Name: Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Poznaj metodę wewnątrzprzewodowego wstrzyknięcia etanolowego roztworu ablacyjnego do gruczołów mlecznych szczura w celu profilaktyki raka piersi z minimalnym uszkodzeniem tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty National Cancer Institute R21 CA226579 i R01 CA258314 dla LFS oraz przez National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 grant dla EMS. Jesteśmy wdzięczni ośrodku MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core za wykorzystanie ich systemów obrazowania i wiedzy technicznej. Dziękujemy dr Danielle Ferguson za zapoznanie się z treścią filmu i danymi liczbowymi pod kątem przestrzegania wytycznych dotyczących dobrostanu zwierząt.

Wszystkie opisane eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Michigan.
1. Rozszerzone leczenie przeciwzapalne
<ol>
	<li>Przygotuj kubki z żelem sukralozowym jako doustne dawkowanie karprofenu. Zapewnij szczurom to leczenie przeciwzapalne od 2 dni przed otrzymaniem iniekcji ID 70% EtOH do 7 dni po zabiegu.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór roboczy karprofenu w sterylnym PBS do wstrzykiwań do kubka. Z roztworu podstawowego o stężeniu 50 mg/ml przygotować rozcieńczony roztwór o stężeniu 2 mg/ml zabarwiony 1% v/v sterylnym niebieskim barwnikiem spożywczym i wstrzyknąć 500 μl do każdej filiżanki. Dodanie barwnika pomaga w wizualizacji całkowitego wymieszania leku z sukralozą kubka.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta, aby przygotować kubek na dodanie karprofenu. O ile sprzedawca nie wskaże inaczej, podgrzej kubek w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C przez 15 minut i wysusz po wyjęciu, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
	<ol>
		<li>Wytrzyj pokrywkę kubka z sukralozą z 70% EtOH w tym miejscu i wprowadź igłę strzykawki zawierającej roztwór roboczy karprofenu. Dozować odpowiednią objętość (500 μL).</li>
		<li>Przykryj nakłucie naklejką. Potrząsaj filiżanką energicznie przez 15 s, a następnie umieść ją w wirze na dodatkowe 15 sekund. Oceń wizualnie jednorodne i kompletne wymieszanie przed przechowywaniem do późniejszego użycia. Zwróć uwagę na obecność ciemnoniebieskiego koloru. 
		UWAGA: Pozwól, aby filiżanki osiągnęły temperaturę pokojową. W razie potrzeby przechowuj kubki w temperaturze pokojowej, ale zwróć uwagę na wskazówki producenta dotyczące skuteczności leku. Alternatywnie przechowuj kubki w temperaturze 4 °C i zużyj w ciągu miesiąca. Datowanie naklejki jest dobrą praktyką pozwalającą śledzić datę wstrzyknięcia bez ryzyka, że długopis lub ostry marker przebije wieczko.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tuż przed użyciem przetrzyj zewnętrzną część kubka 70% EtOH. Zdejmij pokrywkę przed umieszczeniem kubka w klatce dla zwierząt. Wymieniaj kubki co drugi dzień lub gdy są puste. Codziennie sprawdzaj poziom żelu, aby zapewnić odpowiednią dawkę. Jedna filiżanka może dostarczyć karprofen maksymalnie dwóm szczurom przez okres do 2 dni; Jednak szczury mogą wcześniej spożyć całą filiżankę.</li>
</ol>
2. Przygotowanie przedoperacyjne
UWAGA: Upewnij się, że etap przygotowania zwierzęcia poprzedza procedurę wstrzyknięcia ID o 2-3 dni.
<ol>
	<li>Włącz parownik izofluranu (2%-3% izofluranu, 1,5 l/min tlenu), aby znieczulić szczura. Przenieś zwierzę do stożka nosowego na podkładce rozgrzewającej. Nałóż smar do oczu na szczura, a następnie ułóż zwierzę na grzbiecie. Uważnie monitorować oddech zwierzęcia, aby upewnić się, że płaszczyzna znieczulenia jest utrzymywana na poziomie 1%-3% izofluranu. 
	UWAGA: Elektryczna maszynka do golenia może być używana do usuwania nadmiaru sierści przed depilacją. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić sutków maszynką do golenia. Z tego powodu ten krok można pominąć. Szczury są bardziej wrażliwe na krem do depilacji niż myszy, dlatego usunięcie nadmiaru kremu jest bardzo ważne. Unikaj wstrzykiwania roztworu zawierającego etanol w obszar, na którym występuje już otarcie spowodowane depilacją. Niektóre kremy zawierają związki takie jak aloes i lanolina, które mogą pomóc zminimalizować prawdopodobieństwo otarć.</li>
	<li>Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby rozprowadzić dostępny bez recepty krem do depilacji na obszarze brodawek sutkowych. Za pomocą aplikatora wcieraj krem w obszar przez 10-30 s. Sprawdź, czy futro szybko się poluzowało.
	<ol>
		<li>Pozostaw krem na szczurze na jak najkrótszy odstęp czasu i całkowicie usuń, aby uniknąć pieczenia skóry. Szczury są jeszcze bardziej wrażliwe na tę procedurę niż myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 10-30 s od aplikacji zwilż gazę ciepłą wodą i użyj jej do spłukania kremu i rozluźnionej sierści zwierzęcia. Wykonaj co najmniej trzy płukania obszaru świeżo zwilżoną gazą i osusz suchą gazą po ostatnim spłukaniu. Upewnij się, że widoczność jest dobra i dostęp do obszaru sutka, z którego usuwane jest futro. W razie potrzeby powtórz procedurę depilacji.</li>
	<li>Umieść szczura w czystej klatce na poduszce grzewczej i pozwól mu dojść do siebie. Sprawdź szczura, aby upewnić się, że jest w pełni wyleczony ze znieczulenia, zanim przyniesiesz go z powrotem do stałej klatki.</li>
	<li>Umieścić jeden kubek z karprofenem (1 mg / filiżankę) sukralozy w żelu w klatce w celu leczenia przeciwzapalnego. Codziennie sprawdzaj zużycie żelu i w razie potrzeby wymień go na świeży kubek. Nie zostawiaj kubka na dłużej niż 2 dni. Zazwyczaj kubki będą musiały zostać wymienione po 1 dniu.</li>
</ol>
3. Iniekcja wewnątrzprzewodowa
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy TaOx o stężeniu 333,3 mM zgodnie z opisem19 używając sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Podgrzej roztwór, jeśli proszek nie rozpuści się całkowicie. Delikatnie wymieszaj. Nie wirować ani energicznie nie wstrząsać, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Wymieszaj trzy części 333,3 mM TaOx z siedmioma częściami 100% EtOH, aby uzyskać końcowy roztwór 70% EtOH100 mM/TaO x. Opcjonalnie dodaj odpowiednią ilość 0,5%-1,5% etylocelulozy (EC) jako środek żelujący, aby zmaksymalizować miejscową retencję roztworu ablacyjnego. Dodać 1% v/v niebieskiego barwnika spożywczego do roztworu ablacyjnego w celu wizualnego zbadania dostarczania do drzewa przewodowego podczas infuzji.</li>
	<li>Przygotuj wolumin odpowiedni do potrzeb eksperymentalnych. Pary gruczołów 1 (szyjka macicy) i 6 (pachwinowa) można wypełnić do 100 μl roztworu, podczas gdy wszystkie pozostałe pary można wypełnić do 300 μl.</li>
	<li>Znieczulij szczura jak w kroku 2.1 i przenieś szczura do stożka nosowego po pełnym znieczuleniu. Nałóż smar do oczu na oba oczy, a następnie połóż zwierzę na grzbiecie. W razie potrzeby zabezpiecz szczura pod stereoskopem za pomocą taśmy w pobliżu sutków, które zostaną wstrzyknięte. Waga szczura jest na ogół wystarczająca, aby nie poruszał się znacznie bez taśmy.</li>
	<li>Aby przygotować brodawki sutkowe do wstrzyknięcia, należy usunąć martwy naskórek pokrywający otwór brodawki sutkowej cienkimi, spiczastymi kleszkami, jeśli to możliwe. Szczury często mają zatyczkę wystającą z otworu sutka, która może uniemożliwić pomyślną kaniulację brodawki, jeśli nie zostanie usunięta. 
	UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że większe objętości roztworów ablacyjnych stosowane u szczurów mogą z większym prawdopodobieństwem spowodować powierzchowne rany skóry w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Z tego powodu wstrzykiwanie co drugiego sutka podczas jednej sesji jest mniej szkodliwe i drażniące dla zwierzęcia niż wstrzykiwanie sąsiednich sutków. Monitorowanie szczurów pod kątem jakichkolwiek otarć przez 7 dni po wstrzyknięciu pomaga zapewnić, że drapanie zwierzęcia nie ma poważnych skutków zdrowotnych wynikających z drapania zwierzęcia i wprowadzania możliwości zakażenia przez zanieczyszczenie resztkami podłogi klatki. Potrójna maść z antybiotykiem lub płukanie roztworem chlorheksydyny mogą być stosowane w leczeniu wszelkich objawów infekcji, która może wystąpić (Tabela 1).</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 500 μl z igłą 33 G odessać 101-301 μl roztworu ablalacyjnego. Odessać dodatkowy 1 μl roztworu w celu ewentualnego niewielkiego wycieku podczas wyjmowania igły kaniulowanej. 
	UWAGA: Są to zalecenia dotyczące objętości mających na celu pełne wypełnienie drzewa (drzew) przewodowych: do 100 μl w gruczołach szyjnych i pachwinowych oraz do 300 μl w pozostałych gruczołach. W przypadku innych zastosowań może być właściwe użycie mniejszych lub większych woluminów.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby delikatnie przytrzymać sutek i wprowadzić igłę do otworu smoczka. Delikatnie kontynuuj wkładanie igły, aż skos znajdzie się całkowicie wewnątrz smoczka. Aby umieścić igłę w smoczku, należy podnieść sutek w kierunku igły, zamiast wciskać igłę w sutek. (Tabela 1). Uważaj, aby podążać ścieżką otworu smoczka. 
