Name: Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj metodę badania struktur receptorów sfingozyno-fosforanowych przy użyciu krioelektronowej mikroskopii i chromatografii. Ta technika umożliwia rozwój ukierunkowanych terapii farmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dane kompleksu S1PRs-Gi zostały zebrane w Centrum Krio-EM Zachodniochińskim na Uniwersytecie Sichuan oraz Centrum Krio-EM na Południowym Uniwersytecie Nauki i Technologii (SUSTech) i przetworzone w Centrum Obliczeń Wysokiej Wydajności Duyu na Uniwersytecie Sichuan. Praca ta była wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (32100965 do L.C., 32100988 do W.Y., 31972916 do Z.S.) oraz Fundusz Badań Podoktoranckich Uniwersytetu Syczuańskiego (2021SCU12003 do L.C.)

<ol><li>Verstockt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+modulation+and+immune+cell+trafficking+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).</li>
<li>Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+and+its+receptors%3A+structure%2C+signaling%2C+and+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence.</a> Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).</li>
<li>Cartier, A., Hla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate%3A+Lipid+signaling+in+pathology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy.</a> Science. 366 (6463), 5551(2019).</li>
<li>Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+sphingosine-1-phosphate+in+cardiovascular+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology.</a> Pharmacological Research. 156, 104793(2020).</li>
<li>Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptor+nomenclature+review%3A+IUPHAR+Review+8%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).</li>
<li>Bryan, A. M., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 20 (5), 12836(2018).</li>
<li>Pelletier, D., Hafler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fingolimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fingolimod for multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).</li>
<li>Obinata, H., Hla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate and inflammation.</a> International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).</li>
<li>Pyne, N. J., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate and cancer.</a> Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).</li>
<li>Abu-Farha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lipid+metabolism+in+COVID-19+virus+infection+and+as+a+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544(2020).</li>
<li>Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fingolimod%3A+lessons+learned+and+new+opportunities+for+treating+Multiple+Sclerosis+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).</li>
<li>Murakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29+regulates+vascular+contraction+via+S1P3+receptor%3A+investigation+based+on+a+new+S1P3+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist.</a> Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siponimod for multiple sclerosis.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).</li>
<li>Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod%3A+a+review+in+secondary+progressive+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis.</a> CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).</li>
<li>Lamb, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Ozanimod: first approval.</a> Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).</li>
<li>Scott, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod+%28RPC1063%29+is+a+potent+sphingosine-1-phosphate+receptor-1+%28S1P1%29+and+receptor-5+%28S1P5%29+agonist+with+autoimmune+disease-modifying+activity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).</li>
<li>McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SphK-S1P-SIPR+pathway+as+a+potential+therapeutic+approach+for+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189(2020).</li>
<li>O'Sullivan, C., Dev, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+function+of+the+S1P1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure and function of the S1P1 receptor.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+GPCR-G+protein+complex+in+lipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).</li>
<li>Renaud, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+in+drug+discovery%3A+achievements%2C+limitations+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).</li>
<li>Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+G+protein-coupled+receptors%3A+new+opportunities+from+XFELs+and+cryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM.</a> Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors%3A+structure-+and+function-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7(2021).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+signaling+complexes+of+lipid+receptors+S1PR1+and+S1PR5+reveal+mechanisms+of+activation+and+drug+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition.</a> Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+sphingosine-1-phosphate+recognition+and+ligand+selectivity+of+S1PR3-Gi+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes.</a> Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+sphingosine-1-phosphate+receptor+1+activation+and+biased+agonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism.</a> Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).</li>
<li>Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+cAMP+synthesis+by+Gi-coupled+receptors+upon+ablation+of+distinct+Galphai+protein+expression.+Gi+subtype+specificity+of+the+5-HT1A+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).</li>
<li>Buccioni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+functional+cAMP+assay+for+studying+G+protein-coupled+receptors%3A+application+to+the+pharmacological+characterization+of+GPR17%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signalling%22%5BJournal%5D)">Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17.</a> Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).</li>
<li>Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase-based+GloSensor+cAMP+assay%3A+Temperature+optimization+and+application+to+cell-based+kinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies.</a> Methods. , (2021).</li>
<li>Audet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+approach+for+precrystallization+screening+in+GPCR+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).</li>
<li>Sgro, G. G., Costa, T. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+grid+preparation+of+membrane+protein+samples+for+single+particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74(2018).</li>
<li>White, J. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+cryo-electron+microscopy%3A+from+sample+to+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62415(2021).</li>
<li>Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+pre-processing+and+on-the-fly+analysis+of+data+for+high-resolution%2C+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy.</a> Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).</li>
<li>Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+approach+to+single-particle+processing+in+RELION%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline approach to single-particle processing in RELION.</a> Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Brilot, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam-induced+motion+of+vitrified+specimen+on+holey+carbon+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film.</a> Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gctf%3A+Real-time+CTF+determination+and+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Gctf: Real-time CTF determination and correction.</a> Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+selection+of+cryo-EM+particles+in+RELION-1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3.</a> Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+mechanisms+of+lipid+GPCRs+by+lysophosphatidic+acid+and+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate.</a> Nature Communications. 13 (1), 731(2022).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+VIP1+receptor-G+protein+complex+revealed+by+a+NanoBiT+tethering+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4121(2020).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassays+of+adenosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+and+guanosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+using+acetylcholinesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase.</a> Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Protokół ten opisuje podstawowy potok do określania struktur S1PR za pomocą cryo-EM i pomiaru siły aktywacji S1PR za pomocą testu inhibicji cAMP za pośrednictwem Gi. Niektóre kroki są kluczowe dla powodzenia eksperymentu.
Aby oczyścić kompleks S1PRs-Gi, należy zwrócić większą uwagę na jakość wirusa i zdrowie komórek sf9 . Ekspresja receptora jest dramatycznie zmniejszona w słabych komórkach sf9 . Zdrowie komórek sf9 oceniano, mierząc ich średnicę. Zdrowa komórka ...

