Name: Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę przygotowania cząstek rdzenia nukleosomów z czynnikami naprawy DNA do mikroskopii krioelektronowej. Zoptymalizowany protokół umożliwia strukturalne badania chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Mario Borgnia z rdzenia cryo-EM w Narodowym Instytucie Nauk o Zdrowiu Środowiskowym oraz Dr. Joshua Straussowi z University of North Carolina w Chapel Hill za ich mentoring i szkolenie w zakresie przygotowania sieci krio-EM. Dziękujemy również dr Julianie Mello Da Fonseca Rezende za pomoc techniczną w początkowych etapach tego projektu. Doceniamy kluczowy wkład i wsparcie zmarłego dr Samuela H. Wilsona i członków jego laboratorium, zwłaszcza dr Rajendry Prasada i dr Joonasa Jamsena w celu oczyszczenia genetycznie połączonego kompleksu APE1-Polβ. Badania zostały wsparte przez Intramural Research Program National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [numery grantów Z01ES050158, Z01ES050159 i K99ES031662-01].

1. Składanie cząstek rdzenia nukleosomu za pomocą dializy z użyciem soli
UWAGA: Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów przy użyciu rekombinowanych białek histonowych do badań strukturalnych zostało szczegółowo opisane przez innych14,15,16. Postępuj zgodnie z oczyszczaniem rekombinowanych histonów X. laevis i zespołem oktamera histonu opisanym przez innych14,15, i złóż substrat nukleosomalny zgodnie z opisem poniżej.
<ol>
	<li>Należy zakupić trzy oligonukleotydy (wymienione w tabeli 1) we wskazanej skali: UND-197mer, 161mer, 35mer.
	<ol>
		<li>STRONA oczyszcza ultramery (197mer i 161mer) zgodnie z opisem17.
		<ol>
			<li>Równomolowe ilości oligonukleotydów wyżarzanych w 1x buforze do wyżarzania (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Na przykład wymieszaj 40 μl 161-mera [166,7 μM]; 8 μl 35-mera [292,4 μM]; 16,8 μl 197-merowej nici comp [408,2 μM]; 10 μl 10x buforu do wyżarzania i 10,9 μl dH2O. 
			UWAGA: Bardzo ważne jest kontrolowanie reakcji wyżarzania za pomocą gradientu temperatury. Szczegółowe informacje na temat gradientu temperatury znajdują się w Tabeli 2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj rekonstytucje na małą skalę (skaluj o współczynnik 1/57 z przykładu pokazanego poniżej dla końcowej objętości 50 μL), aby określić stosunek DNA do oktamera histonów (typowe proporcje początkowe DNA:oktamer są następujące: 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2; pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A); kluczowe jest empiryczne określenie tego stosunku w przypadku rekonstytucji na małą skalę.
	<ol>
		<li>Po ustaleniu tego stosunku należy przygotować rekonstytucję na dużą skalę. Na przykład wymieszaj 32,9 μl DNA-197 pz [99,4 μM]; 1647,1 μL TE (1x); 1120 μl 5 M NaCl i 62,3 μl oktamera histonu WT [2,56 μM].</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj do dializy:RB niski i RBwysoki, jak opisano odpowiednio w Tabeli 3 i Tabeli 4; ustaw rekonstytucje zgodnie z wcześniejszym opisem14.
	<ol>
		<li>Przenieść rurkę dializacyjną do zlewki zawierającejwysoki poziom RB i pozostawić do kontynuowania dializy, delikatnie mieszając, przez 16 godzin lub do momentu, gdy 2 lRB low zostaną przeniesione do zlewki na odpady.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść rurkę dializacyjną do zlewki o pojemności 1 l zawierającej bufor RB50 mM (tabela 5) i pozostawić próbkę do dializacji przez co najmniej 3 godziny lub przez noc.
	<ol>
		<li>Ocenić skuteczność rekonstytucji na 6% żelu niedenaturującym z poliakryloamidu, upewniając się, że jest mniej niż 10% wolnego DNA i pojedyncze prążko NCP; przechowywać NCP w temperaturze 4 °C. Zobacz Rysunek 2A (tor 5) i <silna klasa="xfig">Rysunek 2B dla reprezentatywnych optymalnych wyników rekonstytucji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie kompleksu czynnika naprawczego NCP-DNA (NCP-DRF)
<ol>
	<li>Oczyszczanie za pomocą elektroforezy w żelu preparatywnym 
	UWAGA: Ta metoda jest najbardziej pracochłonna (z dwóch opisanych) i chociaż jest skuteczna w usuwaniu gatunków o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6A) ze względu na wysoki współczynnik rozcieńczenia, może prowadzić do pewnego demontażu, jak pokazano w <silna klasa = "xfig" > Figura 7A (NCP przygotowuje linię wyjścia komórki), uwalniając DNA. Jednak do 25% wolnego DNA jest nadal zgodne z badaniami krio-EM. Ze względu na wysokie rozcieńczenie, tę metodę należy stosować tylko do oczyszczania NCP, a nie całego kompleksu.
