Name: Protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu z wykorzystaniem Cucurbita pepo i Cucurbita moschata. Ta prosta metoda umożliwia regenerację niedojrzałych zarodków i poprawę różnorodności genetycznej w programach hodowlanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 oraz Instytut Nauk o Żywności i Rolnictwie Uniwersytetu Florydy.

1. Sadzenie i zapylanie
UWAGA: Ważne jest, aby zidentyfikować kompatybilne genotypy, których hybrydyzacja doprowadziłaby do zawiązania owoców i produkcji zdolnych do życia zarodków.
<ol>
	<li>Warunki sadzenia i pielęgnacja
	<ol>
		<li>Uzyskać nasiona genotypów dyni (odmiany/akcesje) do hybrydyzacji (Tabela 1).</li>
		<li>Wypełnij 50 komór (25 cm szerokości x 50 cm długości) podłożem doniczkowym wzbogaconym kompletnym nawozem NPK zawierającym 1,38 g/kg N, 1,38 g/kg P i 1,38 g/kg K.</li>
		<li>Wysiewaj nasiona na głębokość równą ich długości i przykryj podłożem doniczkowym. Podlewaj mieszkania bez tworzenia stojącej wody. Następnie utrzymuj podłoże wilgotne, podlewając je ręcznie raz dziennie.</li>
		<li>W drugim etapie prawdziwych liści sadzonki należy przesadzić do doniczek o średnicy od 25 cm do 30 cm, wzbogaconych kompletnym nawozem NPK w ilości 3 łyżek stołowych na doniczkę. Rośliny nawozić raz w tygodniu 500 ml / doniczkę płynnego nawozu zawierającego NPK 20:20:20 dodanego w stężeniu 1 g na galon wody.</li>
		<li>Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze między 22-28 °C w warunkach naturalnego oświetlenia. W przypadku genotypów winorośli należy zapewnić kratę nośną w szklarni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonywanie zapyleń
	<ol>
		<li>Zazwyczaj kwitnienie dyni rozpoczyna się po 6 do 8 tygodniach od wysiewu, w zależności od odmiany (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B). Rozpocznij kontrolowaną hybrydyzację (krzyżówki), gdy tylko rośliny zaczną kwitnąć. W warunkach szklarniowych zapylanie można odbywać przez cały rok.</li>
		<li>Zidentyfikuj kwiaty męskie i żeńskie odmian C. pepo i C. moschata, które będą gotowe do zapylenia następnego dnia. Aby zidentyfikować takie kwiaty, sprawdź, czy nie ma kwiatów, których płatki mają żółty odcień, ale nie są otwarte. Delikatnie przyklej kwiaty taśmą u góry za pomocą taśmy maskującej, aby zapobiec przypadkowemu zapyleniu przez owady (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, D).</li>
		<li>Rankiem następnego dnia kwiaty są gotowe do zapylenia. Przeprowadź zapylanie przed godziną 10:00, aby poprawić wskaźnik powodzenia hybrydyzacji27.</li>
		<li>Otwórz kwiaty żeńskie i męskie, delikatnie usuwając zaklejoną taśmą górną część płatków. Usuń płatki z męskiego kwiatu i przenieś pyłek, delikatnie pocierając pylnik o znamię żeńskiego kwiatu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
		<li>Po zapyleniu natychmiast zamknij zapylony żeński kwiat taśmą maskującą. Użyj znacznika, aby zapisać datę zapylenia i wskazać rodziców ze strony ojca i matki użytych w krzyżówce (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>O udanej krzyżówce świadczy rozszerzony jajnik, który szybko tworzy mały owoc w ciągu 1 tygodnia (<silna klasa="xfig">Ryc. 4A). Roślina jest wtedy gotowa do zbioru 45-55 dni po zapyleniu28 (Rysunek 4B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Technika ratowania zarodków
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża
	<ol>
