Name: Izolacja komórek linii monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: Naucz się izolacji komórek monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji. Ta technika umożliwia skuteczną ekstrakcję i różnicowanie osteoklastów, dostarczając niezawodnego modelu do badań biologii osteoklastów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (grant nr. LY19H060001) oraz Projekt Planu Nauki i Technologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Zhejiang (nr 2022ZB093).

Wszystkie eksperymenty w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi eksperymentów na zwierzętach Centrum Badań na Zwierzętach Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang (nr zgody: IACUC-20181029-11).
1. Ekstrakcja komórek
<ol>
	<li>Szczury Sprague-Dawley (szczury SD, w wieku 1-10 dni, samce lub samice) należy umieścić w klatkach do eutanazji wypełnionych CO2 w zrównoważonej ilości 30%-70% objętości pojemnika na minutę. Po utracie przytomności przez szczury (20-60 min) należy je poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić bezbolesną śmierć.</li>
	<li>Zanurz szczury w 75% alkoholu na 10 minut w celu dezynfekcji.</li>
	<li>Ostrożnie usuń wszystkie kończyny szczura nożyczkami i kleszczami, odessaj PBS za pomocą pipety i spłucz krew przylegającą do kończyn</li>.
	<li>Dodać 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny do 500 ml DMEM i dobrze wymieszać. Weź 50 ml sterylnej probówki wirówkowej, dodaj 5 ml FBS i 45 ml pożywki DMEM i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać 10% FBS DMEM zawierający 1% roztwór penicyliny/streptomycyny. Dodać 2 ml powyższej pożywki hodowlanej do probówki o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przenieść kości kończyn do probówki o pojemności 5 ml. Za pomocą nożyczek pociąć kości kończyn w probówce na małe kawałki (1-3 mm) i wymieszać homogenat w celu ponownego zawieszenia komórek szpiku kostnego w pożywce hodowlanej. Odstaw na 5 minut, aż fragmenty tkanki osiądą na dnie probówki.</li>
	<li>Dodać 10 ml 10% FBS DMEM do naczyń hodowlanej o średnicy 100 mm, a następnie przenieść supernatant do szalki hodowlanej. Podczas zasysania supernatantu należy unikać przenoszenia resztek tkanek do naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez około 24 godziny. Po tym czasie inkubacji większość mezenchymalnych komórek macierzystych będzie przylegać do ścianki szalki hodowlanej i będzie rosła powoli, podczas gdy większość BMM będzie nadal zawieszona w pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek z naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm do nowej kolby o średnicy 25cm2 i kontynuować hodowlę komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dodatkowe 24 godziny. BMM przylegają do ścianki kolby po 24–48 godzinach hodowli. Ostrożnie usunąć starą pożywkę i zastąpić ją nową pożywką po przyklejeniu się BMM do ścianki kolby.</li>
	<li>Subhodowla, gdy komórki w kolbie osiągnęły konfluencję 80%-90%. 
	UWAGA: Wszystkie komórki hodowano w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Podczas hodowli morfologia komórek była stopniowo ujednolicana. Komórki były duże, o nieregularnym kształcie, rosły promieniście i były połączone z kolbą w formie dysku, w którym można było zaobserwować wiele jąder.</li>
</ol>
2. Barwienie komórki metodą FACS
<ol>
	<li>Trawienie trypsyny przy użyciu 1-2 ml komercyjnej trypsyny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut i liczenie wtórnych komórek przylegających, aby zapewnić końcową liczbę komórek 100 000 / próbkę (policz komórki za pomocą hemocytometru Neubauera).</li>
	<li>Podziel komórki na trzy grupy (500 μl PBS zawiera 100 000 komórek): (1) ślepa grupa kontrolna zawierająca niebarwione komórki; 2) grupa kontrolna ISOTYPU; oraz (3) grupa eksperymentalna (barwienie CD11b/c).</li>
	<li>Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe (brak przeciwciał dla ślepej próby kontrolnej; kontrola izotypu anty-CD11 dla grupy kontrolnej izotypu, 0,6 μl przeciwciała/próbkę, 1 μg/próbkę; anty-CD11b/c dla grupy eksperymentalnej, 1 μl przeciwciała/próbkę, 1 μg/próbkę) na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Wirować przy 300-350 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 μl PBS. Powtórz powyższą procedurę jeden raz, aby upewnić się, że niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe zostały wypłukane.</li>