Sfingozyno-1-fosforan (S1P), produkt metaboliczny sfingolipidów w błonie komórkowej, jest wszechobecną lizofosfatydową cząsteczką sygnałową, która obejmuje różne aktywności biologiczne, w tym transport limfocytów, rozwój naczyń krwionośnych, integralność śródbłonka i częstość akcji serca1,2,3. S1P wywiera swoje różnorodne efekty fizjologiczne poprzez pięć podtypów receptora S1P (S1PR 1-5); S1PR znajdują się w różnych tkankach i wykazują unikalne preferencje dla dalszych białek G4,5. S1PR1 jest przede wszystkim sprzężony z białkiem Gi, które następnie hamuje produkcję cAMP; S1PR2 i S1PR3 są sprzężone z Gi, Gq i G12/13, a S1PR4 i S1PR5 transdukują sygnał przez Gi i G12/136.
S1P-S1PR sygnalizacja jest krytycznym celem terapeutycznym dla wielu chorób, w tym chorób autoimmunologicznych7, zapalenia8, cancer9, a nawet COVID-1910. W 2010 roku fingolimod (FTY720) został zarejestrowany jako pierwszy w swojej klasie lek ukierunkowany na S1PR w leczeniu nawrotu stwardnienia rozsianego (SM)11. Jest jednak zdolny do wiązania się ze wszystkimi S1PR z wyjątkiem S1PR2, podczas gdy niespecyficzne wiązanie z S1PR3 powoduje obrzęk kory mózgowej, zwężenie naczyń krwionośnych i oskrzeli oraz przeciek nabłonka płuc12. Jako alternatywną strategię zwiększania selektywności terapeutycznej wyprodukowano ligandy specyficzne dla podtypu receptora. Siponimod (BAF312) został zatwierdzony w 2019 r. do leczenia nawrotu SM13; skutecznie celuje w S1PR1 i S1PR5, podczas gdy nie ma powinowactwa do S1PR3, wykazując mniej skutków ubocznych w praktyce klinicznej14. W 2020 roku amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków zatwierdziła ozanimod do terapii stwardnienia rozsianego15. Doniesiono, że ozanimod ma 25-krotnie większą selektywność dla S1PR1 niż dla S1PR516. Warto zauważyć, że w kontekście obecnej pandemii COVID-19 odkryto, że leki agonistyczne ukierunkowane na S1PR mogą być stosowane w leczeniu COVID-19 przy użyciu technik terapii immunomodulującej17. W porównaniu z fingolimodem, ozanimod wykazał przewagę w obniżaniu objawów u pacjentów z COVID-19 i jest obecnie w trakcie badań klinicznych10. Zrozumienie podstaw strukturalnych i funkcji S1PR stanowi istotną podstawę do opracowania leku, który selektywnie celuje w S1PRs18.
Do badania informacji strukturalnych biomakromolekuł używa się wielu technik, w tym krystalografii rentgenowskiej, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i mikroskopii elektronowej (EM). Według stanu na marzec 2022 r. w Protein Databank (PDB) zdeponowano ponad 180 000 struktur, a większość z nich została rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Jednak wraz z pierwszą prawie atomową strukturą rozdzielczości TPRV1 (rozdzielczość 3,4 A) opisaną przez Yifan Cheng i Davida Juliusa w 2013 roku19, mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) stała się główną techniką dla struktur białkowych, a