	<ol>
		<li>Przygotować 70 ml 6% niedenaturującego roztworu żelu poliakrylamidowego w 0,2x TBE, używając roztworu żelu poliakryloamidowego 37,5:1, akrylamid:bisakrylamid. Wlać cylindryczny żel o promieniu zewnętrznym 28 mm i polimeryzować przez noc.</li>
		<li>Zmontować aparat do pracy z żelem preparatywnym za pomocą membrany dializacyjnej z odcięciem 6-8 kDa MW. Użyj 0,25x TBE jako bufora bieżącego i 1x buforu elucyjnego (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Uruchom cylindryczny żel ze stałą mocą 12 W przez 1 godzinę i zbierz frakcje uruchamiające pompę perystaltyczną z natężeniem przepływu około 1 ml/min. 
		UWAGA: Jeśli detektor UV nie jest dostępny do identyfikacji frakcji zawierających DNA, można przeprowadzić eksperyment przesiewowy z 32P-NCP w celu zidentyfikowania interesujących frakcji. Zachowując wszystkie warunki bez zmian, nieoznakowane KPK mogą być następnie oczyszczane bez detektora UV.</li>
		<li>Zagęścić 2,8 ml NCP do 250 μl za pomocą filtra odśrodkowego (odcięcie MW 30 kDa) i naładować na żel preparatywny i elektroforezę na łącznie 6 godzin. Po 2 godzinach, gdy cyjanol ksylenu wyczerpie się z żelu, zacznij zbierać frakcje 1,5 ml. 
		UWAGA: Po 2,5 godziny frakcje będą wolne od cyjanolu ksylenowego; DNA (197mer) eluuje się po około 3-3,5 godzinie, a NCP oczekuje się elucji po 4,5-5 godzinach.</li>
		<li>Analizuj interesujące frakcje na 6% niedenaturującym żelu poliakrylamidowym. Pula frakcji zawierających NCP i natychmiast zagęścić za pomocą filtra odśrodkowego (odcięcie MW 30 kDa) do 1 mg/ml. Następnego dnia oceń jakość NCP na 6% żelu niedenaturującym poliakryloamidu przed skompleksowaniem z interesującym czynnikiem naprawy DNA (DRF).</li>
		<li>Inkubować NCP i DRF będące przedmiotem zainteresowania na lodzie przez 15 minut, używając optymalnego buforu dla konkretnego kompleksu. Na przykład zmieszaj 1 000 μl NCP [1,2 μM]; 260 μL 5x buforu wiążącego (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μL 3 M KCl i 18 μL MBP- Pol β-APE1 [338 μM]. 
		UWAGA: Temperatura i siła jonowa, w której powstaje kompleks, mogą wymagać optymalizacji dla różnych kompleksów.</li>
		<li>Dodaj aldehyd glutarowy (świeżo otwarty; EM) do końcowego stężenia 0,005%. Dlatego do tej reakcji dodać 26,8 μl 0,25% aldehydu glutarowego z 13,2 μl dH2O. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 13 min.</li>
		<li>Gasić 1 M Tris-Cl, pH 7,5, do końcowego stężenia 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Zagęścić do ~50 μL i wymienić bufor na 1x bufor zamrażający: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 za pomocą kolumny odsalającej. 
		UWAGA: Aldehyd glutarowy może powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu; Jest szkodliwy w przypadku połknięcia i jest toksyczny w przypadku wdychania. Noś fartuch laboratoryjny, okulary, rękawice i trzymaj aldehyd glutarowy w dygestoriach i noś maskę. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest przeprowadzenie reakcji sieciowania w dużej objętości z NCP przy tym niższym stężeniu. Wcześniejsze próby sieciowania, nawet przy tym stężeniu aldehydu glutarowego, ale przy 10-krotnie wyższym stężeniu NCP, prowadziły do agregacji próbki i nadmiernego sieciowania, jak wskazano SDS PAGE i chromatografia wykluczania wielkości. Siatki te nie zawierały żadnych dostrzegalnych cząstek, a jedynie grudki (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D,E).</li>
		<li>Oznaczyć absorbancję przy OD280 i OD260 i w razie potrzeby zagęścić dalej, aby osiągnąć 1,3-3 mg / ml, w oparciu o OD280 (typowy stosunek OD260 / OD280 = 1,7-2 daje dobre cząstki). W przypadku tej małej objętości 50 μl najlepszą metodą zmniejszenia ubytku próbki jest wykonanie przycisku do dializy z pokrywką rurki o pojemności 1,7 ml pokrytej membraną do dializy (odcięcie 6-8 kDa MW), przecięcie dna rurki i użycie krawędzi rurki do uszczelnienia membrany na górze pokrywy.</li>
		<li>Umieść przycisk dializy zawierający próbkę na złożu glikolu polietylenowego, z membraną skierowaną w dół (sprawdzaj postęp co 2 minuty). Metoda ta jest preferowana, gdy wymagane stężenie jest mniejsze lub równe 2,5-krotności, aby uniknąć rozcieńczenia lub utraty próbki w koncentratorze. Bardzo ważne jest, aby po tym etapie natychmiast przygotować siatki krio-EM kompleksu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie metodą chromatografii wykluczającej wielkość