	<li>Inkubować odpowiednie przeciwciało drugorzędowe (brak przeciwciała dla ślepej próby kontrolnej; kozie przeciwciało anty-królicze IgG dla kontroli izotypu i grup eksperymentalnych, 0,25 μl przeciwciała/próbkę, 1:2,000) na lodzie w ciemności przez 30 minut.</li>
	<li>Wirować przy 300-350 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 μl PBS. Powtórz powyższą procedurę jeden raz, aby upewnić się, że niezwiązane drugie przeciwciała zostały wypłukane.</li>
	<li>Wykryj komórki CD11b/c dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej (10 000 komórek/próbkę) i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania (np. FlowJo 7.5). 
	UWAGA: Aby uzyskać ostateczny procent komórek CD11b/c+, zastosowano następujący wzór: Procent komórek CD11b / c + w grupie eksperymentalnej - procent komórek CD11 + w grupie kontrolnej izotypu.</li>
</ol>
3. Barwienie Wrighta-Giemsy
<ol>
	<li>Wysiewać przylegające komórki wtórne, które zostały trzykrotnie pasażowane, na arkusze wspinaczkowe komórek o średnicy 35mm2 (1 × 106 komórek/studzienkę) i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Wyrzucić pożywkę hodowlaną i przemyć trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Dodaj roztwór barwnika Wrighta-Giemsy (0,5 ml-0,8 ml) do arkusza wspinaczkowego komórek na 1 minutę.</li>
	<li>Wymieszaj barwnik z wodą destylowaną (0,5 ml-0,8 ml) z bawełnianym wacikiem i odstaw na 10 minut.</li>
	<li>Roztwór barwnika przemyć wodą destylowaną, a następnie suszyć przez 1-3 min. Obserwować pod mikroskopem.</li>
</ol>
4. Barwienie PUŁAPKI
<ol>
	<li>Wysiewać przylegające komórki wtórne, które zostały trzykrotnie pasażowane, na arkusze wspinaczkowe komórek o średnicy 35mm2 (1 × 106 komórek/studzienkę) i hodować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Zastąp starą pożywkę 10% FBS DMEM lub pożywką do indukcji osteoklastów uzupełnioną aktywatorem receptora 50 ng / ml liganda czynnika jądrowego κB (RANKL) i 30 ng / ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i poprowadź hodowlę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez dodatkowe 7 dni.</li>
	<li>Wybarwić komórki za pomocą zestawu do barwienia TRAP zgodnie z protokołem producenta i obserwować pod mikroskopem. 
	UWAGA: Komórki TRAP-dodatnie zdefiniowano jako osteoklasty, które pod mikroskopem świetlnym były fioletowe. Liczbę komórek TRAP-dodatnich zmierzono za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
</ol>
5. Western blot
<ol>
	<li>Wysiewaj przylegające komórki wtórne, które zostały trzykrotnie pasażowane, na 35 mm2 arkuszach wspinaczkowych komórek (1 × 106 komórek/studzienkę) i hoduj przez 24 godziny.</li>
	<li>Zastąp starą pożywkę świeżą 10% pożywką FBS DMEM lub pożywką indukcyjną osteoklastów (50 ng/ml RANKL i 30 ng/ml M-CSF) i hoduj przez dodatkowe 7 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wyekstrahuj całkowite białka komórkowe za pomocą buforu RIPA, rozdziel 10% SDS-PAGE i przenieś do membran z polifluorku winylidenu18,19.</li>
	<li>Blokuj 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku (25 ml) przez 2 godziny i myj trzy razy, za każdym razem przez 10 minut, za pomocą TBS-Tween 20 (TBST).</li>
	<li>Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze 4 °C przez noc (anty-β-aktyna, anty-TRAP i antykatepsyna K; wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczono w stosunku 1:1000, 10 ml rozcieńczonego przeciwciała/pasma) i trzykrotnie przemyć TBST.</li>
	<li>Inkubować przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-królicze IgG, rozcieńczenie 1:2 000, 10 ml rozcieńczonego przeciwciała/pasma) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i przemyć trzykrotnie TBST. Wizualizacja prążków białkowych za pomocą roztworu do wywoływania. 
	UWAGA: Poziomy ekspresji powyższych białek zostały znormalizowane do β-aktyny.</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Osteoklasty są jednym z najważniejszych typów komórek biorących udział w występowaniu i rozwoju chorób kości, a także jednym z głównych obiektów badań nad chorobami kości20. Monocyty/makrofagi mogą różnicować się w osteoklasty. Ponieważ makrofagi jednojądrzaste (komórki RAW264.7) są zbyt drogie do kupienia i łatwo aktywują się podczas hodowli, trudno jest przeprowadzić eksperymenty różnicowania in vitro z wykorzystaniem tej linii komórkowej. Chociaż opracowano kilka metod ekstrakcji monoc...