	UWAGA: Sutki szczurów są na ogół znacznie łatwiejsze do manipulowania i skutecznego kaniulowania niż te u myszy ze względu na większy rozmiar. Jednak zwiększona ilość tłuszczu otaczająca otwór sutka zwiększa również prawdopodobieństwo omyłkowego wstrzyknięcia poduszeczki tłuszczowej, jeśli igła odchyla się od głównego kanału.</li>
	<li>Po całkowitym wprowadzeniu skosu igły należy powoli podawać roztwór ze stałą szybkością około 100 μl/min u szczurów. Nagłe zmiany szybkości infuzji mogą spowodować pęknięcie lub uszkodzenie drzewa przewodowego. Odczekać 30 s po zakończeniu infuzji przed wyjęciem igły z kaniulowanego drzewa z pomocą kleszczy; gwarantuje to, że wstrzyknięta objętość pozostaje w drzewie kanałowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) i zmniejsza prawdopodobieństwo wycieku.</li>
	<li>Oczyść rozlany roztwór zwilżoną gazą lub chusteczką EtOH, aby uniknąć obcego roztworu kontrastowego na obrazach.</li>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo PBS zawierający 5% sacharozy (10 ml/kg) w celu złagodzenia skutków zatrucia alkoholem, jeśli etanol znajduje się w roztworach do wstrzykiwań ID. Dawka ta może być podawana na początku i na końcu zabiegu.</li>
</ol>
4. Obrazowanie mikro-CT
<ol>
	<li>Po wstrzyknięciu wszystkich pożądanych gruczołów należy szybko przenieść zwierzę do systemu mikro-CT i kontynuować utrzymywanie znieczulenia za pomocą dołączonego parownika izofluranu.</li>
	<li>Wyprostuj kręgosłup zwierzęcia i przyklej każdą tylną nogę w wyprostowanej pozycji, tak aby kości nóg zwierzęcia znajdowały się dalej od dolnych gruczołów będących przedmiotem zainteresowania i nie zachodziły na obszar zainteresowania na zeskanowanym obrazie.</li>
	<li>Przyklej taśmę w poprzek brzucha, aby zminimalizować zakłócenia oddychania podczas skanowania dolnych gruczołów. 
	UWAGA: Zwierzęta mogą być obrazowane za pomocą różnych parametrów skanowania (np. wysokiej rozdzielczości, skany podłużne), jeśli zostanie zachowana ostrożność w celu określenia odpowiedniej dopuszczalnej dawki promieniowania w ciągu całego życia dla szczurów i upewnienia się, że dawka skumulowana nie przekracza tego poziomu. Narażenie na promieniowanie można dodatkowo zmniejszyć, pobierając zdjęcia i filmy z fluoroskopii bez wykonywania skanów (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie TaOx drzewa kanałowego szczura z dobrą rozdzielczością i możliwością powtórzenia standardowych (2 min) skanów akwizycyjnych przy użyciu następujących parametrów skanowania: 90 kVp/88 μA; pole widzenia (FOV), 72 mm; liczba warstw, 512; grubość warstwy, 72 μm; rozdzielczość wokseli, 72 μm3. Skany o wysokiej rozdzielczości przez dłuższy czas (4-14 minut) można również uzyskać u zwierząt, które nie będą skanowane wzdłużnie przy użyciu tych samych parametrów.</li>
	<li>Po pobraniu danych ostrożnie odsuń szczura od stożka anestezjologicznego i umieść go w nowej, czystej klatce na poduszce grzewczej. Sprawdź szczura, aby upewnić się, że w pełni wyzdrowiał po znieczuleniu, zanim przyniesiesz go z powrotem do stałej klatki. Umieścić kubek z sukralozą zawierającą karprofen i odpowiednio wymienić, jak opisano w kroku 2.5, aby zapewnić, że zwierzęta będą nadal otrzymywać leczenie przeciwzapalne przez następne 7 dni.</li>
	<li>Przetwarzaj zeskanowane obrazy na szybkie odwzorowania w oprogramowaniu mikro-CT, aby lepiej dostrzec wszelkie wycieki kontrastu, tylko częściowe wypełnienie lub przepełnienie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Przejdź do następnej sekcji, aby przeprowadzić formalne przetwarzanie obrazu do publikacji lub szczegółowej analizy skanów, jeśli jest to pożądane (Rysunek 3).</li>
</ol>
5. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Użyj specjalistycznych pakietów oprogramowania, aby stworzyć renderingi wypełnionego drzewa kanałowego. 
	UWAGA: Najlepiej jest podzielić poduszeczkę tłuszczową sutka, aby uzyskać najlepsze odwzorowanie wstrzykniętego drzewa przewodowego. Splajn Śledź ciemne granice poduszeczki tłuszczowej na całej grubości zwierzęcia, aby osiągnąć tę segmentację.</li>
	<li>Aby podzielić poduszeczkę tłuszczową (w przeciwieństwie do myszy, granice tego przedziału nie są tak łatwe do odróżnienia od jamy otrzewnej, mięśni udowych i skóry ze względu na podobne jednostki Hounsfielda), w której znajduje się interesujące nas drzewo przewodowe, wybór opcji "ślad splajnu" z menu ręcznego jest pierwszym krokiem do stworzenia renderingu.</li>
	<li>Splajn Śledź kontur poduszeczki tłuszczowej w co trzecim plasterku. Kliknij opcję Propaguj obiekty w menu półautomatycznym. Spowoduje to rozpowszechnienie i połączenie wszystkich plasterków w jeden podzielony na segmenty obiekt zainteresowania. 
	UWAGA: Zmiana progu w podzielonym na segmenty obszarze umożliwia wizualizację sygnału tylko w pewnym zakresie jednostek Hounsfielda (HU); W przypadku innych środków kontrastowych lub parametrów obrazowania zakres ten może wymagać korekty. Pakiet oprogramowania lub analiza sztucznej inteligencji mogą być wykorzystane do wykonania innych pomiarów i obrazów, aby pokazać, jak bardzo drzewo kanałowe zostało wypełnione.</li>
	<li>Ustaw wartości HU na najniższy punkt 300 i najwyższy punkt 3,000 w menu półautomatycznym pod zakładką głośności progowej. Pozwala to na stworzenie odwzorowania wyświetlającego tylko kontrast (TaOx) w obrębie drzewa przewodowego.</li>
	<li>Ustaw wersję jako podstawową za pomocą przycisku "widok". Spowoduje to zmianę wyświetlacza tak, aby pokazywał tylko odwzorowanie 3D drzewa kanałowego. 
	UWAGA: Wykonaj rekonstrukcję drzewa kanałowego w celu dalszej analizy.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jak pokazano tutaj, dostarczanie ID 70% EtOH preferencyjnie abluje komórki nabłonka sutka z ograniczonym uszkodzeniem ubocznym otaczającego zrębu i naczyń krwionośnychu myszy 4. Miejscowa ablacja drzewa przewodowego jest skuteczna w zapobieganiu powstawaniu nowotworów w modelach mysich4. Tutaj pokazujemy, że ta procedura ablacyjna może być skalowana na szczury.
Jest to kolejny krok na drodze do zastosowania tej procedury ablacyjnej jako alternatywnej interwencji wobec profilaktycznej mastektomii w prewencji pierwotnej raka piersi u osób z grupy wysokiego ryzyka. Dodanie nanocząstek TaOx jako rentgenowskiego środka kontrastowego do roztworu ablacyjnego pozwala ocenić skuteczność roztworu w zapobieganiu powstawaniu nowotworu, ponieważ można określić, czy zabieg zakończył się sukcesem, czy też nie, w całkowitym wypełnieniu drzewa przewodowego. Użycie fluoroskopii do wizualizacji wstrzykniętego gruczołu sutkowego odzwierciedla to, co prawdopodobnie zostanie zrobione w klinice, aby pokierować tą procedurą identyfikacji. Wskazówki obrazowe dotyczące tego, jak bardzo roztwór wypełnił drzewo przewodowe i kiedy należy przerwać infuzję, będą kluczowym aspektem wdrożenia klinicznego w celu zapewnienia maksymalnego wypełnienia każdego drzewa przewodowego. Rozwiązywanie problemów i pomocne wskazówki są wymienione w Tabeli 1. Skuteczność tej procedury ablacyjnej wymaga, aby podawany roztwór miał bezpośredni kontakt ze wszystkimi komórkami nabłonka, aby zmaksymalizować szybkość zabijania komórek. Zapasowe komórki nabłonkowe w jednym lub kilku drzewach mogą ostatecznie służyć jako źródło rozwoju BC. Pozostałe grupy zgłosiły dostarczanie ID cząstek wirusa (np. składników systemów Cre/LoxP i/lub Cas9/CRISPR), hormonów i antagonistów hormonów (np. prolaktyny, fulwestrantu), środków chemioterapeutycznych (np. cisplatyny), siRNA i/lub przeciwciał lub innych czynników celujących u myszy 4,19,21,35,36,37,38,39,40 ,41,42,43,44,45, szczury 21,33,46,47,48 i/lub króliki 18,49,50,51,52,53. Pomyślne kaniulowanie do ośmiu drzew przewodowych na ludzką pierś w celu miejscowego dostarczania chemioterapii zostało zgłoszone w niezależnych badaniach klinicznych 47,54,55. Wskazówki obrazowe dotyczące infuzji tych innych rozwiązań mających na celu zapobieganie nowotworom lub ukierunkowanych na leczenie miejscowe w podobny sposób zmaksymalizowałyby ich skuteczność.
Wykazano tutaj skalowalność i udoskonalenie tej procedury od drzewa przewodowego myszy do szczura. Nanocząstka TaOx w mysim drzewie przewodowym 4,19 i szczura (dane niepublikowane) zapewnia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości, które przewyższa zatwierdzone przez FDA rentgenowskie środki kontrastowe zawierające jod. Podobnie, nie jesteśmy świadomi innych podejść do obrazowania drzew przewodowych u myszy40,41 lub innych modeli zwierzęcych18, które mogą zapewnić rozdzielczość porównywalną do TaOx. Istotny dla tłumaczenia klinicznego jest fakt, że efekt żelowania EC w tych średnich modelach szczurów umożliwia udoskonalenie preparatu w celu zminimalizowania ubocznych uszkodzeń tkanek. Kontynuując ocenę tej ablacyjnej procedury ID pod kątem jej zdolności do zapobiegania BC, będziemy w stanie dokładniej określić, z których gruczołów rozwija się BC dzięki dodatkowym informacjom dostarczonym przez obrazowanie po dostarczeniu ID w chemicznie indukowanych i innych szczurzych modelach BC. Dane te określą bezpieczeństwo tej procedury i wskażą wszelkie obawy lub niedociągnięcia dotyczące tego, czy częściowe lub nieudane leczenie drzew kanałowych może być bardziej podatne na rozwój BC u kobiety wysokiego ryzyka.