całkowita liczba struktur EM PDB wyniosła ponad 10 000. Krytycznymi obszarami przełomu są opracowanie nowych kamer do obrazowania, znanych jako kamery z bezpośrednią detekcją elektronów, oraz nowe algorytmy przetwarzania obrazu. Cryo-EM zrewolucjonizował biologię struktury i odkrywanie leków na podstawie struktury w ciągu ostatniej dekady20. Ponieważ zrozumienie, w jaki sposób kompleksy makromolekularne spełniają swoje skomplikowane role w żywej komórce, jest głównym tematem nauk biologicznych, cryo-EM ma potencjał do ujawnienia konformacji dynamicznych kompleksów molekularnych, szczególnie dla białek transbłonowych21. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są największą nadrodziną białek transbłonowych i są celem ponad 30% obecnie sprzedawanych farmaceutyków22. Rozwój cryo-EM przyczynił się do powstania struktur o wysokiej rozdzielczości kompleksów białkowych GPCR-G, umożliwiając określenie strukturalne dla "trudnych" celów, które nadal nie są dostępne do analizy krystalograficznej rentgenowskiej w projektowaniu leków23. W związku z tym aplikacja cryo-EM daje szansę na określenie trójwymiarowej struktury GPCR w warunkach zbliżonych do natywnych w rozdzielczości bliskiej atomowi24. Postępy w dziedzinie cryo-EM umożliwiają wizualizację mechanistycznych podstaw stymulacji lub hamowania GPCR, a także dalsze korzyści w odkrywaniu nowych miejsc wiązania dla tworzenia leków ukierunkowanych na GPCR25.
Opierając się na ogromnych postępach technologii cryo-EM, zidentyfikowaliśmy ostatnio struktury kompleksów sygnalizacyjnych S1PR1-, S1PR3- i S1PR5-Gi26,27. U ludzi S1PR znajdują się w różnych tkankach i wykazują unikalne preferencje dla dalszych białek G4,5. S1PR1 jest przede wszystkim sprzężony z białkiem Gi, które następnie hamuje produkcję 3′,5′-cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP). S1PR3 i S1PR5 są również zdolne do sprzężenia z Gi6,28. Ponieważ aktywacja receptora sprzężonego z Gi zmniejsza produkcję cAMP29, wprowadzono test cAMP z inhibicją w celu zmierzenia efektów hamowania cAMP w celu wychwycenia zmian funkcjonalnych26,27. Wykorzystując zmutowaną wersję lucyferazy Photinus pyralis, w której wstawiono ugrupowanie białkowe wiążące cAMP, ten test cAMP oferuje prostą i niezawodną metodę monitorowania aktywności GPCR poprzez zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP30. Jest to czuły i nieradioaktywny test funkcjonalny, który może być stosowany do monitorowania sygnalizacji w czasie rzeczywistym szerokiej gamy GPCR do celów odkrywania leków31.
Tutaj znajduje się podsumowanie krytycznych metod rozwiązywania problemów związanych z aktywacją i rozpoznawaniem leków w trybach S1PRs, w tym przede wszystkim manipulacje krio-EM i test cAMP z inhibicją. Niniejszy artykuł ma na celu dostarczenie kompleksowych wskazówek eksperymentalnych dla dalszych badań nad strukturami i funkcjami GPCR.

