Name: Wielkoskalowy test grawitasji larw Caenorhabditis dauer (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test grawitaksji larw dauer Caenorhabditis elegans w badaniach neurobiologii zachowań. Ta metoda zwiększa czułość pomiarów i umożliwia szczegółową analizę sensorycznej percepcji grawitacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty badawcze z National Institutes of Health dla JHR (#R01 5R01HD081266 i #R01GM141493). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Chcielibyśmy podziękować Pradeepowi Joshiemu (UCSB) za jego wkład redakcyjny. Konsultacje statystyczne zapewnione przez UCSB DATALAB.

Szczepy użyte w niniejszym badaniu to C. elegans (N2) i C. briggsae (AF16) (zobacz Tabelę Materiałów). Do każdego testu wykorzystano populację dauerów mieszanej płci.
1. Przygotowanie komory
<ol>
	<li>Praca pod wyciągiem. Ustaw miejsce pracy z palnikiem Bunsena, 1-2 żyletkami, szczypcami, pęsetą i plastikową powierzchnią do cięcia (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Do każdej komory należy zebrać dwie pipety serologiczne o pojemności 5 ml. Wyjmij bawełniany korek z jednej pipety za pomocą pęsety. Przytrzymaj żyletkę nad palnikiem Bunsena, aż będzie gorąca za pomocą szczypiec. Użyj rozgrzanego ostrza, aby odciąć stożkowy koniec drugiej pipety, tak aby cała pipeta miała jednakową średnicę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Pracując szybko, zbliż dwie zmodyfikowane końcówki pipet do płomienia, lekko je topiąc. Połącz te końce, mocno je dociskając do siebie, upewniając się, że ścianki obu pipet są ciągłe. Jeśli po połączeniu widoczne są jakieś przerwy, rozdziel je i powtórz ten krok (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B).</li>
</ol>
2. Napełnianie komór agarem
<ol>
	<li>Przygotuj NGM z 4% agarem zgodnie ze standardowymi procedurami robaków21. Gdy agar jest jeszcze stopiony, napełnij każdą komorę, podłączając ją do pipety serologicznej i powoli wciągając roztwór. Uszczelnij końcówkę folią parafinową przed wyjęciem komory z pipetatora. Połóż komorę płasko (równolegle do blatu) do ostygnięcia. 
	UWAGA: Przykrycie kolby folią spożywczą (patrz Tabela materiałów) po autoklawowaniu pomaga zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w roztworze18.
	<ol>
		<li>Aby zminimalizować wszelkie różnice w konsystencji agaru spowodowane nierównomiernym chłodzeniem, należy trzymać pipetor (patrz Tabela Materiałów) równolegle do blatu podczas wyciągania agaru. Połóż komory płasko na blacie i pozwól agarowi stwardnieć przed przeniesieniem. 
		UWAGA: Procentową zawartość agaru i zawartość podłoża można dostosować do eksperymentu. 4% agar jest sztywniejszy niż około 2% stężenie używane do nalewania płytek i zapobiega zakopywaniu się robaków w podłożu w naszych dłoniach. Jednak inni eksperymentatorzy zaobserwowali zachowanie dorosłego robaka w grzebaniu w ziemi do 9% agar18,19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po schłodzeniu podgrzej klucz imbusowy 3 mm (lub inne metalowe narzędzie tego samego rozmiaru, patrz Tabela materiałów) nad palnikiem Bunsena. Mocno wciśnij go w ściankę każdej komory około 5 mm po jednej stronie linii środkowej, tworząc mały otwór w plastiku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Użyj rozgrzanego ostrza, aby usunąć bawełniane i zwężające się końce komory i uszczelnij te końce folią parafinową. 
	UWAGA: Po przygotowaniu każdą komorę należy zużyć w ciągu 1 dnia lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Przykryj wszystkie odsłonięte otwory folią parafinową, aby zapobiec wysychaniu agaru.</li>
</ol>
3. Izolowanie larw dauer
<ol>
	<li>10-15 dni przed eksperymentem pokrój każdy szczep na 2-3 duże płytki NGM z bakteriami OP50 i owiń folią parafinową. Po 10-15 dniach każda płytka musi być całkowicie zagłodzona, a na agarze, ściankach i pokrywkach znajdują się tysiące larw dauer. 
	UWAGA: Przygotuj talerze z wyprzedzeniem, używając grubej receptury OP50, aby uzyskać maksymalne zatłoczenie (patrz Tabela materiałów). Powstawanie Dauera można również indukować innymi metodami, w tym dodawaniem feromonów lub wzrostem w wyższych temperaturach22.</li>
	<li>Zebrać robaki, przepłukując pokrywki i płytki buforem M9 i pipetując roztwór do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Wirować z prędkością 1 600 x g przez 30-60 s w temperaturze pokojowej i zassać większość bufora M9 za pomocą pipety lub aspiratora próżniowego.</li>
	<li>Wyizoluj dauery, traktując je 1% SDS, a następnie 30% gradientem flotacji sacharozy zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem20.
	<ol>
		<li>Dodaj 7 ml 1% roztworu SDS do każdej osadki robaka. Pozostaw robaki w SDS na 30 minut; W tym czasie obracaj rurki w sposób ciągły, aby umożliwić napowietrzenie. Spłucz 3-5x M9, aby usunąć detergent.</li>