Dla kobiet w USA1, rak piersi (BC) nadal jest najczęściej diagnozowanym typem raka i powoduje więcej zgonów niż jakikolwiek inny typ nowotworu, z wyjątkiem raka płuc. Prognozy na 2022 r. szacują, że u 51 400 kobiet zostanie zdiagnozowany rak in situ, a u 287 850 kobiet zostanie zdiagnozowany rak inwazyjny, a 43 600 kobiet umrze z powodu BC1. Pomimo rozpowszechnienia i śmiertelności związanej z BC, dostępnych jest niewiele opcji prewencji pierwotnej i badań translacyjnych nad nowatorskimi interwencjami, ponieważ prewencja pierwotna nie jest traktowana priorytetowo przez agencje federalne2. Profilaktyczna mastektomia jest najskuteczniejszą interwencją w profilaktyce pierwotnej. Jednak ta procedura jest zalecana tylko dla osób wysokiego ryzyka, ponieważ jest to poważna operacja o konsekwencjach zmieniających życie3. Operacja ta polega na całkowitym usunięciu komórek nabłonka sutka, z których rozwija się kancerogeneza, a także normalnej otaczającej tkanki. Osoby są często zniechęcane do stosowania tej procedury jako pierwszej opcji podstawowej interwencji ze względu na negatywny wpływ stresu fizycznego, psychicznego i społecznego. Z tych powodów nawet niektóre osoby z grupy wysokiego ryzyka decydują się nie poddawać tej procedurze i zamiast tego wybierają czujne oczekiwanie lub podobne strategie nadzoru3. W poprzedniej publikacji dostarczanie 70% etanolu (EtOH) bezpośrednio do drzewa przewodowego modeli mysich było skuteczne w chemicznej ablacji komórek nabłonka sutka z ograniczonym uszkodzeniem sąsiednich normalnych tkanek i w zapobieganiu powstawaniu guza piersi4. EtOH jest stosowany w wielu zastosowaniach klinicznych jako środek ablacyjny do miejscowego leczenia niektórych nowotworów lub środek stwardniający do miejscowego leczenia obrzęku tętniczo-żylnego i wad rozwojowych5,6,7,8,9,10,11,12,13,14. Niska toksyczność i profil bezpieczeństwa EtOH jest dobrze znany, ponieważ w niektórych procedurach można podać do 50 ml 95% EtOH na sesję5,10.
Całkowite usunięcie komórek nabłonka sutka, z których rozwija się BC, jest najważniejszym elementem zarówno profilaktycznej mastektomii, jak i miejscowego podania roztworu ablatywnego. Dlatego potwierdzenie całkowitego wypełnienia drzewa przewodowego jest konieczne, aby zagwarantować, że roztwór ablacyjny miał bezpośredni kontakt ze wszystkimi komórkami nabłonka sutka. Dostarczenie roztworu w obrębie drzewa przewodowego (drzew przewodowych) i jego wizualizacja za pomocą fluoroskopii lub duktografii sterowanej obrazem są możliwe dzięki już istniejącym procedurom klinicznym15,16,17. W związku z tym możliwe będzie łatwe wdrożenie i ocena tej procedury w badaniach klinicznych. Kluczowym krokiem w ustaleniu skuteczności i wykonalności translacyjnej ablacji wewnątrzprzewodowej (ID) jako nowej interwencji w prewencji pierwotnej będzie wykazanie wykonalności tego podejścia do wizualizacji rentgenowskiej w modelach zwierzęcych o rosnącym rozmiarze i złożoności architektury drzewa przewodowego4,18,19. Protokół, który skaluje tę procedurę ablacyjną z mouse20 do modeli szczurzych, jest opisany tutaj. Podczas gdy drzewa kanałowe myszy i szczurów mają podobną strukturę liniową i wzór rozgałęzień, drzewo kanałowe szczura jest proporcjonalnie większe i otoczone znacznie gęstszym zrębem. Wdrożyliśmy w laboratorium metodę skutecznego wstrzykiwania każdego gruczołu sutkowego szczurowi w serii cotygodniowych sesji za pomocą roztworu ablacyjnego zawierającego środek kontrastowy. Odstępy między sesjami są konieczne, aby zapewnić, że zwierzęta mają minimalne skutki uboczne EtOH (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). Zabieg polega na wstrzyknięciu roztworu ablacyjnego bezpośrednio do otworu sutkowego szczura znieczulonego izofluranem za pomocą igły 33 G. Niektóre kluczowe ulepszenia procedury obejmują stosowanie rozszerzonego leczenia przeciwzapalnego, wstrzykiwanie większych objętości na drzewo kanałowe niż sugerowano21 oraz gazoszczelne strzykawki do cieczy i gazów. Czas leczenia karprofenem w dawce 5 mg/kg mc. (NLPZ) od 48 godzin przed wstrzyknięciem do 1 tygodnia po wstrzyknięciu ID jest porównywalny z protokołem przeciwzapalnym stosowanym w leczeniu stwardniającym malformacji żylnych w klinice. Zabieg jest wykonywany u pacjentów w znieczuleniu ogólnoustrojowym, po którym przez 2 dni stosuje się leki przeciwzapalne, takie jak NLPZ. Kuracja przeciwzapalna może zostać przedłużona o kilka kolejnych dni, aby zmniejszyć miejscowy stan zapalny i potencjalny ból13. Podobnie jak u myszy20, dootrzewnowe wstrzyknięcie 5% roztworu sacharozy łagodzi krótkotrwałe skutki zatrucia alkoholem u szczurów. Szczurom można wstrzyknąć do 1 ml 70% EtOH (do 4 przewodów; 0,2 g/dl zawartości EtOH we krwi) podczas jednej sesji, gdy podaje się im ten roztwór sacharozy; zwierzęta w pełni wracają do zdrowia w ciągu 4 godzin po wstrzyknięciu dowodu tożsamości. Wykonujemy sesje sekwencyjne, aby zapewnić wystarczający czas na regenerację przy wstrzykiwaniu więcej niż 4 gruczołów i/lub wyższych stężeń EtOH. Zatrucie alkoholem u kobiet będzie znacznie mniej prawdopodobne, ponieważ wstrzyknięcie ID wszystkich drzew przewodowych w obu piersiach, przy założeniu, że 16 głównych przewodów16,17i 2 ml na kanał22,23, z 70% EtOH skutkowałoby mniej niż 0,1 g/dl zawartości EtOH we krwi i może powodować łagodne upośledzenie.
Obrazowanie rentgenowskie umożliwia określenie, jak skuteczne jest dostarczanie wewnątrzprzewodowe w każdym pojedynczym gruczole i czy całe drzewo kanałowe jest wypełnione (Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Obrazowanie fluoroskopowe w czasie rzeczywistym w ramach przygotowań do badania mikrotomografią komputerową i/lub rekonstrukcji 3D danych z pliku DICOM może być wykorzystane do oceny zakresu dostarczania roztworu do drzewa kanałowego i ewentualnego wycieku do zrębu. Zastosowanie fluoroskopii może pomóc w ograniczeniu całkowitej dawki promieniowania nałożonej na zwierzę. Technika fluoroskopii jest bardziej zbliżona do zamierzonego zastosowania klinicznego w zakresie obrazowania tego zabiegu ablatywnego. Porównanie zatwierdzonych przez FDA nanocząstek Isovue zawierających jod z nanocząstkami tlenku tantalu (TaOx) zostało przeprowadzone w celu dalszego udoskonalenia użyteczności roztworu ablatywnego4,19. Stwierdzono, że TaOx jest lepszym środkiem kontrastowym mikro-CT niż Isovue do wizualizacji początkowego wypełnienia drzewa przewodowego u myszy4,19. Tutaj pokazujemy, że TaOx jest odpowiednim środkiem kontrastowym do wizualizacji początkowego wypełnienia drzewa przewodowego szczura (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). Zarówno w badaniach translacyjnych, jak i w praktyce klinicznej, środek żelujący etyloceluloza (EC) został dodany do roztworu EtOH w celu zminimalizowania dyfuzji z zamierzonych regionów docelowych13,14,24,25,26,27,28,29. Badania wykazały, że dodanie do 1,5% EC do roztworów ablacyjnych zawierających EtOH jest zgodne z obrazowaniem opartym naTaO x(<klasa silna="xfig">Rysunek 3). Te, jak również dalsze udoskonalenia roztworu ablacyjnego, mogą pomóc w gotowym przeprowadzeniu tej procedury pod kontrolą obrazu do kliniki.