Doniesiono, że komórki linii monocytów-makrofagów istniejące w szpiku kostnym mogą różnicować się w monocyty krwi i makrofagi tkankowe1,2. Powyższe komórki, które mogą różnicować się w osteoklasty, aby zrównoważyć wzrost i rozwój kości, są powszechnie używane jako model komórkowy do indukcji osteoklastów in vivo3,4. Szpik kostny to specjalna tkanka zawierająca kilka różnych typów komórek, które obejmują między innymi mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego, komórki monocytów i makrofagów szpiku kostnego (BMM), hematopoetyczne komórki macierzyste, komórki śródbłonka i komórki odpornościowe. W rzeczywistości kilka wcześniejszych badań sugerowało, że przylegające komórki wydostające się z jamy szpiku kostnego kości długiej mogą różnicować się w osteoblasty, osteoklasty, chondrocyty lub adipocyty5,6,7,8. Chociaż do wytworzenia różnych jednorodnych populacji komórek zastosowano różne metody izolacji i hodowli, nadal istnieją duże wyzwania związane z izolacją i hodowlą BMM z różnych typów komórek.
Opracowano kilka metod ekstrakcji jednojądrzastych makrofagów szpiku kostnego (BMSC). Jednak większość tych metod jest złożona9,10,11. Na przykład wirowanie w gradionym spadku gęstości wymaga specjalistycznego zestawu, a operacja jest czasochłonna i uciążliwa. Ta metoda jest odpowiednia do izolacji BMM z próbek krwi o dużej objętości, ale nie z próbek szpiku kostnego9,12,13. Ponadto ekstrakcja próbek tkanek za pomocą trawienia kolagenazy jest złożoną i czasochłonną procedurą; ta metoda nie jest zalecana do izolacji BMM od próbek szpiku kostnego14,15. Ponadto, mimo że separacja przepływowa może prowadzić do powstania wysoce oczyszczonych populacji monocytów/makrofagów, wymaga bardzo dużych rozmiarów próbek oraz wysokich wymagań dotyczących przyrządów i sprzętu10,16. Dodatkowo, metoda wzbogacania mikrogranulkami jest niezwykle kosztowna i niewykonalna w ogólnym laboratorium17.
Dlatego w obecnym badaniu zaproponowano wygodną, szybką i tanią metodę izolacji jednojądrzastych makrofagów ze szpiku kostnego. Komórki szpiku kostnego przylegające do różnych punktów czasowych wykorzystano do wyizolowania BMM przy użyciu metody wtórnej adhezji. BMM wyekstrahowane powyższą metodą mogą indukować powstawanie osteoklastów in vitro, zapewniając w ten sposób prosty i wygodny model komórkowy do przyszłych badań nad osteoporozą in vitro.