		<li>Następnie dodaj 5 ml M9, a następnie 5 ml zimnego, przefiltrowanego 60% roztworu sacharozy. Dokładnie wymieszaj, a następnie odwiruj przy 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać gradient separacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij nowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml 2 ml buforu M9. Zmiażdżyć końce szklanych pipet Pasteura w celu poszerzenia otworu i użyć tych pipet do przeniesienia górnej warstwy roztworu (zawierającej izolowane daurery) z gradientu sacharozy do nowych probówek. Opłucz dauers 3-5x za pomocą M9. 
	UWAGA: W tym momencie w roztworze będą znajdować się tysiące izolowanych dauerów. Można je zużyć natychmiast lub utrzymać w stanie napowietrzonym, obracając się w 5-7 ml M9 przez noc.</li>
</ol>
4. Dodawanie dauerów do komory
<ol>
	<li>Odwirować dauery o stężeniu 1 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać większość roztworu M9 za pomocą pipety lub aspiratora próżniowego. Aby oszacować zagęszczenie robaków, ręcznie policz liczbę robaków w trzech oddzielnych kropelkach o pojemności 1 μl pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj średniej z tych liczb, aby przybliżyć liczbę robaków na μL. 
	UWAGA: Niektóre pipety o małej objętości mogą nie być w stanie dotrzeć do dna probówki wirówkowej o pojemności 15 ml; W takim przypadku skoncentrowaną kropelkę robaków można najpierw przenieść na kawałek folii parafinowej.</li>
	<li>Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 10, 20 lub 200 μl, aby poszerzyć otwór. Ustaw mikropipetę na nieco większą objętość niż zamierzona objętość aspiracji. Zassać około 1-2 μl stężonego roztworu robaka (najlepiej między 100-300 robakami) i pozwolić, aby niewielka ilość powietrza dostała się do końcówki. 
	UWAGA: Duża liczba robaków (1,000+) w jednej komorze może zwiększyć zasięg pokonywanych odległości z powodu przeludnienia9.</li>
	<li>Delikatnie wepchnij końcówkę pipety do agaru, jednocześnie wciskając mikropipetę. Spowoduje to utworzenie miejsca wstrzyknięcia w agarze bez zatykania końcówki. Uwolnij robaki do agaru. Użyj folii parafinowej, aby uszczelnić otwór.</li>
</ol>
5. Przeprowadzanie i ocenianie testu
UWAGA: Gravitaxis może być testowany w różnych warunkach, które mogą wpływać na zachowanie9.
<ol>
	<li>Aby wyeliminować jak najwięcej zmiennych, umieść komory w ciemnej klatce Faradaya (patrz Tabela materiałów) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Oznacz każdą komorę i zawieś ją pionowo w klatce Faradaya (zrób to za pomocą taśmy do etykietowania). Testuj kontrole poziome równocześnie, układając niektóre komory płasko w tych samych warunkach środowiskowych. Zbadać szczepy doświadczalne przeciwko pionowo zorientowanym robakom N2 jako kontrolę pozytywną. Stosować komory zorientowane poziomo zawierające dauery N2 jako dodatkową kontrolę ujemną. 
	UWAGA: Testy poziome i pionowe muszą być wykonywane w tym samym otoczeniu w laboratorium, aby zminimalizować zmienność środowiskową między tymi dwoma warunkami. Duży inkubator może być używany do przechowywania obu klatek Faradaya.</li>
	<li>Dauery zaczynają rozpraszać się z miejsca startu po kilku godzinach i potrzebują kilku godzin, aby dotrzeć do któregokolwiek z końców komory. W tym czasie należy pozostawić komory w spokoju i naciąć w ciągu 12-24 godzin po wstrzyknięciu. 
	UWAGA: Nie używaj środków paraliżujących (takich jak azydek sodu) do unieruchamiania robaków, które dotarły do końców komór. Ponieważ mierzy się ogólne rozmieszczenie robaków, a nie indeks preferencji (jak w teście dwóch wyborów), azydek sodu nie jest potrzebny i może zmienić wyniki.</li>
	<li>Usuwaj i nacinaj komory grawitaksyjne pojedynczo. Poszukaj żywych markerów pod mikroskopem preparacyjnym i zaznacz ich położenie tuszem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C,D). Nie należy nacinać robaków w promieniu 2,5 cm po obu stronach miejsca wstrzyknięcia, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby robaki te wykazywały preferencję kierunkową.
	<ol>
		<li>Unikaj również nacinania robaków, które wydają się martwe lub są uwięzione w cieczy. Wyrzuć wszystkie komory zawierające >50% martwych lub pływających robaków. 
		UWAGA: Po wyjęciu komory z obszaru testowego należy ją niezwłocznie ocenić pod kątem dokładności. Dauery muszą być widoczne tylko między powierzchnią agaru a ścianką pipety. Jeśli zaobserwuje się zachowanie związane z kopaniem, rozważ zwiększenie stężenia agaru w przyszłych testach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby określić ilościowo wyniki, należy za pomocą markera podzielić każdą połowę komory na siedem 3,5 cm odcinków zaczynających się w odległości 2,5 cm od miejsca wstrzyknięcia (w niektórych pipetach 3,5 cm = 1 ml objętości). Użyj ręcznego licznika zliczającego (patrz Tabela materiałów), aby zliczyć liczbę robaków zaobserwowanych w każdej sekcji. 
	UWAGA: Po każdej stronie początku układu współrzędnych powinno znajdować się siedem sekcji, które można ponumerować od -7 (na dole) do +7 (na górze). Liczby te muszą odpowiadać tym samym względnym lokalizacjom w oparciu o to, jak komory zostały zbudowane; Agar jest rysowany od końca -7 do końca +7 w kroku 2.</li>
</ol>