<table><tbody><tr><td>AnalyzeDirect&nbsp; v12.0</td><td>Suwmiarka</td><td>n/a</td><td>Do przetwarzania obrazu mikro-CT</td></tr><tr><td>Carprieve, Carprofen 50 mg/mL</td><td>Allivet</td><td>50647</td><td>Do leczenia przeciwzapalnego</td></tr><tr><td>Etyloceluloza</td><td>Acros Organics</td><td>9004-57-3</td><td>Do iniekcji doprzewodowych</td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-50G</td><td>Do wizualizacji iniekcji</td></tr><tr><td>Gorąca woda wanna</td><td>Toolots</td><td>Yidu_HH-S2</td><td>Do przygotowania kubków z karprofenem</td></tr><tr><td>MediGel Sucralose</td><td>Cups ClearH2O</td><td>74-02-5022</td><td>Do dostarczania karprofenu</td></tr><tr><td>Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Strzykawka, 500&mu; L</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>Do iniekcji wewnątrzprzewodowej</td></tr><tr><td>Photoshop 2021</td><td>Adobe</td><td>n/a</td><td>Do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>System obrazowania Quantum GX2 microCT</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>CLS149276</td><td>Do akwizycji obrazu mikro-CT</td></tr><tr><td>Metalowa igła piasty, rozmiar 33, niestandardowa (kąt ukosu 30&stopni, 0,4 cala, styl punktowy 4)</td> <td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>Do iniekcji wewnątrzprzewodowych</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy serii SZM</td><td>AmScope</td><td>SM-4TPZ-144</td><td>Do iniekcji wewnątrzprzewodowych</td></tr><tr><td>Sterylny niebieski barwnik spożywczy</td><td>McCormick</td><td>930641</td><td>Do wizualizacji</td></tr> <tr><td>iniekcjiSterylny sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td>Do przygotowania roztworu</td></tr><tr><td>Naklejki</td><td>DOT Scientific</td><td>DOTSCI-C50</td><td>Do przygotowania kubków karprofenu</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Calbiochem</td><td>8550-5KG</td><td>Do wstrzykiwań wewnątrzprzewodowych</td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Fisher</td><td>14-826-79</td><td>Do przygotowania kubków karprofenowych</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td>Do przygotowania kubków karprofenu</td></tr><tr><td>Pompa/podkładki rozgrzewająceBraintree</td> <td>Scientific</td><td>HTP-1500 120V; AP-R 26E</td><td>Do iniekcji doprzewodowych/przygotowania przedoperacyjnego</td></tr></tbody></table>

wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych

X-Ray Visualization of Intraductal Ethanol-Based Ablative Treatment for Prevention of Breast Cancer in Rat Models