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,22 i mikro; Filtr M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 42213-PS</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator odcinający 100 kDa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88533</td><td></td></tr> płytka <tr><td>6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>Cat# 43016</td><td></td></tr><tr><td>płytka 96-dołkowa</td><td>Corning</td><td>Cat# 3917</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 9087-70-1</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>Cat# M0398S</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji bakulowirusa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10362100</td><td>Do przygotowania bakulowirusa P0</td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B6506</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C6512</td><td></td></tr><tr><td>CryoSPARC</td><td>Punjani, A., et al.,2017</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; kompetentny E.coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# EC0112</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferin-Sól potasowa</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# 50227</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# S311-500</td><td></td></tr><tr><td>ESF921 pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Systemy ekspresji</td><td>Cat#&nbsp; 96-001</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>F12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Box</td><td>Cat# SAG-01U-02</td><td></td></tr><tr><td>Żywica flagowa</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# A4596</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>APExBIO</td><td>Cat# B1421</td><td></td></tr><tr><td>Gctf</td><td>Zhang, 2016</td><td>&nbsp; https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td></tr> <tr><td>GDN</td><td>Anatrace</td><td>Cat# GDN101</td><td></td></tr><tr><td>Żelowa kolumna filtracyjna</td><td>GE healthcare</td><td>Cat# 28990944</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 3.11</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Solarbio</td><td>Cat# L1312</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP zestaw do oznaczania</td><td>Promega</td><td>Cat# E1291</td><td>Zestaw do oznaczania przewody pokarmowego cAMP</td></tr><tr><td>Plazmid GloSensor</td><td>Promega</td><td>Cat# E2301</td><td>Plazmid czujnika</td></tr><tr><td>Grace' s średni</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 11595030</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88284</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# H4034</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME Odczynnik</td> do <td>transfekcji Polyplus Cat</td><td># 114-15</td><td>odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Janamycin</td><td>Solarbio</td><td>Cat# K1030</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 12780052</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L2884</td><td></td></tr><tr><td>LMNG</td><td>Anatrace</td><td>Cat# NG310</td><td></td></tr><tr><td>MotionCor2</td><td>(Zheng et al., 2017)</td><td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td><td></td></tr><tr><td>NanoCab</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 1121822</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-G&alpha; i</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBacdual-G&beta; 1&gamma; 2</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# K210003</td><td>Do przygotowania plazmidów i bakulowirusa P0</td></tr><tr><td>Q5 Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce</td><td>NEB</td><td>Cat# E0554S</td><td>Do przygotowania plazmidów</td></tr><tr><td>Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>Cat# 251448</td><td></td></tr><tr><td>RELION-3.1</td><td>(Zivanov i wsp., 2018)</td><td></td><td></td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</tr><tr><td>S1PRs cDNA</td><td>addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>scFv16</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 703976</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Expression Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siponimod</td><td>Selleck</td><td>Cat# S7179</td><td></td></tr><tr><td>cholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1254</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 czytnik mikropłytek</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczne DNA T4L (sekwencja)</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagcattgggcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgagggggagaaac tcttcaaccaagatgatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagggcccgt<br/& Gt; atgactcccttgatgctgttcgccgcagcagcctt gatcaacatggttccaaatgggg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgagggcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaaggcatcatcactaccttccg tactggaacttgggccttac</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 77720</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Solarbio</td><td>Cat# T8180</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lizofosfolipidy (LPL) to bioaktywne lipidy, które zawierają sfingozyno-1-fosforan (S1P), kwas lizofosfatydowy, itp. S1P, produkt metaboliczny sfingolipidów w błonie komórkowej, jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych LPL, który reguluje różnorodne reakcje fizjologiczne komórek poprzez szlaki sygnałowe, w których pośredniczą receptory sfingozyno-1-fosforanu (S1PR). Sugeruje to, że system sygnalizacyjny S1P-S1PRs jest niezwykłym potencjalnym celem terapeutycznym dla zaburzeń, w tym stwardnienia rozsianego (SM), zaburzeń autoimmunologicznych, raka, stanów zapalnych, a nawet COVID-19. S1PRs, niewielki podzbiór rodziny receptorów sprzężonych z białkiem G klasy A (GPCR), składa się z pięciu podtypów: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 i S1PR5. Brak szczegółowych informacji strukturalnych utrudnia jednak odkrywanie leków ukierunkowanych na S1PR. Tutaj zastosowaliśmy metodę mikroskopii krioelektronowej, aby rozwiązać strukturę kompleksu S1P-S1PRs i wyjaśniliśmy mechanizm aktywacji, selektywnego rozpoznawania leków i sprzęgania białka G za pomocą testów funkcjonalnych opartych na komórkach. Inne receptory lizofosfolipidowe (LPLR) i GPCR mogą być również badane przy użyciu tej strategii.