		<li>Przygotuj zapasy antybiotyków: W przypadku cefotaksymu (soli sodowej) rozpuść antybiotyk w 4 ml wody dejonizowanej lub destylowanej, przefiltruj przez sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μm i przygotuj 0,5 ml porcji. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Otrzymany roztwór podstawowy będzie miał stężenie 250 mg/ml.</li>
		<li>W przypadku ampicyliny (soli sodowej) rozpuścić proszek w 10 ml wody, przefiltrować przez sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μm i podwielokrotność w 1 ml bulionu o końcowym stężeniu 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować pożywkę Murashige and Skoog (MS), rozpuszczając 2,45 g pożywki (stężenie 4,91 g/l) w 500 ml wody destylowanej w butelce o pojemności 1 l. Dodać 1,5 g gumy gellan i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min. Guma gellan całkowicie rozpuszcza się podczas autoklawowania.</li>
		<li>Po sterylizacji w autoklawie schłodzić pożywkę, umieszczając butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Wyjmij zapasy antybiotyków z zamrażarki i rozmroź je w komorze laminarnej.</li>
		<li>Przenieś pożywkę do okapu z przepływem laminarnym. Dodać 0,6 ml roztworu podstawowego cefotaksymu (250 mg/ml) i 0,25 ml bulionu ampicyliny (100 mg/ml) do pożywki i dobrze wymieszać. Wlać około 7 ml pożywki na sterylną szalkę Petriego (60 mm x 15 mm).</li>
		<li>Pozwól pożywce zastygnąć na szalkach Petriego przez około 15-20 minut. Zamknij szalki Petriego folią uszczelniającą i umieść je w pudełku do przechowywania. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ratowanie zarodków
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem wyczyść i wysterylizuj komorę laminarnego przepływu powietrza 70% alkoholem etylowym.</li>
		<li>Zbierz owoc dyni, łamiąc / odcinając go od głównej winorośli i zdezynfekuj powierzchnię owocu, myjąc go płynnym detergentem (np. 0,3% chloroksylenolu) w zlewie laboratoryjnym, aż cały luźny brud zostanie usunięty (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5A).</li>
		<li>Spłucz dużą ilością wody z kranu. Osusz owoce czystymi ręcznikami papierowymi. Przenieś owoce do komory laminarnego przepływu powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B).</li>
		<li>Sterylizuj powierzchnię owoców, rozpylając 70% etanolu na owoce w sterylnej komorze laminarnej z przepływem powietrza. Przetnij owoc na pół sterylnym nożem (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C) i wyekstrahuj nasiona.</li>
		<li>Użyj sterylnych kleszczy, aby aseptycznie otworzyć okrywę nasienną i odsłonić niedojrzałe zarodki (<silna klasa="xfig">Rysunek 6). Ostrożnie umieść niedojrzałe zarodki na szalce Petriego zawierającej pożywkę MS uzupełnioną cefotaksymem i ampicyliną (<silna klasa = "xfig">Ryc. 7A). Zamknąć szalkę Petriego i zamknąć folią do owijania. 
		UWAGA: W zależności od wielkości zarodka możliwe jest zmieszczenie pięciu lub sześciu zarodków na szalce Petriego.</li>
		<li>Umieścić zapieczętowane szalki Petriego z zarodkami w komorze wzrostowej w świetle 16-godzinnego fotoperiodu w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 70%. Jeśli dojdzie do zakażenia, należy niezwłocznie przeprowadzić subkulturę nieskażonych zarodków na nową płytkę z tym samym podłożem.</li>
		<li>Liścienie zaczną się rozszerzać po 4 dniach i zmienią kolor na zielony w ciągu 10 dni (<silna klasa="xfig">Rysunek 7B). W tym momencie, jeśli to konieczne, wykonaj subkulturację na nowe płytki zawierające to samo podłoże, aby umożliwić ekspansję tkanki. Korzenie zaczną pojawiać się po 14 dniach (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C), a po 21 dniach sadzonki będą miały wydłużone korzenie i liścienie (<silna klasa="xfig">Rysunek 7D). 