	<ol>
		<li>Dzień przed zamrożeniem umyć i zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość z 60 ml dH2O, a następnie 80 ml buforu zamrażającego (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) przez noc z szybkością 0,4 ml/min. Stosując NCP bezpośrednio po rozpuszczeniu, przygotować ten sam kompleks, używając 2,5 razy większych ilości w następujący sposób: zmieszać 2 500 μl NCP [1,2 μM]; 650 μL 5x buforu wiążącego; 45 μL MBP-Pol β-APE1 [338 μM] i 55 μL 3M KCl.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę na lodzie bez środka sieciującego przez 15 minut. Następnie dodać aldehyd glutarowy do końcowego stężenia 0,005%, zgodnie z opisem w metodzie żelu preparatywnego. W tym przypadku należy jednak skoncentrować kompleks we wstępnie zrównoważonym (z buforem zamrażającym) filtrze odśrodkowym do około 120 μl.</li>
		<li>Natychmiast przeanalizować frakcje pików i skoncentrować te frakcje, które zawierają histony i MBP-Pol β-APE1, jak wskazano wcześniej. Zobacz Rysunek 5A,B,C, aby uzyskać pomyślne wyniki przy użyciu metody wykluczania rozmiaru i Rysunek 7 przy użyciu obu metod.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zamrożenie kompleksu nukleosomalnego
<ol>
	<li>Po włączeniu zamrażarki wgłębnej i napełnieniu nawilżacza 50 mldH2O, należy ustawić temperaturę komory na 22 °C, aH R (wilgotność) na 98%. Umieść kubek na etan i kubek na ciekły azot (zawierające oznakowane pudełko z siatką) w odpowiednich uchwytach przestrzennych.</li>
	<li>Przykryj kubek na etan dozownikiem z pokrywką do etanu i ostrożnie zalej go ciekłym azotem (LN2), jednocześnie napełniając kubek LN2 LN2. Gdy poziom LN2 ustabilizuje się i osiągnie 100% oraz temperaturę -180 °C, ostrożnie otwórz zawór etanu i napełnij kubek na etan, aż utworzy się pęcherzyk na przezroczystej pokrywie. Wyjmij dozownik etanu.</li>
	<li>Umieść dwie bibuły filtracyjne na bibułce i zabezpiecz je metalowym pierścieniem. Przejdź do konfiguracji i użyj następujących parametrów do blottingu: 0 pre-blot, 3 s blot, 0 post-blot; wybierz A-plunge i kliknij OK.</li>
	<li>Na ekranie głównym kliknij Load Forceps i załaduj je siatką tak, aby strona z węglem/aplikacją była skierowana w lewo (przygotowana jak poprzednio). Skalibruj kleszcze, regulując oś Z, aby zapewnić solidną plamę. Kliknij na Dolną komorę i nałóż 3 μL kompleksu (1,3-3 mg/mL; OD280). Kliknij na Blot/A-plunge. Spowoduje to obrócenie siatki, aby osuszyć od przodu i zanurzy ją w zamrażarce.</li>
	<li>Przenieś i przechowuj siatkę w skrzynce rusztowej w komorze LN2. Gdy wszystkie cztery kratki zostaną zamrożone i umieszczone w skrzynce rusztowej, obróć pokrywę do pozycji neutralnej, w której wszystkie kratki są zakryte pokrywą, i dokręć. Siatki mogą być przechowywane w LN2 do momentu rozpoczęcia przesiewania.</li>
</ol>
4. Siatki ekranu
<ol>
	<li>Przed załadowaniem próbek do mikroskopu umieść zeszklone siatki na pierścieniu i zabezpiecz je za pomocą zacisku C. Wykonaj ten proces przycinania pod LN2 w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności, aby uniknąć zanieczyszczenia lodem.</li>
	<li>Podczas ładowania mikroskopu włóż siatki do kasety z 12 gniazdami. Przenieś kasetę do kapsuły nanocab i załaduj ją do automatycznego ładowania. Mechanizm robota automatycznego ładowania inicjuje proces.</li>
	<li>Przenieś siatkę z kasety na stolik mikroskopu. Dostosuj stolik do wysokości eucentrycznej, obracając stolik o 10° i jednocześnie przesuwając wysokość Z, aż na obrazach zaobserwuje się minimalne przesunięcie płaszczyzny.</li>
	<li>Po osiągnięciu wysokości eucentrycznej rozpocznij obrazowanie. Najpierw uzyskaj atlas, wykonując zdjęcie montażowe siatki w formacie 3 x 3, na którym każdy montaż jest wykonywany w powiększeniu 62x. Wybierz trzy kwadraty o różnych rozmiarach; Weź wysokość eucentryczną, a następnie obraz w powiększeniu 210x.</li>
	<li>Po zobrazowaniu kwadratu wybierz po jednym otworze od krawędzi, środka i pomiędzy kwadratami. Zobrazuj każdy otwór w powiększeniu 2600x.</li>
	<li>Przed wykonaniem tego zdjęcia w dużym powiększeniu autofokus zachodzi z przesunięciem obszaru obrazowania. Zrób zdjęcie w dużym powiększeniu ze środka otworu przy powiększeniu 36 000x i czasie naświetlania 7,1 s, 60 klatkach, rozmiarze 1,18 piksela i rozmyciu 3 μm. Zobacz reprezentatywne zdjęcia z badań przesiewowych w Rysunek 5, <silna klasa="xfig">Rysunek 6 i <silna klasa="xfig">Rysunek 7.</li>
</ol>