<ol><li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+for+human+balance+control%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li>
<li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584(2014).</li>
<li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li>
<li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gravitational+Physiology%22%5BJournal%5D)">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li>
<li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391(2014).</li>
<li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%2C+is+regulated+by+IL2+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li>
<li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li>
<li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%A4der%2C+D-P+%22Euglena%3A+Biochemistry%2C+Cell+and+Molecular+Biology%22">Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology</a>. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston%27s+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li>
<li>Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186(2021).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069(2013).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493(2015).</li>
<li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293(2011).</li>
<li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li>
<li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn%27s+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Stata+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li>
<li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans%3A+a+sensible+model+for+sensory+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li>
<li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049(2018).</li>
<li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).</li>
<li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li>
<li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469(2013).</li>
<li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li>
<li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+the+vestibular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li>
<li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+vestibular+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li>
<li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207(2021).</li>
<li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hearing+and+balance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Porównanie z wcześniejszymi metodami W przeciwieństwie do chemotaksji, grawitaksji w Caenorhabditis nie można wiarygodnie zaobserwować przy użyciu tradycyjnego eksperymentalnego projektu płytki agarowej. Standardowa szalka Petriego ma średnicę 150 mm, co oznacza, że tylko 75 mm jest dostępne w każdym kierunku, aby dać możliwość wykazania preferencji grawitascytu. Chociaż preferencję orientacyjną C. elegans można oznaczyć w roztworze12, metoda ta jest mało pr...

