Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej
17 sierpnia 2022
Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie kompleksów nukleosomalnych przy użyciu dwóch metod przygotowania próbek do zamrażania siatek TEM.
Informacje strukturalne na temat tego, w jaki sposób enzymy naprawcze przez wycinanie zasad usuwają zmiany DNA w kontekście chromatyny, były skąpe. Stanowi to istotną lukę w naszej wiedzy na temat mechanizmów związanych z etiologią chorób człowieka. Główną zaletą naszego protokołu jest to, że zoptymalizowaliśmy przygotowanie próbek przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.
Pozwoli to innym biochemikom w tej dziedzinie uzupełnić swoje prace biochemiczne o technicznie wykonalne badania krioelektromagnetyczne. Nasz protokół może być dodatkowo wykorzystany do zbadania, w jaki sposób inne czynniki, w tym pionierskie czynniki transkrypcyjne, angażują nukleosom. Jest to obszar, w którym informacje strukturalne również zostały ograniczone.
Optymalizacja przygotowania próbki przed przejściem do warunków zamrażania była kluczem do postępu naszego projektu, a najlepiej zrobić to za pomocą standardowych testów biochemicznych w warunkach projektowania substratów, wiązania i sieciowania. Na początek inkubuj NCP i interesujący czynnik naprawy DNA na lodzie przez 15 minut, używając optymalnego buforu dla określonego kompleksu. Następnie dodaj aldehyd glutarowy do końcowego stężenia 0,005%Po dokładnym wymieszaniu inkubować w temperaturze pokojowej przez 13 minut.
Ugasić jednym molowcem Tris-CL do końcowego stężenia 20 milimolowych Tris-CL o pH 7,5. Następnie zagęścić do około 50 mikrolitrów i wymienić bufor na bufor zamrażający za pomocą kolumny odsalającej. Następnie określ absorbancję przy gęstości optycznej 280 i 260 nanometrów i w razie potrzeby zagęść dalej, aby osiągnąć 1,3 do 3 miligramów na mililitr w oparciu o gęstość optyczną 280 nanometrów.
Po przygotowaniu przycisku do dializy należy umieścić przycisk zawierający próbkę na złożu glikolu polietylenowego z membraną skierowaną w dół. Aby przeprowadzić oczyszczanie za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, należy umyć i zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość z 60 mililitrami wody destylowanej, a następnie 80 mililitrami buforu zamrażającego przez noc z szybkością 0,4 mililitra na minutę. Następnie należy natychmiast przeanalizować frakcje pikowe i zagęścić te frakcje, które zawierają białko infuzyjne histonu MBP-PolBeta-APE1.
Następujące procedury zademonstruje Elizabeth Viverette, stażystka po maturze z rdzenia cryo-EM w NIH. Po włączeniu zamrażarki wgłębnej i napełnieniu nawilżacza 50 mililitrami wody destylowanej, ustaw temperaturę komory na 22 stopnie Celsjusza i wilgotność na 98%Następnie umieść kubek na etan i kubek z ciekłym azotem w odpowiednich uchwytach przestrzennych. Następnie przykryj kubek z etanem dozownikiem z pokrywką etanu i ostrożnie zalej go ciekłym azotem, jednocześnie napełniając kubek na azot ciekłym azotem.
Gdy poziom ciekłego azotu ustabilizuje się i osiągnie 100%, a temperatura osiągnie minus 180 stopni Celsjusza, ostrożnie otwórz zawór etanu i napełnij kubek na etan, aż utworzy się bąbelek na przezroczystej pokrywie. Następnie wyjmij dozownik etanu. Umieść dwie bibuły filtracyjne na bibułce i zabezpiecz je metalowym pierścieniem.
Przejdź do ustawień i ustaw parametry bibuły zgodnie z opisem w manuskrypcie, a następnie wybierz A-Plunge i kliknij OK. Na ekranie głównym kliknij Load Forceps i załaduj je siatką stroną z aplikacją węgla skierowaną w lewo. Skalibruj kleszcze, regulując oś Z, aby zapewnić solidną plamę. Kliknij na Dolną komorę i nałóż trzy mikrolitry kompleksu.