<ol><li>Ehrenhofer-Murray, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+dynamics+at+DNA+replication%2C+transcription+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.</a> European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+mediated+interactions+in+the+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+1.9+a+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution.</a> Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).</li>
<li>Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+nucleosome+core+particle+containing+the+variant+histone+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z.</a> Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).</li>
<li>Tachiwana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+human+centromeric+nucleosome+containing+CENP-A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A.</a> Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and function.</a> Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).</li>
<li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+acetylation+of+histone+H3+decreases+polymerase+beta+activity+on+nucleosome+core+particles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).</li>
<li>Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+DNA+damage+in+chromatin%3A+Preparing+the+chromatin+landscape+for+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair.</a> DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).</li>
<li>Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+lysine+56+acetylation+enhances+AP+endonuclease+1-mediated+repair+of+AP+sites+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles.</a> Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).</li>
<li>Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unencumbered+Pol+beta+lyase+activity+in+nucleosome+core+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).</li>
<li>Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+location+of+DNA+lesions+in+nucleosome+core+particles+determines+accessibility+by+base+excision+repair+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).</li>
<li>Olmon, E. D., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ability+of+five+DNA+glycosylases+to+recognize+and+repair+damage+on+nucleosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA.</a> ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).</li>
<li>Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement+for+base+excision+repair+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement for base excision repair in chromatin.</a> Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).</li>
<li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nucleosome+core+particle+from+recombinant+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones.</a> Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).</li>
<li>McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+structure+determination+of+chromatin+enzyme%2Fnucleosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes.</a> Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+DNA+oligos+by+denaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).</a> Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).</li>
<li>Burgess, R. R. D., Murray, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurgess%2C+RRD+%22Guide+to+Protein+Purification%22">Guide to Protein Purification</a>. 463, Academic Press. (2009).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+to+a+homo-oligomeric+scaffold+allows+cryo-EM+analysis+of+a+small+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein.</a> Scientific Reports. 6, 30909(2016).</li>
<li>Wu, X., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+determination+of+small+proteins+by+nanobody-binding+scaffolds+%28Legobodies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationall+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies).</a> Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).</li>
<li>Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+of+sub-100+kDa+complexes+using+conventional+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM.</a> Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).</li>
<li>Takizawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+nucleosome+containing+the+ALB1+enhancer+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence.</a> Open Biology. 8 (3), 170255(2018).</li>
<li>Anderson, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+recognition+of+ubiquitylated+nucleosome+by+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase.</a> Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Specyficzny protokół oczyszczania czynnika naprawy DNA będzie zależał od enzymu będącego przedmiotem zainteresowania. Istnieją jednak pewne ogólne zalecenia, w tym stosowanie metod rekombinowanych do ekspresji i oczyszczania białek18; jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania jest zbyt małe (<50 kDa), określenie struktury za pomocą cryo-EM było do niedawna prawie niemożliwe dzięki zastosowaniu systemów fuzyjnych19, rusztowań wiążących nanociała20</su...