Przed zamrożeniem próbki kompleksu S1PRs-Gi należy poddać ją rozdziałowi za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego (SEC) i przeanalizować metodą chromatografii żelowej. Rycina 2 przedstawia kompleks S1PR3-Gi jako przykład. Frakcja szczytowa jednorodnego kompleksu GPCR-białka G znajdowała się zazwyczaj przy ~10,5 mL w chromatografii wykluczania cząsteczkowego (Rycina 2A). Analiza SDS-PAGE kompleksu S1PR3-Gi (Rycina 2B) wyka...

S1P wywiera swoje różnorodne efekty fizjologiczne poprzez podrodzinę receptorów S1P (S1PRs). W tym miejscu opisano potok w celu wyjaśnienia struktur i funkcji S1PR.

Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Zajęliśmy się nastrojami aktywacji i przeliczania leku S1PRS przez załogę, manipulacjami EM i stanem GI INHAB A M A mniej istotnymi podstawami do opracowania leku, który jest solidnie ukierunkowany na S1PRS Postępy w umożliwianiu wirulizacji magnistycznych podmalówek stymulacji lub zamieszkiwania GP ZR oraz dalsze korzyści w odkrywaniu normalnych miejsc wiązania dla tworzenia leków ukierunkowanych na T BCR. Jakość próbki jest podstawą wszystkiego we właściwym eksperymencie EM. Podstawowe czynniki ułatwiające przygotowanie obejmują różne stany produktu sprzedaży linii SF i stężenie NG Demonstrując procedurę, będzie Heli Wang, absolwent z mojego poziomu.W celu oczyszczenia białek załaduj tę scenę palca jednym receptorem fosforanowym lub roztworem kompleksu białkowego S jeden P R S G do chromatografii wykluczającej rozmiar lub żelowej kolumny filtracyjnej SEC wstępnie zrównoważonej buforem SEC przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę w czterech stopniach Celsjusza. Aby wykorzystać zebrane frakcje do kriomikroskopii elektronowej, należy je zagęścić za pomocą koncentratora odcięcia 100 kilodaltonów w temperaturze 1 300 XG w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas przetwarzania danych do klasyfikacji 2D, we wstępnej klasyfikacji cząstek, wybierz funkcję klasyfikacji 2D w oprogramowaniu Rely On i kliknij przycisk Przeglądaj po prawej stronie pliku gwiazdki obrazów wejściowych w opcji IO.Następnie wybierz particles.star. Następnie w opcji optymalizacji ustaw liczbę klas na 100 i średnicę maski A na 140. W opcji obliczeniowej ustaw liczbę cząstek w puli na 10 i wprowadź katalog z szybkiego, szybkiego dysku lokalnego w polu kopiuj cząstkę do katalogu zapasowego.Aby przyspieszyć przetwarzanie, wybierz tak dla używanej akceleracji GPU. Aby wybrać podzbiór dobrych wyników 2D jako szablony, przejdź do opcji IO funkcji wyboru podzbioru i kliknij przejdź po prawej stronie wyboru klas z model.star. Następnie wybierz run_it025_model.Oznacz gwiazdką jako dane wejściowe i kliknij Uruchom w wyskakującym okienku, zaznacz opcję Sortuj obrazy według i Sortuj wstecznie. Następnie kliknij na wyświetlacz. Po wybraniu dobrych reprezentatywnych wyników 2D jako odniesienia dla funkcji automatycznego wybierania, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Zapisz wybrane klasy.Aby użyć szablonu do drugiej rundy automatycznego pobierania, przejdź do opcji IO funkcji automatycznego wybierania. Kliknij przycisk Przeglądaj po prawej stronie mikrofotografii wejściowych, aby wybrać opcję automatycznego wyboru, a następnie wybierz opcję micrographs.star. Następnie kliknij Przeglądaj po prawej stronie Referencje 2D i wybierz class_averages.star.Zaznacz również brak dla lub użyj leplossian w gaussowskim. Następnie wykonaj ekstrakcję cząstek za pomocą sufiksu podkreślenia sznurka auto pick.star. Wykonaj klasyfikację 2D za pomocą cząstek.gwiazda, a następnie wybór podzbioru za pomocą run podkreśl to zero 20 five_optimizer. gwiazda W celu ekstrakcji cząstek, po kliknięciu przycisku Przeglądaj po prawej stronie pliku gwiazdki mikrografii w opcji IO, wybierz opcję mikrografie. gwiazdka i wybierz Tak dla lub Ponownie wyodrębnij cząstki rafinowane.Po kliknięciu przycisku Przeglądaj po prawej stronie pliku gwiazdy z cząstkami rafinowanymi, wybierz pozycję cząstki. gwiazda, aby wygenerować początkowy model 3D i mapę referencyjną, kliknij na przeglądaj początkowy model 3D po prawej stronie pliku gwiazdy obrazów wejściowych w opcji IO i wybierz poprzedni particles.star. Następnie w opcji optymalizacji ustaw liczbę klas na jedną, a średnicę maski A na 140.Do klasyfikacji 3D i wygenerowania wstępnej mapy 3D, po wybraniu cząstek. gwiazdka Jak pokazano