Nadal istnieje ograniczona liczba podstawowych interwencji mających na celu zapobieganie rakowi piersi. W przypadku kobiet z wysokim ryzykiem zachorowania na raka piersi najskuteczniejszą interwencją jest profilaktyczna mastektomia. Jest to drastyczny zabieg chirurgiczny, w którym komórki nabłonka sutka, które mogą powodować raka piersi, są całkowicie usuwane wraz z otaczającą tkanką. Celem tego protokołu jest wykazanie wykonalności minimalnie inwazyjnej procedury wewnątrzprzewodowej, która mogłaby stać się nową podstawową interwencją w profilaktyce raka piersi. Ta miejscowa procedura preferencyjnie polegałaby na ablacji komórek nabłonka sutka, zanim staną się złośliwe. Na Uniwersytecie Stanowym Michigan i w innych miejscach opracowano wewnątrzprzewodowe metody dostarczania roztworów bezpośrednio do tych komórek nabłonka w modelach raka piersi u gryzoni. Gruczoł sutkowy szczura składa się z pojedynczego drzewa przewodowego, które ma prostszą i bardziej liniową architekturę w porównaniu z ludzką piersią. Jednak chemicznie indukowane szczurze modele raka piersi oferują cenne narzędzia do badań potwierdzających słuszność koncepcji nowych interwencji zapobiegawczych i skalowalności od modeli mysich do ludzkich. W tym miejscu opisano procedurę wewnątrzprzewodowego dostarczania roztworu ablacyjnego na bazie etanolu zawierającego nanocząstki tlenku tantalu jako rentgenowski środek kontrastowy i etylocelulozę jako środek żelujący do drzewa przewodowego ssaka szczura. Dostarczanie odczynników wodnych (np. związków cytotoksycznych, siRNA, AdCre) przez wstrzyknięcie doprzewodowe zostało opisane wcześniej w modelach mysich i szczurzych. Niniejszy opis protokołu kładzie nacisk na zmiany metodologiczne i kroki, które odnoszą się wyłącznie do dostarczania roztworu ablatywnego, rozważenia formuły w celu zminimalizowania miejscowych i ogólnoustrojowych skutków ubocznych roztworu ablatywnego oraz obrazowania rentgenowskiego do oceny in vivo wypełnienia drzew przewodowych. Techniki fluoroskopii i mikrotomografii komputerowej pozwalają określić powodzenie podania roztworu ablacyjnego oraz stopień wypełnienia drzewa przewodowego dzięki kompatybilności ze środkiem kontrastowym zawierającym tantal.