		UWAGA: Pożywka zastosowana w protokole jest odpowiednia do różnicowania na pędy i korzenie bez dodatkowych regulatorów wzrostu.</li>
		<li>Na tym etapie usuń sadzonki z szalek Petriego i delikatnie zmyj podłoże z korzeni wodą z kranu (<silna klasa="xfig">Rysunek 8). Umieść sadzonki w plastikowym pojemniku (14 cm x 9 cm x 4 cm) i przykryj korzenie mokrymi ręcznikami papierowymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 9A). Przykryj pojemnik i w razie potrzeby zwilż ręczniki papierowe.</li>
		<li>Przechowywać pojemniki w temperaturze pokojowej (25-28 °C) i z 16-godzinnym fotoperiodem. Ten krok zaaklimatyzuje sadzonki. Po aklimatyzacji przez 7-10 dni w pojemniku sadzonki będą miały około 3-4 długości włosów. W tym okresie w razie potrzeby ponownie zwilż ręczniki papierowe.</li>
		<li>Przenieś sadzonki do 50 początkowych komór (25 cm szerokości x 50 cm długości) uzupełnionych nawozem zgodnie z wcześniejszym opisem i przenieś je do szklarni (<silna klasa="xfig">Rysunek 9B). Nie podlewaj nadmiernie sadzonek, aby uniknąć gnicia; w razie potrzeby dodaj około 10-20 ml na komórkę.</li>
		<li>W drugiej do trzeciej fazie prawdziwych liści przesadzaj sadzonki do doniczek o średnicy 30 cm wypełnionych podłożem doniczkowym wzbogaconym nawozem, jak opisano wcześniej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 10A). Zapewnij podparcie kratowe dla roślin winorośli i przeprowadź kontrolowaną hybrydyzację, gdy rośliny zaczną kwitnąć, jak opisano wcześniej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 10B).</li>
		<li>Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze między 22-28 °C w naturalnym oświetleniu. Oceń rośliny pod kątem cech owoców i nasion.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Paris, H. S. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParis%2C+HS+%22Genetics+and+Genomics+of+Cucurbitaceae.+Plant+Genetics+and+Genomics%3A+Crops+and+Models%22">Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models</a>. Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. 20, (2016).</li>
<li>Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellites+for+the+genus+Cucurbita+and+an+SSR-based+genetic+linkage+map+of+Cucurbita+pepo+L%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L.</a> Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Paris, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetic+relationships+in+Cucurbita+pepo+%28Cucurbitaceae%29+using+DNA+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers.</a> Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).</li>
<li>Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+RW+%22Cucurbits%22">Cucurbits</a>. , CAB International. Wallingford, Oxon, UK. (1997).</li>
<li>Teppner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cucurbita+pepo+%28Cucurbitaceae%29-history%2C+seed+coat+types%2C+thin+coated+seeds+and+their+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Phyton+%28Horn%29%22%5BJournal%5D)">Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics.</a> Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).</li>
<li>Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+pumpkin+%28Cucurbita+moschata+Duch.+Ex+Poir.%29+for+fruit+yield+and+other+characters%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Breeding%22%5BJournal%5D)">Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters.</a> International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).</li>
<li>Paris, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+the+cultivar-groups+of+Cucurbita+pepo%5BTitle%5D)+AND+%22Horticultural+Reviews-Westport+Then+New+York%22%5BJournal%5D)">History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo.</a> Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71(2001).</li>
<li>Baggett, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attempts+to+cross+Cucurbita+moschata+%28Duch.%29+Poir.+%27Butternut+and+C.+pepo+L.+%27Delicata%27%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cucurbit+Genetics+Cooperative%22%5BJournal%5D)">Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'.</a> The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).</li>
<li>Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErwin%2C+AT+%22Agricultural+Experiment+Station%2C+Iowa+State+College+of+Agriculture+and+Mechanical+Arts%22">Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts</a>. , (1929).</li>
<li>Whitaker, T. W., Bohn, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+taxonomy%2C+genetics%2C+production+and+uses+of+the+cultivated+species+of+Cucurbita%5BTitle%5D)+AND+%22Economic+Botany%22%5BJournal%5D)">The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita.</a> Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).</li>
<li>Bemis, W. P., Nelson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+hybridization+within+the+genus+Cucurbita+I%2C+fruit+set%2C+seed+and+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Arizona+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development.</a> Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).</li>
<li>Washek, R. L., Munger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+of+Cucurbita+pepo+with+disease+resistant+Cucurbita+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cucurbit+Genetics+Cooperative%22%5BJournal%5D)">Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species.</a> The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92(1983).</li>
<li>Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+heterosis+in+Cucurbita+moschata+and+Cucurbita+pepo+interspecific+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Vegetable+Science%22%5BJournal%5D)">Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids.</a> International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).</li>
<li>De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+papaya+ringspot+virus+in+summer+squash+Cucurbita+pepo+L.+introgressed+from+an+interspecific+C.+pepo%C3%97+C.+moschata+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross.</a> Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).</li>
