenie przeciwzapalne jest utrzymywane przed i po zabiegu. Następnie usuwamy sierść z obszaru otaczającego sutki, do których ma być wstrzyknięte krem do depilacji, aby przygotować zwierzę do wstrzyknięć.

Iniekcje wewnątrzprzewodowe są następnie wykonywane za pomocą stereoskopu wspomagającego wizualizację otworu sutka do wprowadzenia igły. Zwierzęta są skanowane lub oceniane za pomocą mikrotomografii komputerowej lub fluoroskopii po wstrzyknięciu w celu określenia powodzenia wstrzyknięć. Skany mikrotomografii komputerowej mogą być następnie przetwarzane w celu stworzenia rekonstrukcji 3D wstrzykniętego drzewa przewodowego sutka w celu dalszej analizy udanego wypełnienia.

Karprofen podstawowy jest najpierw rozcieńczany w PVS do wymaganego stężenia. Do mieszaniny można dodać sterylny barwnik spożywczy, aby lepiej potwierdzić pełne wymieszanie leku z sukralozą kubka. Filiżanki są następnie podgrzewane w łaźni wodnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Suszenie kubków po wyjęciu i czyszczenie pokrywki kubka 70% etanolem zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. Roztwór karprofenu można wstrzykiwać bezpośrednio do kubka za pomocą strzykawki w celu przekłucia pokrywki. W takim przypadku musimy wstrzyknąć 500 mikrolitrów, aby uzyskać pożądany rezultat.

Uszczelnij otwór naklejką, a następnie potrząsaj kubkiem przez 15 sekund, a następnie wiruj przez dodatkowe 15 sekund. Jednorodne mieszanie można ocenić, szukając grudek koloru ciemnoniebieskiego. Kubki można następnie przechowywać w lodówce, dopóki nie będą potrzebne.

Zwierzęta należy przygotować na dwa do trzech dni przed planowanym wstrzyknięciem. Znieczulić zwierzę za pomocą inhalacji izofluranu. Przenieś znieczulonego szczura do stożka nosowego na podkładce rozgrzewającej.

Nałóż smar do oczu szczura na stożek nosa, a następnie ułóż zwierzę na grzbiecie. Krem do depilacji można nakładać na obszar sutków, który planujesz wstrzyknąć za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Szybsze rozluźnienie sierści można osiągnąć, pocierając aplikatorem w górę iw dół po skórze zwierzęcia w pożądanym obszarze.

Ważne jest, aby pozostawić krem na szczurze tak krótko, jak to możliwe, aby uniknąć poparzenia skóry. Szczury są jeszcze bardziej wrażliwe na tę procedurę niż myszy. Po 10 do 30 sekundach od aplikacji użyj ciepłej wody na gazie, aby całkowicie usunąć krem.

Użyj trzech do czterech płukanek, aby zapewnić całkowite usunięcie przed wysuszeniem skóry czystą gazą. Potwierdź dobrą widoczność i dostęp do sutków w miejscach usuwania sierści. W razie potrzeby powtórz procedurę depilacji.

Umieść szczura w czystej klatce regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej, aby wyzdrowiał ze znieczulenia. Daj jeden kubek karprofenu przygotowanym szczurom w ich domowej klatce po wyzdrowieniu. Zaczniesz od znieczulenia zwierzęcia za pomocą wziewnego znieczulenia izofluranem i przeniesiesz szczura do stożka nosowego, gdy zostanie on w pełni wywołany.

Smar do oczu należy nałożyć przed umieszczeniem zwierzęcia na grzbiecie do wstrzyknięć. Pomocne może być przyklejenie taśmą nóg w pobliżu sutków, które zostaną wstrzyknięte, ale nie jest to konieczne. Po przygotowaniu strzykawki z żądaną objętością roztworu do wstrzykiwań, należy przygotować brodawkę, usuwając widoczny martwy naskórek za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, jeśli to możliwe.

Najczęstszym obszarem niepokoju jest sam otwór brodawki. Szczury często mają korek wystający z otworu. Usunięcie tej wtyczki może pomóc w lepszej kaniulacji.

Mając widoczny skos igły, włóż igłę w końcówkę sutka z pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Uważaj, aby podążać za ścieżką otworu smoczka. Sutki szczurów mają zwykle więcej tłuszczu wokół otworu, co ułatwia wbicie się w ten tłuszcz i błędnie uważają, że osiągnąłeś kaniulację z powodu zaawansowania igły.