eukariotyczne DNA jest zorganizowane i zagęszczone przez białka histonowe, tworząc chromatynę. Cząstka rdzenia nukleosomu (NCP) stanowi podstawową powtarzającą się jednostkę chromatyny, która reguluje dostęp do białek wiążących DNA w celu naprawy, transkrypcji i replikacji DNA1. Chociaż pierwsza rentgenowska struktura krystaliczna NCP została po raz pierwszy rozwiązana ponad dwie dekady temu2 i od tego czasu opublikowano wiele innych struktur NCP3,4,5,6, mechanizmy naprawy DNA w substratach nukleosomalnych nie zostały jeszcze określone. Odkrycie szczegółów molekularnych leżących u podstaw naprawy DNA w chromatynie będzie wymagało charakterystyki strukturalnej uczestniczących składników, aby zrozumieć, w jaki sposób lokalne cechy strukturalne NCP regulują działania naprawcze DNA. Jest to szczególnie ważne w kontekście naprawy przez wycinanie zasady (BER), biorąc pod uwagę, że badania biochemiczne z enzymami BER sugerują unikalne mechanizmy naprawy DNA w nukleosomach, które są zależne od specyficznych dla enzymów wymagań strukturalnych dotyczących katalizy i pozycji strukturalnej uszkodzenia DNA w nukleosomie7,8,9,10,11,12,13. Biorąc pod uwagę, że BER jest istotnym procesem naprawy DNA, istnieje duże zainteresowanie wypełnieniem tych luk, a jednocześnie ustanowieniem punktu wyjścia, na podstawie którego można przeprowadzić inne technicznie wykonalne badania strukturalne z udziałem odpowiednich kompleksów nukleosomalnych.
Cryo-EM szybko staje się metodą wyboru do rozwiązywania trójwymiarowej (3D) struktury kompleksów, których przygotowanie jednorodnej próbki na dużą skalę jest wyzwaniem. Chociaż projektowanie i oczyszczanie NCP skompleksowanych z czynnikiem naprawy DNA (NCP-DRF) prawdopodobnie będzie wymagało dostosowanej optymalizacji, przedstawiona tutaj procedura generowania i zamrażania stabilnego kompleksu NCP-DRF dostarcza szczegółowych informacji na temat optymalizacji przygotowania próbki i siatki krio-EM. Dwa przepływy pracy (nie wykluczające się wzajemnie) pokazane w Rysunek 1, oraz szczegółowe informacje w protokole identyfikują krytyczne kroki i zapewniają strategie optymalizacji tych kroków. Prace te popchną dziedzinę naprawy chromatyny i DNA w kierunku, w którym uzupełnienie badań biochemicznych badaniami strukturalnymi stanie się technicznie wykonalne, aby lepiej zrozumieć molekularne mechanizmy naprawy DNA nukleosomów.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES; pH 7,5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Bio-rad</td><td>1610733</td><td></td></tr><tr><td>25% aldehydu glutarowego</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>3 M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>043398.K2</td><td></td></tr><tr><td>491 Komórka przygotowawcza</td><td>Bio-rad</td><td>1702926</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra 15 (odcięcie MW 30 kDa)</td>Filtr odśrodkowy <td>Millipore Sigma Z717185</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 (odcięcie MW 30 kDa)</td><td>Pęseta Millipore Sigma</td><td>UFC8030</td><td></td></tr> AutoGrid <tr><td>Automatyczna zamrażarka wgłębna</td><td></td> Ted Pella 47000-600 <td></td> Leica Leica EM GP <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler dotykowy C-1000</td><td>Bio-rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy i pierścienie C</td><td>Thermo Fisher</td><td>6640--6640</td><td></td></tr><tr><td>Stacja klipsowania</td><td>SubAngostrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>Membrana dializowa (MW cufoff 6-8 kDa)</td><td></td>Pęseta diamentowa Fisher Scientific <td>15370752</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Techni-Pro</td><td>758TW0010</td><td></td></tr><tr><td>dsDNA</td><td>Zintegrowane DNA Technologie</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FEI Titan Krios</td><td>Thermo Fisher</td><td>KRIOSG4TEM</td><td></td></tr><tr><td>System oczyszczania FPLC</td><td>AKTA Pure</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor frakcji Model 