Wyczuwanie przyciągania grawitacyjnego Ziemi jest kluczowe dla orientacji, ruchu, koordynacji i równowagi wielu organizmów. Jednak mechanizmy molekularne i obwody nerwowe odczuwania grawitacji są słabo poznane w porównaniu z innymi zmysłami. U zwierząt odczucie grawitacji oddziałuje z innymi bodźcami i może być przez nie konkurowane, aby wpływać na zachowanie. Wskazówki wizualne, proprioceptywne sprzężenie zwrotne i informacje przedsionkowe można zintegrować, aby wygenerować poczucie świadomości ciała w odniesieniu do otoczenia zwierzęcia1,2. I odwrotnie, preferencja grawitaktyczna może być zmieniona w obecności innych bodźców3,4,5. Dlatego zachowanie grawitaktyczne jest idealne do badania odczuwania grawitacji i zrozumienia złożonej integracji sensorycznej i podejmowania decyzji w układzie nerwowym.
C. elegans jest szczególnie użytecznym organizmem modelowym do badania grawitaksji ze względu na jego polifenowy cykl życia. Pod wpływem czynników stresogennych podczas rozwoju, w tym upału, przeludnienia lub braku pożywienia, larwy C. elegans przekształcają się w dauery, które są bardzo odporne na stres6. Jako dauery, robaki zachowują się charakterystycznie, np. w nictacji, w której robaki "stoją" na ogonach i machają głowami, co może ułatwić rozprzestrzenianie się do lepszych siedlisk7. Testy grawitaksji C. elegans i C. japonica sugerują, że larwy dauer negatywnie gravitaxe i że takie zachowanie jest łatwiej obserwowane u dauers niż u dorosłych8,9. Testowanie grawitasji u innych szczepów Caenorhabditis może ujawnić naturalną zmienność w zachowaniu grawitaktycznym.
Mechanizmy odczuwania grawitacji zostały scharakteryzowane u Eugleny, Drosophila, Ciony i różnych innych gatunków za pomocą testów grawitaksji3,10,11. Tymczasem badania grawitaxii w Caenorhabditis początkowo przyniosły mieszane wyniki. Badanie preferencji orientacyjnych C. elegans wykazało, że robaki orientują się z głowami skierowanymi w dół w roztworze, co sugeruje pozytywną preferencję grawitaktyczną12. Tymczasem, mimo że C. japonica dauers został wcześnie zidentyfikowany jako negatywnie grawitaktyczny8, zachowanie to zostało dopiero niedawno opisane w C. elegans9. Pojawia się kilka wyzwań związanych z opracowaniem reprezentatywnego testu grawitaksji u robaków. Szczepy Caenorhabditis są utrzymywane na płytkach agarowych; Z tego powodu testy behawioralne zazwyczaj wykorzystują płytki agarowe jako część swojego projektu eksperymentalnego<klasa SUP = "xref" >13,<klasa SUP = "xref">14,<klasa SUP = "XREF">15. Najwcześniejszy opisany test grawitataksji w Caenorhabditis został przeprowadzony przez postawienie płytki na boku pod kątem 90° do poziomej płytki kontrolnej8. Jednak zachowanie grawitasji nie zawsze jest solidne w tych warunkach. Podczas gdy dorosłe robaki mogą być badane pod kątem preferencji orientacyjnej w solution12, ta preferencja kierunkowa może być również zależna od kontekstu, prowadząc do różnych zachowań, jeśli robaki pełzają, a nie pływają. Ponadto C. elegans jest wrażliwy na inne bodźce, w tym światło i pola elektromagnetyczne16,17, które zakłócają ich reakcje na grawitację9. Dlatego zaktualizowany test grawitaksji, który chroni przed innymi zmiennymi środowiskowymi, jest ważny dla analizy mechanizmów tego procesu sensorycznego.
W niniejszym protokole opisany jest test do obserwacji Caenorhabditis gravitaxis. Przygotowanie do tego badania opiera się częściowo na metodzie opracowanej do badania integralności nerwowo-mięśniowej18,19. Larwy Dauer są hodowane i izolowane przy użyciu standardowych procedur20. Następnie są one wstrzykiwane do komór wykonanych z dwóch pipet serologicznych o pojemności 5 ml wypełnionych agarem. Komory te mogą być zorientowane pionowo lub poziomo i umieszczone w ciemnej klatce Faradaya na 12-24 godziny, aby chronić przed światłem i polami elektromagnetycznymi. Lokalizacja każdego robaka w komorach jest rejestrowana i porównywana z pionowymi taksacjami szczepu referencyjnego, takiego jak C. elegans N2.