Gdy skos igły zostanie całkowicie otoczony przez sutek, zacznij powoli wstrzykiwać roztwór. Pożądana szybkość to około 100 mikrolitrów na minutę u szczurów. Należy unikać wstrzykiwania szybciej, aby zapobiec możliwemu uszkodzeniu drzewa kanałowego.

Po całkowitym wstrzyknięciu należy odczekać 30 sekund przed wyjęciem igły z brodawki sutkowej przy pomocy kleszczy. Zmniejszy to prawdopodobieństwo wycieku z brodawki. Jeśli dojdzie do wycieku, użyj zwilżonej gazy lub chusteczki do etanolu, aby usunąć roztwór.

Kontrast i rozlany roztwór mogą zniekształcić uzyskane obrazy. Tutaj widzimy powiększony film z sekwencją wstrzykiwania, która właśnie została wyświetlona. Zauważ, że oddech zwierzęcia utrudnia utrzymanie sutka w jednej płaszczyźnie ogniskowej.

Może to utrudnić wstrzyknięcie, ponieważ sutek nie pozostaje w stałym miejscu. Problem ten pogarsza bliskość klatki piersiowej i trzech górnych par gruczołów. Zatyczka w otworze smoczka została teraz usunięta w celu lepszej kaniulacji.

Igła może być teraz zorientowana skośnie do góry, aby wsunąć ją w sutek za pomocą kleszczy. Po całkowitym włożeniu skosu można rozpocząć wstrzykiwanie. Jeśli przyjrzysz się uważnie lewej stronie brodawki sutkowej, możesz zauważyć wzrost niebieskiego odcienia w miejscu, w którym roztwór do wstrzykiwań jest lekko widoczny, rozprzestrzeniając się po drzewie przewodowym.

Jest to znacznie mniej widoczne u szczura ze względu na grubszą skórę. Tutaj możemy zobaczyć usunięcie igły 30 sekund po zakończeniu wstrzyknięcia i powstały roztwór wylewający się z brodawki. Dodatkowy roztwór jest usuwany, co pozwala na ocenę obszaru, w którym nie widzimy urazu brodawki sutkowej lub wypukłości tego obszaru, co wskazywałoby na wstrzyknięcie poduszeczki tłuszczowej.

W przypadku wstrzykiwania roztworu zawierającego etanol należy zachować ostrożność, aby uniknąć zatrucia alkoholem. Wymaga to wiedzy o tym, ile etanolu można wstrzyknąć podczas jednej sesji i podawania roztworu zawierającego sacharozę IP podczas zabiegu, aby przeciwdziałać skutkom. Po wstrzyknięciu zwierzęta mogą zostać odzyskane w czystej klatce na poduszce grzewczej lub przeniesione do mikrotomografii komputerowej w celu zobrazowania udanego wstrzyknięcia.

Po przeniesieniu zwierzęcia, któremu wstrzyknięto pomoc, należy kontynuować podawanie izofluranu w celu utrzymania znieczulenia podczas obrazowania. Zwiększony rozmiar szczura wymaga dodatkowej manipulacji pozycją, aby uzyskać dobry obraz. Wyprostowanie kręgosłupa przed przyklejeniem taśmą nóg w pobliżu miejsca, które ma być zobrazowane, jest pomocne w generowaniu spójnych obrazów.

Klepanie nóg w wyprostowanej pozycji może zapobiec sytuacji, w której kości staną się centralnym punktem obrazu. Odkryliśmy również, że przyklejanie taśmy w poprzek brzucha szczura może pomóc w zmniejszeniu artefaktu oddychania dla dolnych gruczołów. Dopuszczalnych jest kilka parametrów skanowania w celu wizualizacji obróbki kanałowej.

Jednak przy doborze parametrów zawsze należy brać pod uwagę dawkę promieniowania. Dawka promieniowania wynikająca z tych skanów nie powinna przekraczać limitów promieniowania dla danego szczepu szczurów. Analiza fluoroskopowa, a nie akwizycja obrazu, może znacznie zmniejszyć ogólne obciążenie promieniowaniem.

Po wykonaniu wszystkich skanów lub ocen zwierzę może zostać zwrócone do czystej klatki regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej. Zwierzę powinno być monitorowane do czasu całkowitego wyzdrowienia i powrotu do klatki domowej. Kubeczki z karprofenem należy dostarczać co najmniej do siedmiu dni po wstrzyknięciu.

Oprogramowanie w aparacie microCT, którego używamy, pozwala na tworzenie szybkich odczytów w celu oceny powodzenia iniekcji bez formalnej analizy. Ta funkcja ma prosty suwak kontrastu, który pozwala na rozsądną redukcję sygnału do szumu. Podstawową wadą tych wersji jest to, że cały obraz musi być jednocześnie progowy.