<li>Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Cucurbita+interspecific+hybrids+through+cross+pollination+and+embryo+rescue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22World+Applied+Sciences+Journal%22%5BJournal%5D)">Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique.</a> World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).</li>
<li>Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+advanced+interspecific-bridge+lines+among+Cucurbita+pepo%2C+C.+maxima%2C+and+C.+moschata%5BTitle%5D)+AND+%22HortScience%22%5BJournal%5D)">Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata.</a> HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).</li>
<li>Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+resistance+to+four+cucurbit+viruses+in+Cucurbita+moschata%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata.</a> Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).</li>
<li>Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+marker-assisted+pyramiding+of+genes+for+resistance+to+zucchini+yellow+mosaic+virus+in+oilseed+pumpkin+%28Cucurbita+pepo%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Breeding%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo).</a> Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).</li>
<li>Hayase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cucurbita-crosses.+XV.+Flower+pollination+at+4+am+in+the+production+of+C.+pepo+x+C.+moschata+F1+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Breeding%22%5BJournal%5D)">Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids.</a> Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).</li>
<li>Reed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+development+and+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Embryo rescue.</a> Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).</li>
<li>Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+rescue+in+plants-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Embryo rescue in plants-a review.</a> Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).</li>
<li>Wall, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+hybrids+of+Cucurbita+obtained+by+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Society+of+Horticultural+Science%22%5BJournal%5D)">Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture.</a> Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).</li>
<li>Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+cross+between+Cucurbita+pepo+L.+and+Cucurbita+martinezii+through+in+vitro+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture.</a> Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).</li>
<li>Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+size+analysis+in+the+genus+Cucurbita+and+its+use+for+determination+of+interspecific+hybrids+obtained+using+the+embryo-rescue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique.</a> Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).</li>
<li>Giancaspro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+in+vitro+embryo+rescue+protocol+for+breeding+seedless+table+grapes+%28Vitis+vinifera+L.%29+in+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy.</a> Horticulturae. 8 (2), 121(2022).</li>
<li>Warchol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+genotype%2C+media+composition%2C+pH+and+sugar+concentrations+on+oat+%28Avena+sativa+L.%29+doubled+haploid+production+through+oat+x+maize+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologiae+Plantarum%22%5BJournal%5D)">The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).</li>
<li>Nepi, M., Pacini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollination%2C+pollen+viability+and+pistil+receptivity+in+Cucurbita+pepo%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo.</a> Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).</li>
<li>Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+sensory+changes+during+development+and+storage+of+buttercup+squash%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Journal+of+Crop+and+Horticultural+Science%22%5BJournal%5D)">Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash.</a> New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).</li>
<li>Moon, P., Meru, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+rescue+of+aged+Cucurbita+pepo+seeds+using+squash+rescue+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Horticultural+Science+and+Research%22%5BJournal%5D)">Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium.</a> Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).</li>
<li>Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNu%C3%B1ez-Palenius%2C+HG+%22Plant+Embryo+Culture%22">Plant Embryo Culture</a>. , Humana Press. 107-115 (2011).</li>
<li>Vining, K. J., Loy, J. B. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVining%2C+KJ+%22Cucurbitaceae+98%3A+Evaluation+and+Enhancement+of+Cucurbit+Germplasm%22">Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm</a>. McCreight, J. M. , ASHS Press. Alexandria, VA. 64-69 (1998).</li>
<li>Vining, K. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Seed+development+in+hull-less-seeded+pumpkin+%28Cucurbita+pepo+L.%29%22">Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.)</a>. , University of New Hampshire. L.), Durham, NH. M.S. Thesis (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Istnieją dwa główne wąskie gardła dla udanej hybrydyzacji międzygatunkowej między C. moschata i C. pepo: bariera kompatybilności krzyżowej, która jest determinowana przez reakcję genotypu na produkcję zarodków hybrydowych, oraz bariery po zapłodnieniu, które utrudniają rozwój zarodków hybrydowych do normalnych nasion. Jak wcześniej informowano w przypadku dyni, test kompatybilności krzyżowej w obecnym badaniu wykazał, że większość owoców rozwijała się partenokarpowo, a większość nasion była<sup class='x...