<table><tbody><tr><td>1% roztwór dodecylosiarczanu</td><td></td><td></td> sodu <td>Od magazynu 10% (w/v) SDS w wodzie DI</td></tr><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Klucz</td><td></td><td></td> imbusowy 3 mm <td>Można użyć innych metalowych narzędzi o podobnej wielkości</td></tr> 4<tr><td>% agar w normalnym podłożu wzrostu (NGM) - 1 L</td><td></td><td></td><td>Przed autoklawowaniem: 3 g NaCl, 40 g agaru, 2,5 g peptonu, 2 g dekstrozy, 10 ml uracylu (2 mg/ml), 500 &mu; L Cholesterol (10 mg/ml), 1 ml CaCl2, 962 ml wody DI; Po autoklawowaniu: 24,5 ml buforu fosforanowego, 1 ml 1 MgSO4 (1 M), 1 ml Streptomycyny (200 mg/ml)</td></tr><tr><td>5 ml Pipety serologiczne</td><td>Fisherbrand</td><td>S68228C</td><td>Polistyren, nie szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>60% Zimny roztwór</td><td></td><td></td> sacharozy <td>60% sacharozy (w/v) w wodzie DI; sterylizować przez filtrację (0,45 &mu; m filtra). Trzymaj się 4 stopni; C</td></tr><tr><td>AF16 C. briggsae lub inny szczep</td><td></td><td></td><td>eksperymentalny Dostępne w CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr><tr>Palnik <td></td><td></td><td></td><td>Bunsena</td></tr><tr><td>Folia spożywcza</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305654</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka kliniczna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe żyletki</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Klatka</td><td></td><td></td> Faradaya <td>Może być zbudowana z tektury i folii aluminiowej; 30" dł. x 6" szer. x 26" wys. lub większe</td></tr><tr><td>Markery tuszowe</td><td></td><td></td><td>Sharpie lub inna marka do znakowania na plastiku</td></tr><tr><td>Taśma do etykietowania</td><td>Carolina</td><td>215620</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> M9 <td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td></tr><tr><td>N2 C. elegans</td><td></td><td></td><td>Dostępne w płytkach CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr> <tr><td>NGM z agarem OP50</td><td></td><td></td><td>1,7% (w/v) w NGM (patrz opis: agar 4% w NGM). Nasiona z folią parafinową OP50</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa deska</td><td></td><td></td><td></td>do krojenia</tr><tr><td>Szczypce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik obrotowy</td><td>pionowy BTLab SYSTEMS</td><td>BT913</td><td>Z probówką 22 x 15 ml</td></tr><tr><td>Pipetor serologiczny</td><td>Corning</td><td>357469</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Laxco</td><td>S2103LS100</td><td></td></tr><tr><td>Licznik talii</td><td>ULINE</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Grube podłoże NGM/płytka agarowa - 1 L</td><td></td><td></td><td>Zobacz 4% agar w przepisie NGM; zastąp 40 g agaru 20 g</td></tr><tr><td>pęsetą</td><td></td><td></td><td></td></tr> agarową</tbody></table>

wielkoskalowy test grawitasji larw caenorhabditis dauer

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Odczuwanie grawitacji jest ważnym i stosunkowo słabo zbadanym procesem. Wyczuwanie grawitacji umożliwia zwierzętom poruszanie się po otoczeniu i ułatwia poruszanie się. Dodatkowo, odczucie grawitacji, które występuje w uchu wewnętrznym ssaków, jest ściśle związane ze słuchem - dlatego zrozumienie tego procesu ma implikacje dla badań słuchowych i przedsionkowych. Testy grawitaksji istnieją dla niektórych organizmów modelowych, w tym Drosophila. Pojedyncze robaki były wcześniej badane pod kątem ich preferencji orientacyjnych, gdy osiedlają się w roztworze. Nie opisano jednak wiarygodnego i solidnego testu na Caenorhabditis gravitaxis. Niniejszy protokół określa procedurę wykonywania testów grawitataksji, które mogą być używane do testowania setek dauers Caenorhabditis jednocześnie. Ten wielkoskalowy, długodystansowy test pozwala na szczegółowe gromadzenie danych, ujawniając fenotypy, które mogą zostać pominięte w standardowym teście na płytce. Ruch Dauera wzdłuż osi pionowej jest porównywany z kontrolkami poziomymi, aby upewnić się, że odchylenie kierunkowe jest spowodowane grawitacją. Preferencje grawitaktyczne można następnie porównać między szczepami lub warunkami eksperymentalnymi. Ta metoda może określić molekularne, komórkowe i środowiskowe wymagania dotyczące grawitasji u robaków.