2110</td><td>Bio-rad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>System czyszczenia z wyładowaniami jarzeniowymi</td><td>Ted Pella</td><td>91000S Skrzynki</td><td></td></tr><tr><td>siatkowe</td><td>SubAngostrom</td><td>PB-E</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet akcesoriów do przechowywania w siatce</td><td>SubAngostrom</td><td>GSAX</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły etan</td><td>N/A</td><td>N/A N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Pompa dwugłowicowa perystaltyczna Minipuls 3</td><td>Gilson</td><td>F155008</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini żele białkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6695BOX</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (VWR) o niskiej retencji</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór żelu poliakrylamidowego (37,5:1)</td><td>Bio-rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>glikol polietylenowy (PEG)</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4338-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pur-A-lyzer Maxi 3500</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>PURX35050</tr><tr><td>Oczyszczony czynnik naprawy rekombinowanego DNA</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>R 1,2/1,3 Cu 300 mesh Siatki</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany oktamer histonowy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do przycinania sprężyn</td><td>SubAngostrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 kolumna 10/300</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9909-44</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>Talos Arctica 200 kV</td><td></td></tr> Zespół <tr><td>pęsety do FEI Vitrobot Mark IV-I</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>Thermo</td><td>Fisher Mark IV System</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Bibuła filtracyjna (55 mM)</td><td>Cytiva</td><td>1005-055</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>440700500</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Micro Spin Kolumny odsalające, 7K MWCO, 75 &mikro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89877</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy dna do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Naprawa DNA w kontekście chromatyny jest słabo zrozumiana. Badania biochemiczne z użyciem cząstek rdzenia nukleosomów, podstawowej powtarzającej się jednostki chromatyny, pokazują, że większość enzymów naprawczych DNA usuwa uszkodzenia DNA w mniejszym tempie w porównaniu z wolnym DNA. Szczegóły molekularne dotyczące tego, w jaki sposób enzymy naprawy przez wycinanie zasad (BER) rozpoznają i usuwają uszkodzenia DNA w nukleosomach, nie zostały wyjaśnione. Jednak biochemiczne dane BER substratów nukleosomalnych sugerują, że nukleosom przedstawia różne bariery strukturalne w zależności od lokalizacji uszkodzenia DNA i enzymu. Oznacza to, że mechanizmy wykorzystywane przez te enzymy do usuwania uszkodzeń DNA w wolnym DNA mogą być inne niż te stosowane w nukleosomach. Biorąc pod uwagę, że większość genomowego DNA jest składana w nukleosomy, potrzebna jest informacja strukturalna tych kompleksów. Do tej pory społeczność naukowa nie dysponuje szczegółowymi protokołami do przeprowadzenia technicznie wykonalnych badań strukturalnych tych kompleksów. W tym miejscu przedstawiamy dwie metody przygotowania kompleksu dwóch genetycznie połączonych enzymów BER (polimerazy β i endonukleazy AP1) związanych z luką pojedynczego nukleotydu w pobliżu wejścia-wyjścia nukleosmu do oznaczania strukturalnego mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM). Obie metody przygotowania próbek są kompatybilne z kratkami o jakości zeszklonej poprzez zamrażanie wgłębne. Protokół ten może być wykorzystany jako punkt wyjścia do przygotowania innych kompleksów nukleosomalnych z różnymi czynnikami BER, pionierskimi czynnikami transkrypcyjnymi i enzymami modyfikującymi chromatynę.