wcześniej, kliknij Przeglądaj po prawej stronie mapy referencyjnej i wybierz Początkowy model podkreślenia Dot MRC. Następnie w opcji optymalizacji ustaw liczbę klas na cztery do sześciu, a średnicę maski A na 140.Do generowania maski, po wybraniu dobrej mapy 3D jako danych wejściowych w opcji IO, ustaw początkowy próg binaryzacji na 0,05, a rozszerz mapę binarną do tej liczby pikseli na trzy. Następnie przejdź do opcji maski i ustaw. Dodaj miękką krawędź do tylu pikseli do ośmiu.Aby przeprowadzić następne przetwarzanie, otwórz oprogramowanie Trino Spark, utwórz nowy obszar roboczy i kliknij konstruktora zadań dla pierwszego zadania. Aby zaimportować stos cząstek, wprowadź ścieżkę cząstek w polu meta ścieżki cząstek oraz ścieżkę filmów w polu ścieżki danych cząstek. Następnie zaimportuj woluminy 3D, wprowadzając ścieżkę najlepszego woluminu 3D wygenerowanego wcześniej w ścieżce danych woluminu i wybierając maskę dla typu importowanego woluminu.W przypadku niejednorodnego zagęszczenia przeciągnij wcześniej wygenerowane zaimportowane cząstki podkreślenia jako dane wejściowe cząstki niejednorodnych zagęszczeń. Importowany wolumin podkreślenia, podkreślenie jeden jako dane wejściowe objętości woluminu niejednorodnych zagłębień i zaimportowane podkreślenie maski podkreślenia jeden jako dane wejściowe maski niejednorodnych zagęszczeń. Maska. Następnie kliknij Q, aby rozpocząć przetwarzanie i powtórz procedurę, aby uzyskać dobrą rozdzielczość.Mapa 3D S1PRGI. Po budowie plazmidu i przygotowaniu do transfekcji przejściowej dodać dwa mikrogramy przygotowanego DNA do 200 mikrolitrów buforu odczynnika do transfekcji. Mieszaj, wirując przez 10 sekund i krótko obracając mieszaninę przed użyciem.Dodać cztery mikrolitry odczynnika do transfekcji i wymieszać przez wirowanie i wirowanie, jak pokazano wcześniej. Po inkubacji probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut, powoli wrzuć 200 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki zawierającej jedną komórkę CHOK i delikatnie potrząśnij płytką lub dokładnie wymieszaj. Po czterech do sześciu godzinach inkubacji należy zastąpić pożywkę do transfekcji pożywką do wzrostu komórek składającą się z pożywki F 12 i 10% fbs przed powrotem płytki do inkubatora.24 do 48 godzin po przecięciu komórek, zawiesić komórki w trzech mililitrach buforu SA z solą potasową lucyferiana D. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodać 90 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki płytki 96-dołkowej, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Do oznaczania sygnału fluorescencji, Najpierw przygotuj 10 milimolowe roztwory podstawowe siponimodu w D M S O. Następnie wykonaj seryjne rozcieńczenie w buforze HBS zawierającym 25 mikromolowych forskaliny i stymuluj komórki 10 mikrolitrami o różnych stężeniach tego roztworu agonisty przez 30 minut.Następnie policz sygnał luminescencji w czytniku mikropłytek, wybierając luminescencję jako metodę wykrywania. Punkt końcowy dla typu odczytu i światłowód luminescencyjny dla typu optyki w powiązanym oprogramowaniu. Ustaw również wzmocnienie optyki na 255.Następnie zaimportuj uzyskane wartości sygnału fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego i przetwórz dane za pomocą funkcji odpowiedzi na dawkę dopasowanej krzywej regresji nieliniowej. Kompleks S1PRS GI można było z powodzeniem oczyścić za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, co zostało zweryfikowane przez stronę SDS. Co więcej, protokół mikroskopii elektronowej zastosowany w tym badaniu był skuteczny w rozróżnianiu między cząstkami S1PRSGI o wyraźnych i dobrze zdefiniowanych klasach 2D a cząstkami o niskiej jakości.Co więcej, mapa mikroskopii elektronowej GI S1PR3 o dobrej rozdzielczości może zostać wygenerowana przez korelację powłoki kuśnierza poprzez niejednorodne udoskonalenie. Po analizie strukturalnej przeprowadzono testy funkcjonalne dla S jeden P R trzy poprzez transfekcję komórek C H O K one z plazmidami receptorowymi i czujnikowymi, które wykazały, że stosunek plazmidu receptora do plazmidu czujnikowego wynoszący jeden do trzech daje optymalne wyniki. Jednak wyniki były mniej realistyczne w cholernie 2 93 komórkach W tym przetwarzaniu wybór algorytmów w sekcji cząstek oraz sekcji klasyfikacji 2D i 3D jest ważny dla rozwiązania kompleksów białkowych MPS G, zwłaszcza dla modelowania wycieków i ecfs.