Każdy z 12 gruczołów mlekowych samicy szczura zawiera pojedyncze drzewo przewodowe, które otwiera się w otworze sutka. Pomimo różnic w wielkości między myszą a szczurem, czas rozwoju gruczołów mlekowych oraz moment osiągnięcia przez te zwierzęta dojrzałości są bardzo podobne30,31. Poniżej przedstawiono krótki opis kluczowych etapów rozwoju gruczołu mlekowego u szczurów jako reprezentatywnych dla obu gatunków gryzoni. Pąki końcowe (TEBs) to silnie proliferujące struktury znajdujące się na końcach wydłużającego się drzewa przewodowego, które kierują rozgałęzianie przewodów30,31. Szczyt proliferacji i gęstości TEBs występuje w 3-4 tygodniu życia, podczas fazy wydłużania się drzewa przewodowego w rozwoju pokwitaniowym30. W 9-10 tygodniu życia pozostaje niewiele TEBs, ponieważ drzewo przewodowe urosło tak, że zajmuje całą długość poduszki tłuszczowej30. Następnie wzrost i rozszerzanie się drzewa przewodowego jest proporcjonalne do wzrostu poduszki tłuszczowej oraz samego zwierzęcia32. Jednostki lobularne przewodów końcowych (TDLUs) w ludzkiej piersi pełnią rolę podobną do TEBs u gryzoni. TDLUs są głównym źródłem inicjacji kancerogenezy i progresji do raka piersi (BC)33,34. Możemy wstrzyknąć do 300 µL 70% roztworu EtOH, aby wypełnić całe drzewo przewodowe gruczołów mlekowych piersiowych i brzusznych u 9-tygodniowego szczura rasy Sprague-Dawley (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3). W przeciwieństwie do myszy20, sutki gruczołów szyjnych i pachwinowych szczurów Sprague-Dawley są zazwyczaj odpowiednie do wstrzykiwania w ponad 80% zwierząt, a do wypełnienia całego drzewa przewodowego wymagane jest do 100 μL 70% roztworu EtOH (Rysunek 2). Rutynowo wstrzykujemy do 10 gruczołów mlekowych badany roztwór ablacyjny. Typowy schemat doświadczalny składa się z dwóch niezależnych cotygodniowych sesji wstrzykiwań wewnątrzprowadowych (ID), w których pięć naprzemiennych gruczołów jest infuzowanych roztworem ablacyjnym zawierającym środek kontrastowy do promieniowania rentgenowskiego i/lub EC jako czynnik żelujący (Rysunek 2). W przypadku roztworu ablacyjnego zawierającego TaOx (50-200 mM), po zakończeniu każdej sesji wykonuje się fluoroskopię i/lub skanowanie micro-CT, aby określić i zarejestrować indywidualny sukces infuzji każdego drzewa przewodowego z częściową lub pełną ilością wstrzykniętego roztworu (Rysunek 2). Natychmiastowe i podłużne obrazowanie po wstrzyknięciu umożliwia ocenę, jak zmiany w formulacji, zwłaszcza stężenie żelującego czynnika EC, wpływają na dyfuzję zewnętrzną roztworu ablacyjnego i ją ograniczają w zależności od wstrzykniętej objętości (Rysunek 3). Taka analiza obrazowa dostarcza informacji niezbędnych do zrozumienia optymalnych parametrów pozwalających na osiągnięcie maksymalnej ablacji przy minimalnym uszkodzeniu tkanek pobocznych.
<img alt="Schemat przepływu eksperymentu: leczenie przeciwzapalne, okres przedoperacyjny, wstrzykiwanie, mikroTK, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematy procedury wstrzykiwania dokanalnego i analizy obrazu u szczurów. Przedstawiono krok po kroku procedurę wstrzykiwania dokanalnego oraz analizy obrazu. Więcej szczegółów znajduje się w materiale wideo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Techniki wstrzykiwania i wyniki: sukces wstrzykiwania śródskórnego, kaniulacja, fluoroskopia, analiza 3D microCT." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykłady kaniulacji sutka oraz efektu dostarczenia roztworu ablacyjnego do wielu gruczołów mlekowych. (A) Typowy wygląd sutków u szczurów szczepu Sprague-Dawley. Długość sutka koreluje z prawdopodobieństwem udanej kaniulacji. Dłuższe sutki są łatwiejsze do kaniulacji niż sutki krótkie, natomiast sutki nadmiernie krótkie lub szczątkowe nie mogą zostać poddane kaniulacji. Po przeprowadzeniu kaniulacji, zarówno długie, jak i krótkie sutki mogą zostać poddane infuzji roztworu, osiągając podobne wskaźniki sukcesu dostarczenia. Niebieski barwnik spożywczy w wstrzykiwanym roztworze może służyć jako dowód in vivo wypełnienia drzewa przewodowego i sukcesu dostarczenia (najbardziej widoczny w formie kopuły w przypadku nieudanego wstrzyknięcia do tkanki tłuszczowej). Fluoroskopia w czasie rzeczywistym (B) oraz rekonstrukcje 3D micro-CT wygenerowane po akwizycji obrazu (C) stanowią dowód in vivo sukcesu dostarczenia i pozwalają na bardziej ilościową ocenę dotarcia roztworu do TEB. (B) Każdy brzuszny gruczoł mlekowy pierwszej pary (#4, #10) otrzymał roztwór ablacyjny z 1% EC (pomarańczowy obrys) lub bez niego (zielony obrys) (C) Udane dostarczenie (niebieski obrys) roztworu ablacyjnego w prawym szyjnym (#7), drugiej parze piersiowych (#3, #9) i pierwszej parze brzusznych (#4, #10) gruczołów mlekowych oraz nieudane wstrzyknięcie (biały przerywany obrys) w lewym gruczole piersiowym (#1). Paski skali odpowiadają 1 mm na obrazach o różnym powiększeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza wzorca rozpylania, zmiany stężenia etanolu w kolorze pomarańczowym i zielonym; schemat widoku z góry." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Rekonstrukcja 3D i ocena wypełnienia oraz dyfuzji roztworu ablacyjnego. Nanocząsteczki 70% EtOH/100 mM TaOx z 1% EC (góra) lub bez EC (dół) zostały wstrzyknięte doprzewodowo do drugiej pary gruczołów mlekowych brzusznych (#4 i #10) i natychmiast obrazowane za pomocą mikro-CT. Każdy szczur Sprague-Dawley otrzymał zwiększającą się objętość jednego z roztworów. Poszczególne drzewa przewodowe zrekonstruowano przy użyciu pakietu oprogramowania do analizy obrazu (spline trace + propagate object + threshold rendition). Przy 1% EC widoczne jest dotarcie roztworu do końców terminalnych. Wraz ze zwiększaniem podawanej objętości, liczba wypełnionych TEB staje się bardziej wyraźna. Pasek skali odpowiada 10 mm na wszystkich renderach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wydanie</td>
			<td>Wygląd</td>
			<td colspan="4">Roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krótka końcówka (Rys. 2)</td>
			<td>Kapturek ma niski profil – trudny do uchwycenia</td>
			<td colspan="4">Czasami łatwiej jest przytrzymać skórę w okolicy brodawki i skierować igłę w jej centrum. Istnieje prawdopodobieństwo, że igła wejdzie pod skórę. Powolne wyciąganie może ujawnić, że brodawka znajduje się nieco powyżej czubka igły, co stworzy przestrzeń do jej chwycenia i nasunięcia w całości na igłę. Należy zachować szczególną ostrożność w kwestii kąta wprowadzenia igły pod skórę. Przy niewłaściwym kącie wkłucia łatwo o przypadkowe wstrzyknięcie preparatu w tkankę tłuszczową.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzyknięcie do poduszki tłuszczowej (Rys. 2)</td>
			<td>Obrzęk wokół sutka i prawdopodobnie w samym sutku – najłatwiej zaobserwować, jeśli do roztworu wstrzykiwanego dodano barwnik</td>
			<td colspan="4">Jeśli sutek zacznie puchnąć po wstrzyknięciu pierwszych kilku jednostek, należy wyjąć igłę i spróbować wprowadzić ją ponownie, zwracając większą uwagę na kąt wkłucia. Ponownie rozpocząć wstrzykiwanie i obserwować, czy nie pojawia się dalszy obrzęk. Jeśli obrzęk nadal występuje, należy przerwać próbę. Bardzo rzadko udaje się skutecznie wykonać zastrzyk w sutek, który pierwotnie został zainfekowany jako zastrzyk w poduszkę tłuszczową.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rany/strupy</td>
			<td>Otwarta rana lub strup w pobliżu miejsca iniekcji roztworu EtOH</td>
			<td colspan="4">Szczury są bardziej podatne niż myszy na powstawanie ran lub strupów w okolicy miejsca wstrzyknięcia. W przypadku stwierdzenia ran należy nałożyć potrójną maść antybiotykową na rany otwarte, natomiast rany strupowe pozostawić bez ingerencji. Nakładanie maści na strupy może zwiększyć prawdopodobieństwo, że zwierzę będzie nimi manipulować i je usunie. Rany należy kontrolować co 1–2 dni aż do ich zagojenia, w zależności od stopnia nasilenia urazu. Karprofen powinien być podawany aż do całkowitego zagojenia, nawet jeśli przekracza to standardowy okres podawania leku.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wstrzykiwać naprzemiennie do gruczołów</td>
			<td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą należy przełożyć na język polski.</td>
			<td colspan="4">Większe objętości iniekcji u szczurów zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia otarć skóry w przypadku wstrzykiwania w kolejne gruczoły. Aby zminimalizować ryzyko urazu w miejscu iniekcji, należy w ramach jednej sesji stosować naprzemienne gruczoły (np. wstrzykiwać do gruczołów nr 1, 3, 4 i 6, a nie nr 1–4). Odstępy między parami trzecich (#3 i #9) i czwartych (#4 i #10) gruczołów pozwalają na wykonanie iniekcji w oba te gruczoły podczas jednej sesji.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przydatne wskazówki i rozwiązywanie problemów

Opisano procedurę dostarczania chemicznego roztworu ablacyjnego do drzewa przewodowego sutka szczura w celu profilaktycznego leczenia raka piersi pod kontrolą obrazu. Komórki nabłonka sutka mogą być celowane przy minimalnym uszkodzeniu tkanek pobocznych poprzez kaniulację bezpośrednio do otworu brodawki sutkowej i doprzewodową infuzję 70% roztworu ablacyjnego na bazie etanolu.

Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych

There are still a limited number of primary interventions for prevention of breast cancer. For women at a high risk of developing breast cancer, the most ...