Cucurbita (2n = 40) to bardzo różnorodny rodzaj w rodzinie Cucurbitaceae, który obejmuje 27 różnych gatunków, z których pięć jest udomowionych1. Wśród nich Cucurbita moschata, C. pepo i C. maxima mają największe znaczenie gospodarcze na świecie. W Stanach Zjednoczonych C. moschata i C. pepo to dwa najważniejsze gatunki w produkcji rolnej. C. pepo składa się z czterech podgatunków (ovifera, pepo, fraternal i gumala), które zawierają zarówno letnie, jak i zimowe grupy odmian dyni: krzywej szyjki, prostej szyi, żołędzi, przegrzebków, kokosa, szpiku warzywnego, cukinii i dyni2,3,4,5. C. moschata składa się głównie z zimowych rodzajów rynku squasha, w tym butternut, Dickinson i cheese group1. Te dwa gatunki są zróżnicowane morfologicznie i fenotypowo, przy czym C. pepo jest ceniony za plon, wczesność, pokrój krzewów i różnorodne cechy owoców, w tym kształt owoców, wielkość owoców, kolor miąższu i wzór skórki. Z drugiej strony C. moschata jest ceniona za przystosowanie do ciepła i wilgotności, a także odporność na choroby i szkodniki6,7. Hybrydyzacja międzygatunkowa między C. moschata i C. pepo jest nie tylko ważną strategią wprowadzania pożądanych cech między tymi dwoma gatunkami, ale także pozwala na poszerzenie bazy genetycznej w programach hodowlanych7,8.
Wczesne krzyżówki między C. moschata i C. pepo zostały wykonane w celu określenia ich kompatybilności i/lub barier taksonomicznych9,10,11, podczas gdy późniejsze badania skupiały się głównie na przenoszeniu pożądanych cech12,13,14. Międzygatunkowa hybrydyzacja między tymi dwoma gatunkami miała na celu przeniesienie nowych cech, takich jak pokrój wzrostu krzewów lub półkrzewów oraz poprawa plonów C. pepo, a także odporność na choroby, zdolność adaptacji do stresu abiotycznego i zwiększony wigor C. moschata14,15,16. Na przykład, specyficzne krzyżówki między C. pepo (P5) i C. moschata (MO3) zaowocowały wyższym plonem owoców13, podczas gdy akcesje C. moschata (Nigerian Local i Menina) były szeroko stosowane jako główne źródło odporności na potywirusy w uprawianych odmianach C. pepo17,18.
Poprzednie badania wykazały, że hybrydyzacja między C. moschata i C. pepo jest możliwa, ale trudna8,15. Krzyżówki międzygatunkowe mogą skutkować brakiem zawiązywania owoców (aborcja), owocami partenokarpicznymi pozbawionymi żywotnych nasion (pustymi nasionami), owocami bez pestek, w których niedojrzałe zarodki nie rozwijają się (stenospermokarpia) lub owocami z niewielką liczbą niedojrzałych zarodków, które można uratować w dojrzałe rośliny poprzez ratowanie zarodków15,16. Na przykład, żadne żywotne nasiona nie zostały uzyskane przez skrzyżowanie C. pepo (królowa stołu, matczyna) z C. moschata (duży ser, ojcowski), jednak odwrotna krzyżówka dała 57 żywotnych nasion ze 134 zapyleń9. Hayase uzyskała żywotne nasiona z krzyżówek C. moschata i C. pepo tylko wtedy, gdy krzyżówki zostały wykonane o godzinie 04:00 przy użyciu pyłku przechowywanego w temperaturze 10 °C przez noc19. Baggett skrzyżował osiem różnych odmian C. moschata z C. pepo (delicata) i poinformował, że spośród 103 wszystkich zapyleń uzyskano 83 owoce, które wyglądały normalnie, ale żaden z nich nie zawierał żywotnych nasion8. W krzyżówce C. pepo (S179) i C. moschata (NK), Zhang i in. uzyskali 15 owoców z 2994 nasionami, ale tylko 12 z tych nasion było zdolnych do życia, podczas gdy pozostałe wykazywały tylko szczątkowy rozwój. Badania te sugerują, że nawet jeśli krzyżowanie międzygatunkowe między C. moschata i C. pepo jest bardzo korzystne, uzyskanie owoców z żywotnymi nasionami z krzyżówek jest wymagające16.