Dzięki temu jasne sygnały, które wyraźnie nie są częścią drzewa przewodowego, takie jak żelazo w diecie, mogą pozostać na obrazie. W niektórych przypadkach prawdziwy sygnał, jak widać tutaj, jest tak ciemny jak tło i można go łatwo usunąć z obrazu. Lepsze przedstawienia formalne można uzyskać za pomocą bardziej zaawansowanego oprogramowania analitycznego, które umożliwia segmentację obszaru zainteresowania.

Najlepiej jest podzielić poduszeczkę tłuszczową sutka na segmenty w celu dalszego przetwarzania obrazu, aby uzyskać najlepsze odwzorowanie wstrzykniętego drzewa przewodowego. Ciemna granica poduszeczki tłuszczowej sutka może być narysowana przez splajn na całej grubości zwierzęcia w celu uzyskania tej segmentacji. Śledzenie co trzeciego przekroju i propagowanie obiektu wystarczy, aby uchwycić cały kanał w naszym doświadczeniu.

W tym momencie możliwe jest progowanie odwzorowania za pomocą danej wściekłości, aby wyświetlić tylko kontrast zawarty w poduszce tłuszczowej sutka. Powinno to obejmować roztwór w drzewie kanałowym, a także wszelkie wycieki w bezpośrednim sąsiedztwie. Roztwory tlenku tantalu są na ogół dobrze widoczne w zakresie od 300 do 3000 HU. Dalszą analizę można przeprowadzić po utworzeniu rekonstrukcji drzewa kanałowego.

Jeśli obrazowanie podłużne nie jest pożądane, można uzyskać obrazy o wyższej rozdzielczości, które lepiej oddają złożoną architekturę drzewa kanałowego. Różnice między zwierzętami mogą sprawić, że wstrzyknięcie będzie mniej lub bardziej trudne. Nie możemy mówić o zmienności między szczepami, ponieważ obecnie pracujemy wyłącznie ze szczurami Sprague Dawley.

Niektóre zwierzęta będą miały sutki o niskich profilach, takie jak ten na zdjęciu, co utrudnia manipulację i osiągnięcie udanej kaniulacji. Inne będą miały sutki o wyższym profilu, takie jak ten pokazany tutaj, które będą bardziej podatne na kaniulację. Na zdjęciu przedstawiono pomyślnie kaniulowany sutek.

Trudności w kaniulacji mogą spowodować uraz brodawki sutkowej, jak pokazano tutaj. Akwizycja obrazów mikrotomografii komputerowej bezpośrednio po wstrzyknięciu może lepiej informować badaczy o powodzeniu iniekcji, a także pomóc w określeniu właściwości wypełnienia niektórych roztworów. Tutaj widzimy różne aspekty gruczołów brzusznych tego samego szczura, któremu wstrzyknięto tę samą objętość roztworu ablacyjnego zawierającego 70% etanolu z kontrastem zapewnionym przez 100-milimolowy tlenek tantalu.

Roztwór zastosowany w pokazanym górnym gruczole również zawierał 1% etylocelulozy. Widzimy struktury przypominające ściany na końcach odgałęzień kanałowych. Są to końcowe pąki końcowe wypełnione roztworem i nie rozlewające się.

W dolnym rzędzie widzimy mniej zdefiniowane końce przewodów wskazujące na ucieczkę roztworu z drzewa kanałowego. To, wraz z bardziej ograniczonymi uszkodzeniami ubocznymi w badaniu histologicznym. wydaje się wskazywać na lepszą retencję roztworów zawierających etylocelulozę do drzewa przewodowego.

Metoda ta stanowi krok w kierunku skalowalności mniej inwazyjnej metody zapobiegania rakowi piersi, aby zaoferować alternatywę dla profilaktycznej mastektomii. Wykazano udaną ablację nabłonka w większym modelu gryzoni przy minimalnych skutkach ubocznych dla zwierzęcia. Dodatek etylocelulozy do roztworu ablawacyjnego pozwala na lepsze zatrzymanie roztworu w miejscu wstrzyknięcia, co skutkuje zmniejszeniem szkód ubocznych.

Nowatorskie zastosowanie rozwiązań, które zostały sprawdzone klinicznie, oraz dodatkowa możliwość wizualizacji sukcesu porodu za pomocą popularnych metod obrazowania pozwala na gotowe wdrożenie do praktyki klinicznej.