a-pipeline-to-investigate-structures-signaling-pathways-sphingosine-1

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Fosfoinozydy to lipidy sygnalizacyjne, których względna obfitość szybko zmienia się w odpowiedzi na różne bodźce. W artykule opisano metodę pomiaru obfitości fosfoinozytydów poprzez metaboliczne znakowanie komórek 3 H-mio-inozytolem, a następnie ekstrakcję i deacylację. Wyekstrahowane glicero-inozytydy są następnie rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i oznaczane ilościowo przez scyntylację przepływową.

Znakowanie radioaktywne i oznaczanie ilościowe poziomów komórkowych fosfoinozytydów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z przepływem

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia i kwalifikacji każdego gatunku sfingomieliny za pomocą monitorowania wielu reakcji i trybu MS/MS/MS, odpowiednio.

Ilościowa i jakościowa metoda oznaczania sfingomieliny metodą LC-MS przy użyciu dwóch stabilnych izotopowo znakowanych gatunków sfingomieliny

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity o ugruntowanej roli w chorobach człowieka. Scharakteryzowanie zmian w tkankach za pomocą spektrometrii mas może ujawnić role w etiologii choroby lub zidentyfikować cele terapeutyczne. Jednak związek KTT stosowany do kriokonserwacji w biorepozytoriach zakłóca spektrometrię mas. Przedstawiono metody analizy sfingolipidów w tkankach ludzkich osadzonych w OCT za pomocą LC-ESI-MS/MS.

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

Ten protokół wykorzystuje pęcznienie agarozy jako potężną i dającą się uogólnić technikę włączania integralnych białek błonowych (IMP) do gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków lipidowych (GUV), jak opisano tutaj dla rekonstytucji ludzkiego białka receptora serotoninowego 1A (5-HT1AR), jednej z klas farmakologicznie ważnych receptorów sprzężonych z białkiem G.

Budowa modelowych błon lipidowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G (GPCR)

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Przedstawiamy wytyczne dotyczące rozwoju syntetycznych 'chemicznych przetworników', które mogą indukować komunikację między naturalnie niepowiązanymi białkami. Ponadto przedstawiono szczegółowe protokoły syntezy i testowania specyficznego "przetwornika", który umożliwia czynnikowi wzrostu aktywację enzymu detoksykacyjnego, a w konsekwencji regulację rozszczepienia proleku przeciwnowotworowego.

Naśladowanie funkcji białek sygnałowych: w kierunku terapii sztucznej transdukcji sygnału

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Poznaj metodę badania struktur receptorów sfingozyno-fosforanowych przy użyciu krioelektronowej mikroskopii i chromatografii. Ta technika umożliwia rozwój ukierunkowanych terapii farmakologicznych.

Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych

Przeglądaj więcej filmów