Porównanie gravitaksji między gatunkami 
Zgodnie z opisaną powyżej procedurą, gravitaksję form dauer C. briggsae można porównać z gravitaksją C. elegans oraz kontrolami w poziomie. Rozkład pionowy (bordowy) form dauer C. briggsae jest przesunięty w stronę górnych części komór, przy czym duży odsetek nicieni osiąga poziom +7 (Rycina 2A). W kontraście do kontroli w poziomie (turkusowy), w których formy dauer są rozmieszczone w krzywej zbliżonej do...

Obecny protokół przedstawia metody przeprowadzania zakrojonego na szeroką skalę testu grawitastycznego z larwami Caenorhabditis dauer. Protokół ten pozwala na lepsze wykrywanie zachowania grawitasji w porównaniu z testem na płytce.

Wielkoskalowy test grawitasji larw Caenorhabditis dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Ten wysokoprzepustowy test może być wykorzystany do obserwacji silnego zachowania grawitaktycznego u larw caenorhabditis dauer. Zachowanie robaków obserwuje się na duże odległości w porównaniu z testami wykonywanymi na szalce Petriego. Zwiększa to czułość testu i pozwala na szczegółową analizę danych.Badanie zachowania grawitaxii może dostarczyć informacji na temat tego, jak występuje odczucie grawitacji w zapaleniu bezzębnym, co ma znaczenie dla zrozumienia układu przedsionkowego ssaków. Tworzenie komór testowych grawitataksji, izolowanie dauerów i wstrzykiwanie robaków do komór wymaga praktyki. Możesz zaoszczędzić czas, izolując dauery i tworząc komory dzień wcześniej.Zacznij od ustawienia palnika Bunsena, jednej lub dwóch żyletek, szczypiec, pęsety i plastikowej powierzchni do cięcia oraz okapu wyciągowego. Aby zrobić komorę, zbierz dwie 5-mililitrowe pipety serologiczne i za pomocą pęsety wyjmij bawełnianą zatyczkę z jednej pipety. Przytrzymaj żyletkę za pomocą szczypiec nad palnikiem Bunsena, aż będzie gorąca.Użyj podgrzanego ostrza, aby odciąć stożkowy koniec drugiej pipety, tak aby cała pipeta miała jednolitą średnicę. Teraz szybko zbliż dwie zmodyfikowane końcówki pipet do

large-scale-gravitaxis-assay-of-caenorhabditis-dauer-larvae

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

C. elegans podczas składania jaj może dostarczyć ważnych informacji w badaniach rozwojowych, reprodukcyjnych i anatomicznych. Ten film przedstawia ważne etapy testu składania jaj i pokazuje próbkę eksperymentu, w którym lek jest testowany pod kątem toksyczności reprodukcyjnej.

Test składania jaj: metoda ilościowego określania zachowania C. elegans podczas składania jaj

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Opisujemy zmodyfikowaną ekstrakcję na małą skalę i testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicieni C. elegans. W przypadku korzystania z komercyjnych zestawów testowych ważny jest techniczny rozwój ich czułości i dokładności. Wytrącanie białek podczas ekstrakcji jest najbardziej krytycznym etapem ilościowego oznaczania metabolitów wewnątrzkomórkowych.

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Aby wykorzystać Caenorhabditis elegans (C. elegans) w badaniach omiki, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji robaków, gdzie pojedyncza próbka może być mierzona na różnych platformach do analiz porównawczych. Przedstawiono tutaj metodę hodowli populacji C. elegans na płytkach hodowlowych na dużą skalę (LSCP) oraz dokumentowania wzrostu populacji.

Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Poznaj wysokoprzepustowy test grawitaksji larw dauer Caenorhabditis elegans w badaniach neurobiologii zachowań. Ta metoda zwiększa czułość pomiarów i umożliwia szczegółową analizę sensorycznej percepcji grawitacji.

Wielkoskalowy test grawitasji larw Caenorhabditis dauer

Przeglądaj więcej filmów