Prawidłowo zmontowane NCP (Rysunek 2) wykorzystano do utworzenia kompleksu z rekombinowanym białkiem fuzyjnym MBP-Polβ-APE1 (Rysunek 3). Aby określić stosunek NCP do MBP-Polβ-APE1 niezbędny do utworzenia stabilnego kompleksu, przeprowadzono analizę przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) (Rysunek 4), która wykazała pojedynczy przesunięty prążek NCP przy 5-krotnym nadmiarze molowym MBP-Polβ-APE1. Podczas optymalizacji proce...

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie kompleksów nukleosomalnych przy użyciu dwóch metod przygotowania próbek do zamrażania siatek TEM.

Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Informacje strukturalne na temat tego, w jaki sposób enzymy naprawcze przez wycinanie zasad usuwają zmiany DNA w kontekście chromatyny, były skąpe. Stanowi to istotną lukę w naszej wiedzy na temat mechanizmów związanych z etiologią chorób człowieka. Główną zaletą naszego protokołu jest to, że zoptymalizowaliśmy przygotowanie próbek przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.Pozwoli to innym biochemikom w tej dziedzinie uzupełnić swoje prace biochemiczne o technicznie wykonalne badania krioelektromagnetyczne. Nasz protokół może być dodatkowo wykorzystany do zbadania, w jaki sposób inne czynniki, w tym pionierskie czynniki transkrypcyjne, angażują nukleosom. Jest to obszar, w którym informacje strukturalne również zostały ograniczone.Optymalizacja przygotowania próbki przed przejściem do warunków zamrażania była kluczem do postępu naszego projektu, a najlepiej zrobić to za pomocą standardowych testów biochemicznych w warunkach projektowania substratów, wiązania i sieciowania. Na początek inkubuj NCP i interesujący czynnik naprawy DNA na lodzie przez 15 minut, używając optymalnego buforu dla określonego kompleksu. Następnie dodaj aldehyd glutarowy do końcowego stężenia 0,005%Po

preparation-nucleosome-core-particles-complexed-with-dna-repair

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono metodę rekonstytucji modelowych macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzeniowych i tandemowo powtarzanego DNA do pozycjonowania nukleosomów.  Opisujemy również, w jaki sposób eksperymenty z prędkością sedymentacji w ultrawirówce analitycznej i mikroskopia sił atomowych (AFM) są wykorzystywane do monitorowania stopnia nasycenia macierzy nukleosomalnej po rekonstytucji.

Składanie macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzenia i pozycjonowania nukleosomów DNA

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Ten protokół opisuje, jak wizualizować przejściowe zagęszczenie DNA u cyjanobakterii. Stosuje się hodowlę synchroniczną, monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, szybkie zamrażanie i wysokonapięciową kriotomografię elektronową. Przedstawiono protokół dla tych metodologii oraz omówiono przyszłe zastosowania i rozwój.

Wizualizacja zagęszczenia DNA u sinic za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Poznaj metodę przygotowania cząstek rdzenia nukleosomów z czynnikami naprawy DNA do mikroskopii krioelektronowej. Zoptymalizowany protokół umożliwia strukturalne badania chromatyny.

Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej

Przeglądaj więcej filmów