Rak piersi jest powszechną i śmiertelną chorobą o ograniczonych strategiach zapobiegawczych, które wiążą się z poważnymi negatywnymi skutkami ubocznymi. Aby zapewnić metodę o zmniejszonych skutkach ubocznych, opracowaliśmy technikę doprzewodowego wstrzykiwania roztworu ablacyjnego na bazie etanolu do drzewa przewodowego sutka szczura, która pozwala na jednoczesne obrazowanie in vivo i profilaktykę raka piersi. Opiera się to na wcześniejszych pracach na myszach, u których wstrzyknięcie bezpośrednio do otworu sutka pozwala na celowanie w komórki nabłonka sutka przy minimalnym uszkodzeniu tkanki pobocznej.Zarówno myszy, jak i szczury mają gruczoły sutkowe zawierające pojedyncze drzewo przewodowe pochodzące z otworu sutkowego. Szczury są większe od myszy i pozwalają na wstrzyknięcie większej objętości etanolu w celu zbadania sukcesu ablacji, aby udowodnić skalowalność modelu. Kolejnym udoskonaleniem tej metody jest dodanie etylocelulozy do roztworu ablacyjnego.Etyloceluloza była wcześniej stosowana w innych podejściach klinicznych w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się etanolu z dala od docelowego obszaru. Osiąga się to poprzez charakter związku, który powoduje, że żeluje się, gdy styka się z płynem w tkance. Istnieje pięć kluczowych kroków związanych z tą metodą profilaktyki raka piersi z weryfikacją obrazu.Musimy najpierw zacząć podawać zwierzętom karprofen doustnie, używając kubków z żelem sukralozowym przygotowanych w laboratorium. To rozszerzone leczenie przeciwzapalne jest utrzymywane przed i po zabiegu. Następnie usuwamy sierść z obszaru otaczającego sutki, do których ma być wstrzyknięte krem do depilacji, aby przygotować zwierzę do wstrzyknięć.Iniekcje wewnątrzprzewodowe są następnie wykonywane za pomocą stereoskopu wspomagającego wizualizację otworu sutka do wprowadzenia igły. Zwierzęta są skanowane lub oceniane za pomocą mikrotomografii komputerowej lub fluoroskopii po wstrzyknięciu w celu określenia powodzenia wstrzyknięć. Skany mikrotomografii komputerowej mogą być następnie przetwarzane w celu stworzenia rekonstrukcji 3D wstrzykniętego drzewa przewodowego sutka w celu dalszej analizy udanego wypełnienia.Karprofen podstawowy jest najpierw rozcieńczany w PVS do wymaganego stężenia. Do mieszaniny można dodać sterylny barwnik spożywczy, aby lepiej potwierdzić pełne wymieszanie leku z sukralozą kubka. Filiżanki są następnie podgrzewane w łaźni wodnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 15 minut.Suszenie kubków po wyjęciu i czyszczenie pokrywki kubka 70% etanolem zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. Roztwór karprofenu można wstrzykiwać bezpośrednio do kubka za pomocą strzykawki w celu przekłucia pokrywki. W takim przypadku musimy wstrzyknąć 500 mikrolitrów, aby uzyskać pożądany rezultat.Uszczelnij otwór naklejką, a następnie potrząsaj kubkiem przez 15 sekund, a następnie wiruj przez dodatkowe 15 sekund. Jednorodne mieszanie można ocenić, szukając grudek koloru ciemnoniebieskiego. Kubki można następnie przechowywać w lodówce, dopóki nie będą potrzebne.Zwierzęta należy przygotować na dwa do trzech dni przed planowanym wstrzyknięciem. Znieczulić zwierzę za pomocą inhalacji izofluranu. Przenieś znieczulonego szczura do stożka nosowego na podkładce rozgrzewającej.Nałóż smar do oczu szczura na stożek nosa, a następnie ułóż zwierzę na grzbiecie. Krem do depilacji można nakładać na obszar sutków, który planujesz wstrzyknąć za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Szybsze rozluźnienie sierści można osiągnąć, pocierając aplikatorem w górę iw dół po skórze zwierzęcia w pożądanym obszarze.Ważne jest, aby pozostawić krem na szczurze tak krótko, jak to możliwe, aby uniknąć poparzenia skóry. Szczury są jeszcze bardziej wrażliwe na tę procedurę niż myszy. Po 10 do 30 sekundach od aplikacji użyj ciepłej wody na gazie, aby całkowicie usunąć krem.Użyj trzech do czterech płukanek, aby zapewnić całkowite usunięcie przed wysuszeniem skóry czystą gazą. Potwierdź dobrą widoczność i dostęp do sutków w miejscach usuwania sierści. W razie potrzeby powtórz procedurę depilacji.Umieść szczura w czystej klatce regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej, aby wyzdrowiał ze znieczulenia. Daj jeden kubek karprofenu przygotowanym szczurom w ich domowej klatce po wyzdrowieniu. Zaczniesz od znieczulenia zwierzęcia za pomocą wziewnego znieczulenia izofluranem i przeniesiesz szczura do stożka nosowego, gdy zostanie on w pełni wywołany.Smar do oczu należy nałożyć przed umieszczeniem zwierzęcia na grzbiecie do wstrzyknięć. Pomocne może być przyklejenie taśmą nóg w pobliżu sutków, które zostaną wstrzyknięte, ale nie jest to konieczne. Po przygotowaniu strzykawki z żądaną objętością roztworu do wstrzykiwań, należy przygotować brodawkę, usuwając widoczny martwy naskórek za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, jeśli to możliwe.Najczęstszym obszarem niepokoju jest sam otwór brodawki. Szczury często mają korek wystający z otworu. Usunięcie tej wtyczki może pomóc w lepszej kaniulacji.Mając widoczny skos igły, włóż igłę w końcówkę sutka z pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Uważaj, aby podążać za ścieżką otworu smoczka. Sutki szczurów mają zwykle więcej tłuszczu wokół otworu, co ułatwia wbicie się w ten tłuszcz i błędnie uważają, że osiągnąłeś kaniulację z powodu zaawansowania igły.Gdy skos igły zostanie całkowicie otoczony przez sutek, zacznij powoli wstrzykiwać roztwór. Pożądana szybkość to około 100 mikrolitrów na minutę u szczurów. Należy unikać wstrzykiwania szybciej, aby zapobiec możliwemu uszkodzeniu drzewa kanałowego.Po całkowitym wstrzyknięciu należy odczekać 30 sekund przed wyjęciem igły z brodawki sutkowej przy pomocy kleszczy. Zmniejszy to prawdopodobieństwo wycieku z brodawki. Jeśli dojdzie do wycieku, użyj zwilżonej gazy lub chusteczki do etanolu, aby usunąć roztwór.Kontrast i rozlany roztwór mogą zniekształcić uzyskane obrazy. Tutaj widzimy powiększony film z sekwencją wstrzykiwania, która właśnie została wyświetlona. Zauważ, że oddech zwierzęcia utrudnia utrzymanie sutka w jednej płaszczyźnie ogniskowej.Może to utrudnić wstrzyknięcie, ponieważ sutek nie pozostaje w stałym miejscu. Problem ten pogarsza bliskość klatki piersiowej i trzech górnych par gruczołów. Zatyczka w otworze smoczka została teraz usunięta w celu lepszej kaniulacji.Igła może być teraz zorientowana skośnie do góry, aby wsunąć ją w sutek za pomocą kleszczy. Po całkowitym włożeniu skosu można rozpocząć wstrzykiwanie. Jeśli przyjrzysz się uważnie lewej stronie brodawki sutkowej, możesz zauważyć wzrost niebieskiego odcienia w miejscu, w którym roztwór do wstrzykiwań jest lekko widoczny, rozprzestrzeniając się po drzewie przewodowym.Jest to znacznie mniej widoczne u szczura ze względu na grubszą skórę. Tutaj możemy zobaczyć usunięcie igły 30 sekund po zakończeniu wstrzyknięcia i powstały roztwór wylewający się z brodawki. Dodatkowy roztwór jest usuwany, co pozwala na ocenę obszaru, w którym nie widzimy urazu brodawki sutkowej lub wypukłości tego obszaru, co wskazywałoby na wstrzyknięcie poduszeczki tłuszczowej.W przypadku wstrzykiwania roztworu zawierającego etanol należy zachować ostrożność, aby uniknąć zatrucia alkoholem. Wymaga to wiedzy o tym, ile etanolu można wstrzyknąć podczas jednej sesji i podawania roztworu zawierającego sacharozę IP podczas zabiegu, aby przeciwdziałać skutkom. Po wstrzyknięciu zwierzęta mogą zostać odzyskane w czystej klatce na poduszce grzewczej lub przeniesione do mikrotomografii komputerowej w celu zobrazowania udanego wstrzyknięcia.Po przeniesieniu zwierzęcia, któremu wstrzyknięto pomoc, należy kontynuować podawanie izofluranu w celu utrzymania znieczulenia podczas obrazowania. Zwiększony rozmiar szczura wymaga dodatkowej manipulacji pozycją, aby uzyskać dobry obraz. Wyprostowanie kręgosłupa przed przyklejeniem taśmą nóg w pobliżu miejsca, które ma być zobrazowane, jest pomocne w generowaniu spójnych obrazów.Klepanie nóg w wyprostowanej pozycji może zapobiec sytuacji, w której kości staną się centralnym punktem obrazu. Odkryliśmy również, że przyklejanie taśmy w poprzek brzucha szczura może pomóc w zmniejszeniu artefaktu oddychania dla dolnych gruczołów. Dopuszczalnych jest kilka parametrów skanowania w celu wizualizacji obróbki kanałowej.Jednak przy doborze parametrów zawsze należy brać pod uwagę dawkę promieniowania. Dawka promieniowania wynikająca z tych skanów nie powinna przekraczać limitów promieniowania dla danego szczepu szczurów. Analiza fluoroskopowa, a nie akwizycja obrazu, może znacznie zmniejszyć ogólne obciążenie promieniowaniem.Po wykonaniu wszystkich skanów lub ocen zwierzę może zostać zwrócone do czystej klatki regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej. Zwierzę powinno być monitorowane do czasu całkowitego wyzdrowienia i powrotu do klatki domowej. Kubeczki z karprofenem należy dostarczać co najmniej do siedmiu dni po wstrzyknięciu.Oprogramowanie w aparacie microCT, którego używamy, pozwala na tworzenie szybkich odczytów w celu oceny powodzenia iniekcji bez formalnej analizy. Ta funkcja ma prosty suwak kontrastu, który pozwala na rozsądną redukcję sygnału do szumu. Podstawową wadą tych wersji jest to, że cały obraz musi być jednocześnie progowy.Dzięki temu jasne sygnały, które wyraźnie nie są częścią drzewa przewodowego, takie jak żelazo w diecie, mogą pozostać na obrazie. W niektórych przypadkach prawdziwy sygnał, jak widać tutaj, jest tak ciemny jak tło i można go łatwo usunąć z obrazu. Lepsze przedstawienia formalne można uzyskać za pomocą bardziej zaawansowanego oprogramowania analitycznego, które umożliwia segmentację obszaru zainteresowania.Najlepiej jest podzielić poduszeczkę tłuszczową sutka na segmenty w celu dalszego przetwarzania obrazu, aby uzyskać najlepsze odwzorowanie wstrzykniętego drzewa przewodowego. Ciemna granica poduszeczki tłuszczowej sutka może być narysowana przez splajn na całej grubości zwierzęcia w celu uzyskania tej segmentacji. Śledzenie co trzeciego przekroju i propagowanie obiektu wystarczy, aby uchwycić cały kanał w naszym doświadczeniu.W tym momencie możliwe jest progowanie odwzorowania za pomocą danej wściekłości, aby wyświetlić tylko kontrast zawarty w poduszce tłuszczowej sutka. Powinno to obejmować roztwór w drzewie kanałowym, a także wszelkie wycieki w bezpośrednim sąsiedztwie. Roztwory tlenku tantalu są na ogół dobrze widoczne w zakresie od 300 do 3000 HU. Dalszą analizę można przeprowadzić po utworzeniu rekonstrukcji drzewa kanałowego.Jeśli obrazowanie podłużne nie jest pożądane, można uzyskać obrazy o wyższej rozdzielczości, które lepiej oddają złożoną architekturę drzewa kanałowego. Różnice między zwierzętami mogą sprawić, że wstrzyknięcie będzie mniej lub bardziej trudne. Nie możemy mówić o zmienności między szczepami, ponieważ obecnie pracujemy wyłącznie ze szczurami Sprague Dawley.Niektóre zwierzęta będą miały sutki o niskich profilach, takie jak ten na zdjęciu, co utrudnia manipulację i osiągnięcie udanej kaniulacji. Inne będą miały sutki o wyższym profilu, takie jak ten pokazany tutaj, które będą bardziej podatne na kaniulację. Na zdjęciu przedstawiono pomyślnie kaniulowany sutek.Trudności w kaniulacji mogą spowodować uraz brodawki sutkowej, jak pokazano tutaj. Akwizycja obrazów mikrotomografii komputerowej bezpośrednio po wstrzyknięciu może lepiej informować badaczy o powodzeniu iniekcji, a także pomóc w określeniu właściwości wypełnienia niektórych roztworów. Tutaj widzimy różne aspekty gruczołów brzusznych tego samego szczura, któremu wstrzyknięto tę samą objętość roztworu ablacyjnego zawierającego 70% etanolu z kontrastem zapewnionym przez 100-milimolowy tlenek tantalu.Roztwór zastosowany w pokazanym górnym gruczole również zawierał 1% etylocelulozy. Widzimy struktury przypominające ściany na końcach odgałęzień kanałowych. Są to końcowe pąki końcowe wypełnione roztworem i nie rozlewające się.W dolnym rzędzie widzimy mniej zdefiniowane końce przewodów wskazujące na ucieczkę roztworu z drzewa kanałowego. To, wraz z bardziej ograniczonymi uszkodzeniami ubocznymi w badaniu histologicznym. wydaje się wskazywać na lepszą retencję roztworów zawierających etylocelulozę do drzewa przewodowego.Metoda ta stanowi krok w kierunku skalowalności mniej inwazyjnej metody zapobiegania rakowi piersi, aby zaoferować alternatywę dla profilaktycznej mastektomii. Wykazano udaną ablację nabłonka w większym modelu gryzoni przy minimalnych skutkach ubocznych dla zwierzęcia. Dodatek etylocelulozy do roztworu ablawacyjnego pozwala na lepsze zatrzymanie roztworu w miejscu wstrzyknięcia, co skutkuje zmniejszeniem szkód ubocznych.Nowatorskie zastosowanie rozwiązań, które zostały sprawdzone klinicznie, oraz dodatkowa możliwość wizualizacji sukcesu porodu za pomocą popularnych metod obrazowania pozwala na gotowe wdrożenie do praktyki klinicznej.