Następnie kliknij Blot A-Plunge, który obróci siatkę, aby osuszyć od przodu i zanurzy ją. Po przeniesieniu przechowuj siatkę w skrzynce rusztowej w komorze ciekłego azotu. Gdy wszystkie cztery kratki zostaną zamrożone i umieszczone w skrzynce z siatką, obróć pokrywę do pozycji neutralnej, w której wszystkie kratki są zakryte pokrywą i dokręć.
Przed załadowaniem próbek do mikroskopu należy umieścić zeszklone siatki na pierścieniu i zabezpieczyć je za pomocą zacisku C pod ciekłym azotem w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności, aby uniknąć zanieczyszczenia lodem. Podczas ładowania mikroskopu włóż siatki do kasety z 12 gniazdami. Wtasuj kasetę do kapsuły nanocab i załaduj ją do automatycznego ładowania.
Następnie przenieś siatkę z kasety na stolik mikroskopu. Dostosuj stolik do wysokości eucentrycznej, obracając stolik o 10 stopni i jednocześnie przesuwając wysokość Z, aż na obrazach zostanie zaobserwowane minimalne przesunięcie płaszczyznowe. Po osiągnięciu wysokości eucentrycznej rozpocznij obrazowanie, wykonując obraz montażowy siatki o wymiarach 3 na 3, na którym każdy montaż jest wykonywany w powiększeniu 62x, aby uzyskać atlas.
Po wybraniu trzech kwadratów o różnych rozmiarach i wybraniu wysokości eucentrycznej, obraz w powiększeniu 210x. Po zobrazowaniu kwadratu wybierz po jednym otworze od krawędzi, środka i pomiędzy kwadratami. Następnie zobrazuj każdy otwór w powiększeniu 2 600x.
Zrób zdjęcie w dużym powiększeniu ze środka otworu przy powiększeniu 36 000x i czasie naświetlania 7,1 sekundy, 60 klatkach, rozmiarze piksela 1,18 i rozmyciu o trzy mikrometry. Zobacz reprezentatywne zdjęcia z badań przesiewowych. W celu określenia stosunku NCP do MBP-PolBeta-APE1 do tworzenia stabilnego kompleksu przeprowadzono testy przesunięcia ruchomości elektroforetycznej, które wykazały pojedynczo przesunięte pasmo NCP z pięciokrotnym nadmiarem molowym MBP-PolBeta-APE1.
W mniejszej objętości złożenie kompleksu NCP-PolBeta-APE1 wykazało, że próbka była nadmiernie usieciowana i doprowadziła do powstania agregatów bez dostrzegalnych pojedynczych kompleksów. Jednak dziesięciokrotne rozcieńczenie NCP skutkowało znacznie zmniejszoną agregacją i poprawą stabilności cząstek. Metody żelu preparatywnego i wykluczania wielkości można łączyć, w przypadku gdy żel preparatywny poprawia jakość KPK, gdy zawierają one znaczną ilość agregatów o dużej masie cząsteczkowej, a następnie następuje oczyszczanie kompleksu poprzez wykluczenie wielkości.
Wyniki pokazują, że obie metody mogą być stosowane niezależnie do generowania stabilnych kompleksów. Co więcej, dane zebrane z obu siatek pokazują prawie identyczne klasy dwuwymiarowe i trójwymiarowe mapy o rozdzielczości około 3,2 angstrema. W pierwszej kolejności należy określić optymalny stosunek NCP do czynnika naprawy DNA, a następnie sieciowanie kompleksu aldehydem glutarowym powinno być przeprowadzone w stężeniu co najmniej 10 razy bardziej rozcieńczonym niż potrzebne do zamrożenia.
Po uzyskaniu trójwymiarowej mapy kompleksu cryo-EM, konieczne będzie dalsze udoskonalenie strukturalne, aby określić, w jaki sposób znajduje się czynnik naprawy DNA i określić, które regiony są ważne dla tych interakcji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje przygotowanie kompleksów nukleosomalnych przy użyciu zoptymalizowanych metod przygotowania próbek do badań metodą cryo-EM. Odnosi się on do braku informacji strukturalnych dotyczących enzymów naprawy przez wycinanie zasad oraz ich oddziaływania z chromatyną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia strukturalna
- Dynamika chromatyny
Wprowadzenie
- Enzymy naprawy przez wycinanie zasad odgrywają kluczową rolę w usuwaniu uszkodzeń DNA.
- Zrozumienie tych mechanizmów jest niezbędne dla wglądu w etiologię ludzkich chorób.