<table><tbody><tr><td>35 mm2 plastry do wspinania się po komórkach</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Antykatepsyna K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu anty-CD11</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 &mu; g / test, 1,675 mg / ml</td></tr><tr><td>anty-CD11b / c</td><td>Absin</td><td>abs124232</td><td>&nbsp; 1&mu; g/test, 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-TRAP</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Anty-&beta;-aktyna</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp; AF5003</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Plastry do wspinania się po komórkach</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Corning naczynia do hodowli komórkowych</td><td></td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik IgG</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td>dla IF, 1:2,000</td></tr><tr><td>koza anty-królik IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>dla WB, 1:2,000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro tech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro tech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD szczur</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd</td><td></td><td>1-10 dni</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania żelu SDS-PAGE Zestaw do barwienia</td><td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>TRAP/ALP</td><td>Wako</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Wrighta-Giemsa</td><td>Keygen Biotech</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek linii monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

Wraz ze spadkiem gęstości mineralnej kości, kości są bardziej podatne na złamania, co negatywnie wpływa na jakość życia pacjenta. Wzrost i rozwój kości są regulowane głównie przez osteoblasty i osteoklasty. Powszechnie przyjmuje się, że osteoklasty pochodzą z komórek monocytów i makrofagów szpiku kostnego (BMM). BMM i inne hematopoetyczne komórki macierzyste znajdują się w jamie szpiku kostnego. Dlatego wyizolowanie pojedynczych stabilnych BMM z różnych i niejednorodnych populacji komórek jest ogromnym wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji BMM od szczurów SD, zwany metodą wtórnej adherencji. Pobrano komórki adherentne hodowane przez 24-48 godzin w hodowli pierwotnej. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że około 37,94% komórek było CD11b/c+ (antygen powierzchniowy monocytów-makrofagów). Barwienie kwasową fosfatazą odporną na winian (TRAP) i analiza western blot wykazały, że BMM mogą różnicować się w osteoklasty in vitro. Powyższe wyniki sugerują, że wtórne komórki przylegające można uznać za odpowiedni model komórkowy do badań nad różnicowaniem osteoklastów.

Wtórna populacja komórek adherentnych była stabilna i jednorodna. Wraz z ciągłą proliferacją komórek większość z nich stała się większa, przybrała nieregularny kształt i wyrosła w radialny dysk adherentny (Rysunek 2C,D). Cytometria przepływowa wykazała, że odsetek komórek wykazujących ekspresję CD11b/c, markera molekularnego na powierzchni komórek linii monocytarno-makrofagicznej, wynosił około 37,94% (Rysunek 2A...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji BMM od szczurów SD, zwany metodą wtórnego przylegania.

Izolacja komórek linii monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

W tym protokole komórki monocytów-makrofagów szpiku kostnego są ekstrahowane metodą wtórnej adherencji. Komórki monocytów-makrofagów szpiku kostnego mogą z powodzeniem różnicować się w osteoklasty, co zapewnia stabilny model komórkowy do badania osteoklastów in vitro. Ta metoda jest odpowiednia dla małych próbek szpiku kostnego i może łatwo i szybko wyodrębnić komórki monocytów i makrofagów szpiku kostnego ze szpiku kostnego, bez konieczności korzystania z zaawansowanego technologicznie sprzętu laboratoryjnego.Wzrost osteoklastów może być potencjalną patogenezą osteoporozy. Komórki monocytów-makrofagów szpiku kostnego mają pewną wartość badawczą jako komórki prekursorowe osteoklastów. Na początek zanurz uśpione szczury w 75% alkoholu na 10 minut w celu dezynfekcji.Po ostrożnym usunięciu wszystkich kończyn szczura nożyczkami i kleszczami, odessać PBS za pomocą pipety i spłukać krew przylegającą do kończyn. Następnie na dwóch mililitrach 10% FBS DMEM do pięciomililitrowej probówki. Po przeniesieniu kości kończyn do pięciomililitrowej probówki, za pomocą nożyczek pokrój kości kończyn w probówce na małe kawałki i wymieszaj homogenat w celu ponownego zawieszenia komórek szpiku kostnego w pożywce hodowlanej.Odstaw na pięć minut, aż fragmenty tkanki osiądą na dnie probówki. Następnie dodaj 10 mililitrów 10% FBS DMEM do 100-milimetrowej naczyń hodowlanej, a następnie przenieś supernatant do szalki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez około 24 godziny.Po tym czasie inkubacji większość mezenchymalnych komórek macierzystych przylega do ściany naczynia hodowlanego i rośnie powoli, podczas gdy większość komórek monocytów-makrofagów szpiku kostnego będzie nadal zawieszona w pożywce hodowlanej. Przenieś zawiesinę komórek w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym do nowej kolby o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych i kontynuuj hodowlę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez dodatkowe 24 godziny. Po ostrożnym usunięciu starej pożywki, zastąp ją świeżą pożywką po tym, jak komórki monocytów-makrofagów szpiku kostnego przylgną do ściany kolby.Cytometria przepływowa wykazała, że odsetek komórek wykazujących ekspresję CD11b i c, markera molekularnego na powierzchni komórek linii monocytów-makrofagów, wynosił około 37,94%Przy ciągłej proliferacji komórek większość komórek stała się większa w nieregularnym kształcie i wyrosła w promieniście przylegający dysk. Wyniki barwienia TRAP wykazały, że w porównaniu z grupą kontrolną, liczba wewnątrzkomórkowych fioletowoczerwonych granulek była istotnie zwiększona w komórkach indukowanych aktywatorem receptora liganda czynnika jądrowego kappa B i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów. Analiza Western blot wykazała, że poziomy ekspresji białek specyficznych dla osteoklastów TRAP i katepsyny K były znacznie zwiększone w leczonych komórkach w porównaniu z grupą kontrolną.Najważniejszą rzeczą w tej procedurze jest czas na zebranie wtórnych komórek adherentnych w ciągu 24 do 48 godzin hodowli pierwotnej, komórki monocytów-makrofagów szpiku kostnego zaczynają całkowicie przylegać. Komórki monocytów-makrofagów szpiku kostnego wyizolowane tą metodą mogą być indukowane do osteoklastów in vitro, zapewniając stabilny model komórkowy do badania osteoporozy.