x-ray-visualization-intraductal-ethanol-based-ablative-treatment-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę iniekcji wewnątrzprzewodowych, w której dostarczamy mieszankę iniekcyjną do przewodów mysich gruczołów sutkowych.

Iniekcja doprzewodowa: dostarczanie mieszanki iniekcyjnej do przewodów gruczołu sutkowego myszy

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Tutaj opisujemy technikę miejscowego dostarczania odczynników do gruczołu sutkowego królika poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe. Dodatkowo opisujemy protokół wizualizacji i potwierdzenia porodu za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania ultrasonograficznego środków kontrastowych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe do gruczołu sutkowego królika

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Opisano metodę doprzewodowego wstrzykiwania odczynników do roztworu ablacyjnego na bazie etanolu do mysiego drzewa sutkowego do obrazowania in vivo i zapobiegania rakowi piersi. Wstrzyknięcie bezpośrednio do otworu brodawki sutkowej pozwala na celowanie w komórki nabłonka sutka przy minimalnym uszkodzeniu tkanek ubocznych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe i wizualizacja rentgenowska roztworu ablacyjnego na bazie etanolu w profilaktyce i leczeniu miejscowym raka piersi w modelach mysich

W protokole tym przedstawiono procedurę infuzji pod kontrolą obrazu do systemu drzew przewodowych gruczołu sutkowego królika. Demonstrujemy kontrolowaną infuzję rentgenowskiego środka kontrastowego zawierającego roztwór ablacyjny na bazie etanolu do wszystkich otworów strzyków za pomocą obrazowania fluoroskopowego w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego wlewu ablacyjnego na bazie etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach króliczych

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Obecny protokół opisuje metody tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych linii komórek rakowych z próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań w zakresie biologii nowotworów.

Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Poznaj metodę wewnątrzprzewodowego wstrzyknięcia etanolowego roztworu ablacyjnego do gruczołów mlecznych szczura w celu profilaktyki raka piersi z minimalnym uszkodzeniem tkanek.

Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego leczenia ablacyjnego opartego na etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach szczurzych

Przeglądaj więcej filmów