- Informacje strukturalne w tym obszarze były ograniczone.
- Zoptymalizowane protokoły mogą zwiększyć wykonalność badań cryo-EM.
Cel badania
- Dostarczenie szczegółowego protokołu przygotowywania kompleksów nukleosomalnych.
- Umożliwienie badaczom uzupełnienia badań biochemicznych analizami strukturalnymi.
- Badanie oddziaływań pionierskich czynników transkrypcyjnych z nukleosomami.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek do mrożenia siatek TEM.
- Wykorzystanie standardowego sprzętu laboratoryjnego.
- Optymalizacja protokołów dla badań cryo-EM.
- Badanie wiązania nukleosomów przez różne czynniki.
Główne wyniki
- Zoptymalizowane metody pozwalają na efektywne przygotowanie próbek.
- Ułatwia badania strukturalne oddziaływań chromatyny.
- Stanowi podstawę dla przyszłych badań w tej dziedzinie.
- Kształtuje lepsze zrozumienie mechanizmów naprawy DNA.
Wnioski
- Protokół ten znacząco usprawnia badanie kompleksów nukleosomalnych.
- Wypełnia on istotną lukę w biologii strukturalnej w zakresie naprawy DNA.
- Zachęca do dalszego zgłębiania dynamiki i oddziaływań chromatyny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza strukturalna zaangażowania czynników naprawy DNA w kompleksy nukleosomowe pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu mechanizmów naprawy opartych na chromatynie, co ma bezpośredni wpływ na wczesny etap odkrywania i walidacji celów w szlakach stabilności genomu. Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w branży biofarmaceutycznej generowanie wysokiej jakości danych z kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) w odniesieniu do kompleksów nukleosomowych, co zwiększa pewność predykcyjną w zakresie redukcji ryzyka mechanistycznego oraz dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych dla programów ukierunkowanych na naprawę DNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację wiązania czynników naprawy DNA do substratów nukleosomalnych w celu analizy mechanistycznej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez wyjaśnienie, w jaki sposób kontekst chromatyny moduluje aktywność enzymów naprawczych.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez ujawnianie barier strukturalnych i interfejsów oddziaływań istotnych z punktu widzenia możliwości opracowania leków.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowane kompleksy nukleosomowe do dalszych analiz biochemicznych i strukturalnych.
- Standaryzuje przygotowanie próbek, poprawiając powtarzalność i ilościową ocenę zaangażowania czynników naprawczych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na związane z nukleosomami czynniki naprawcze w procesach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Łączy informacje o strukturze ze stanami chromatyny istotnymi dla choroby w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, umożliwiając testowanie hipotez w oparciu o strukturę.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju poprzez wyjaśnienie molekularnych mechanizmów działania czynników naprawczych w chromatynie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum badawcze – od wczesnych studiów nad mechanizmami po opracowanie modeli przedklinicznych – umożliwiając analizę związku między strukturą a funkcją czynników naprawczych związanych z chromatyną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących rekrutacji i aktywności czynników naprawczych w obrębie nukleosomów.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, strukturalnie zwalidowane kompleksy do opracowywania testów i profilowania związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki cryo-EM do analizy porównawczej wiązania czynników naprawczych i stanów konformacyjnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia strukturalne z kontekstami chromatyny istotnymi dla chorób w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku schemat postępowania, który można dostosować do innych enzymów modyfikujących chromatynę i czynników transkrypcyjnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach naprawy chromatyny.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i usprawnia przygotowanie próbek do wysokorozdzielczych badań cryo-EM.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie wykonalności strukturalnej w procesie badawczym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów ukierunkowanych na naprawę DNA i chromatynę z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w składaniu nukleosomów, tworzeniu kompleksów biochemicznych oraz przygotowywaniu siatek do cryo-EM.
- Wymaga dostępu do aparatury cryo-EM oraz infrastruktury analitycznej umożliwiającej obrazowanie o wysokiej rozdzielczości.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja projektowania substratów, wiązania oraz warunków sieciowania.
- Metoda może być dostosowana do różnych czynników naprawy DNA, czynników transkrypcyjnych i enzymów modyfikujących chromatynę poprzez optymalizację protokołu.
- Warunki agregacji próbek i sieciowania muszą zostać zoptymalizowane empirycznie, aby zapewnić stabilność cząsteczek i jakość danych.