isolation-monocyte-macrophage-lineage-cells-from-rat-bones-secondary

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Ten protokół opisuje technikę izolacji w celu uzyskania pierwotnych mezenchymalnych komórek zrębu rezydujących w płucach od szczurów, poprzez zastosowanie trawienia enzymatycznego, separacji gradientu gęstości, przylegania plastiku i selekcji kulek magnetycznych CD146+.

Izolacja mezenchymalnych komórek zrębowych płuc rezydentnych CD146 + z płuc szczura

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Ten artykuł przedstawia metodę, która łączy przyleganie całego szpiku kostnego i sortowanie cytometrią przepływową do izolacji, hodowli, sortowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego z żuchwy szczura.

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy u szczurów

Prezentowany tutaj jest protokół dołączania peptydu CD47 (pepCD47) do metalowych stentów za pomocą chemii polibisfosfonianów. Funkcjonalizacja stentów metalowych za pomocą pepCD47 zapobiega przyłączaniu się i aktywacji komórek zapalnych, poprawiając w ten sposób ich biokompatybilność.

Łagodzenie przyczepiania się komórek krwiopochodnych do metalowych implantów poprzez immobilizację peptydów pochodzących z CD47

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

To badanie przedstawia dwie techniki izolowania licznych pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) ze szpiku kostnego szczura. Jedna metoda łączy komercyjny zestaw do izolacji neutrofili z wirowaniem w gradionym przepływie gęstości, podczas gdy druga wykorzystuje tylko wirowanie w gradiencie gęstości. Oba podejścia dają funkcjonalne NET przewyższające te z neutrofili krwi obwodowej.

Unikalne podejście do izolowania neutrofili szpiku kostnego szczurów o porównywalnej pojemności

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Mezenchymalne komórki macierzyste ze szpiku kostnego szczęki pełnią znaczące funkcje w różnorodnym różnicowaniu, samoodnawianiu i modulacji immunologicznej. Stały się one kluczowym rezerwuarem komórek prekursorowych w terapii genowej, inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiamy unikalną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szczęki u szczurów.

Technika izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szpiku szczurów

Naucz się izolacji komórek monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji. Ta technika umożliwia skuteczną ekstrakcję i różnicowanie osteoklastów, dostarczając niezawodnego modelu do badań biologii osteoklastów in vitro.

Izolacja komórek linii monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji

Przeglądaj więcej filmów