Ratowanie zarodków zostało zasugerowane jako odpowiednia metoda przezwyciężania problemów wynikających z wczesnej aborcji lub słabo rozwiniętych embrionów i jest jedną z najwcześniejszych i najbardziej skutecznych technik hodowli in vitro do regeneracji niedojrzałych zarodków16,20. Ratowanie zarodków polega na hodowli in vitro słabo rozwiniętych/niedojrzałych zarodków, a następnie przeniesieniu do sterylnej pożywki w celu ułatwienia odzyskania sadzonek i ostatecznie dojrzałych roślin21. Chociaż ratowanie zarodków jest powszechnie stosowane w hodowli kabaczków, brakuje szczegółowego opisu odpowiedniej metodologii, która pozwoliłaby na jej rutynowe stosowanie. Zastosowanie techniki ratowania zarodków w celu pokonania międzygatunkowych barier hybrydyzacyjnych u gatunków Cucurbita zostało zgłoszone już w 1954 roku22. Jednak sukces ratowania zarodków we wczesnych badaniach był albo nieopisany, albo bardzo niski. Metwally i in. podali 10% wskaźnik sukcesu (regeneracji do dojrzałych roślin) wśród 100 międzygatunkowych zarodków hybrydowych uratowanych ze skrzyżowania C. pepo i C. martinezii23. Sisko i wsp. podali zmienny wskaźnik powodzenia regeneracji zarodków wśród zarodków uzyskanych z różnych kombinacji krzyżowych: wskaźnik regeneracji mieszańców uzyskanych przez skrzyżowanie C. maxima (Bos. Max) i C. pepo (Gold Rush) wynosił 15,5%, dla C. pepo (cukinia) i C. moschata (Hokaido) wynosił 20%, podczas gdy dla C. pepo (Gold Rush) i C. moschata (Dolga) wynosił 37,5%24. Oprócz genotypu, pożywki i warunki hodowli in vitro są ważnymi czynnikami sukcesu techniki25,26. W obecnym badaniu przetestowano różne kombinacje krzyżowe między C. moschata i C. pepo i opracowano prostą metodologię wykorzystania techniki ratowania zarodków w squasha. Opracowanie prostej i łatwej do odtworzenia techniki ratowania zarodków ułatwi hybrydyzację międzygatunkową i wzmocnienie plazmy zarodkowej w programach hodowli squasha.

<table><tbody><tr><td>ampicylina</td><td>Autoklaw Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Steris</td><td>AMSCO LAB 250</td><td></td></tr><tr><td>równowaga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cefotaksymu</td><td>Sigma Alfrich</td><td>C 7039</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe (1,5 ml)</td><td>Sigma Alfrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>detergent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol, 95%</td><td>Kleszcze Decon Labs</td><td>2805HC</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>guma gellan</td> Komora wzrostu <td>Caisson Laboratories</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>lub podświetlana półka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>okap laminarny / szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>The Baker Company, Inc</td><td>Taśma maskująca Edgegard</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Uline</td><td>S-11735</td><td></td></tr><tr><td>media butelka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Nawóz NPK Skoog Medium</td><td>Research Products International</td><td>M10200</td><td></td></tr><tr><td>(20-20-20)</td><td>BWI Companies, Inc</td><td>&nbsp; Nawóz PR200</td><td></td></tr><tr><td>Osmocote Plus</td><td>BWI Companie,s Inc</td><td>OS90590</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma Alfrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (60 x 15 mm)</td><td>USA Scientific, Inc</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>doniczki</td><td>BWI Companies, Inc</td><td>NP4000BXL</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe pojemniki na żywność, ponownie wykorzystane</td><td>Oscar Mayer</td><td>4470003330</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe zawieszki</td><td>Amazon</td><td>B07QTZRY6T</td><td></td></tr><tr><td>mieszanka doniczkowa</td><td>Jolly Gardener</td><td>Pro-Line C/B</td><td></td></tr><tr><td>tace startowe do sadzonek</td><td>BWI Companies Inc</td><td>GPPF128S4</td><td></td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy (0,22 um )</td>Obsługa kraty <td>ExtraGene</td><td>B25CA022-S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Home Depot</td><td>&nbsp; 2A060006</td><td></td></tr><tr><td>łaźnia</td><td></td><td></td><td></td> wodna</tr></tbody></table>

protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu

Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash

Hybrydyzacja międzygatunkowa w uprawach Cucurbita (kabaczek) jest pożądana dla poszerzenia zmienności genetycznej i introgresji użytecznych alleli. Niedojrzałe zarodki powstałe z tych szerokich krzyżówek muszą zostać zregenerowane przy użyciu odpowiednich technik ratowania zarodków. Chociaż technika ta jest dobrze znana dla wielu upraw, brakuje szczegółowego opisu odpowiedniej metodologii uprawy dyni, która pozwoliłaby na jej rutynowe stosowanie. W tym miejscu opisujemy protokół ratowania zarodka przydatny do międzygatunkowej hybrydyzacji C. pepo i C. moschata. Aby zidentyfikować kombinacje zdolne do ratowania zarodków, przeprowadzono 24 krzyżówki międzygatunkowe. Zestaw owoców uzyskano z dwudziestu dwóch krzyżówek, co wskazuje na 92% wskaźnik sukcesu. Jednak większość uzyskanych owoców była partenokarpiczne, z nasionami pozbawionymi zarodków (pustych nasion). Tylko jedna kombinacja krzyżowa zawierała niedojrzałe zarodki, które można było zregenerować przy użyciu podstawowych pożywek dla roślin. Z międzygatunkowego owocu F1 uratowano łącznie 10 zarodków, a wskaźnik powodzenia ratowania zarodka wyniósł 80%. Opracowany tutaj protokół ratowania zarodków będzie przydatny do hybrydyzacji międzygatunkowej w programach hodowli squasha.

Zawiązanie owoców i żywotność nasion 
Przeprowadzono wstępny test w celu określenia zawiązania owoców oraz żywotności nasion w różnych kombinacjach krzyżowania. Wybrano łącznie 15 genotypów dyni, w tym cztery C. pepo i 11 C. moschata (Tabela 1). Z 24 podjętych prób krzyżówek międzygatunkowych zawiązanie owoców uzyskano w 22 przypadkach (Tabela 2), co stanowi ogólny sukces zawiązywania owoców na poziomie &gt;92%. Nie uzyskano dojrzałych owoców w krzyż...

Artykuł opisuje protokół ratowania zarodków do regeneracji niedojrzałych zarodków pochodzących z międzygatunkowej hybrydyzacji Cucurbita pepo i Cucurbita moschata. Protokół może być łatwo zduplikowany i będzie ważnym zasobem dla programów hodowli squasha.

Protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu

Interspecific hybridization in Cucurbita crops (squash) is desirable for widening genetic variation and for the introgression of useful alleles. Immature ...

Protokół ratowania zarodków jest obowiązkowy w przypadku regeneracji niedojrzałych zarodków pochodzących z krzyżówek międzygatunkowych między różnymi gatunkami Cucurbita. Najczęściej stosuje się go do krzyżówek Cucurbita moschata i Cucurbita pepo. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota.W protokole stosuje się wyłącznie pożywki dla stwardnienia rozsianego z antybiotykami. Dzięki temu może być łatwo odtworzony przez dowolne laboratorium. Możliwe byłoby zmodyfikowanie tej techniki w celu zbadania różnych barier dla hybrydyzacji międzygatunkowej lub międzyrodzajowej.Zwracanie uwagi na szczegóły na każdym kroku będzie pomocne w osiągnięciu pomyślnego wyniku. Rozpocznij od posadzenia roślin Cucurbita, wypełniając 50 początkowych mieszkań o wymiarach 25 na 50 centymetrów za pomocą podłoża doniczkowego uzupełnionego kompletnym nawozem azotowym, fosforowym i potasowym, zawierającym 1,38 grama na kilogram azotu, fosforu i potasu każdy. Następnie wysiewaj nasiona na głębokość równą ich długości i przykrywaj je podłożem doniczkowym.Podlewaj mieszkania bez tworzenia stojącej wody i utrzymuj media wilgotne, podlewając je raz dziennie. Pod koniec drugiej fazy prawdziwych liści przesadź sadzonki do doniczek o średnicy 30 centymetrów, uzupełnionych trzema łyżkami pełnowartościowego nawozu na doniczkę. Po każdych siedmiu dniach nawozić każdą doniczkę 500 mililitrami płynnego nawozu zawierającego 20, 20, 20 azotu, fosforu i potasu w jednym gramie dodanym do galonu wody.Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturach od 22 do 28 stopni Celsjusza w naturalnym reżimie oświetleniowym. W przypadku genotypów winorośli należy zapewnić kratę nośną w szklarni. Przeprowadź kontrolowaną hybrydyzację lub zapylenie, gdy tylko rośliny zaczną kwitnąć po sześciu do ośmiu tygodniach od wysiewu.Sprawdź nieotwarte kwiaty z żółtym odcieniem na płatkach i zidentyfikuj kwiaty męskie i żeńskie odmian Cucurbita pepo i Cucurbita moschata. Aby zapobiec przypadkowemu zapyleniu przez owady, delikatnie przyklej zamknięty kwiat u góry za pomocą taśmy maskującej. Następnego ranka przeprowadź zapylanie przed godziną 10:00, delikatnie usuwając zaklejoną taśmą górną część kwiatu męskiego i żeńskiego.Oddzielenie płatków od kwiatu męskiego i przeniesienie pyłków poprzez delikatne pocieranie pylnika o znamię kwiatu żeńskiego. Po zapyleniu natychmiast zamknij zapylony kwiat żeński taśmą maskującą i użyj znacznika, aby zapisać datę zapylenia i wskazać rodziców ze strony ojca i matki użytych w krzyżówce. Udany krzyż wskazany przez rozszerzony jajnik utworzy mały owoc w ciągu jednego tygodnia.Owoce zbierać po 45 do 55 dniach zapylenia. Przygotuj wywar z cefotaksymu. Przefiltruj go przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona.I zrób 0,5 mililitra porcji po 250 miligramów na mililitr cefotaksymu przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Podobnie przygotuj bulion ampicyliny. Przefiltruj je przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona i przygotuj jedną mililitrową porcję 100 miligramów na mililitr ampicyliny przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Przygotuj pożywkę Murashige i Skoog lub MS, rozpuszczając 2,45 grama pożywki w 500 mililitrach wody destylowanej w litrowej butelce. Dodaj 1,5 grama gumy gellan do podłoża MS i sterylizuj w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut. Ostudzić podłoże, umieszczając butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza.Rozmrozić zapasy antybiotyków w komorze z przepływem laminarnym. Przenieś butelkę z pożywką do okapu z przepływem laminarnym i dodaj 0,6 mililitra bulionu cefotaksymu i 0,25 mililitra bulionu ampicyliny do pożywki przy odpowiednim wymieszaniu. Wlej około siedmiu mililitrów pożywki do sterylnej szalki Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów.Pozwól pożywce zestalić się na szalkach Petriego przez około 15 do 20 minut. Zamknij szalki Petriego folią uszczelniającą i umieść je w pudełku do przechowywania w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia. Zbierz owoc dyni, odcinając go od głównej winorośli i zdezynfekuj owoc, myjąc jego powierzchnię w zlewie laboratoryjnym za pomocą płynnego detergentu, takiego jak 0,3% chlorooksylenolu.Opłucz owoce dużą ilością wody z kranu i osusz je czystymi ręcznikami papierowymi przed przeniesieniem owoców do szafki z przepływem powietrza z laminatu. Wysterylizuj powierzchnię owoców wewnątrz szafki, rozpylając 70% etanolu. Przetnij owoce sterylnym nożem i usuń nasiona.Za pomocą sterylnych kleszczy lub rąk w sterylnych rękawiczkach należy aseptycznie otworzyć okrywę nasienną i odsłonić niedojrzałe zarodki przed umieszczeniem ich na szalce Petriego zawierającej pożywkę MS uzupełnioną antybiotykami. Uszczelnij płytki Petriego folią do owijania i umieść je w komorze wzrostowej o temperaturze 25 stopni Celsjusza, 16-godzinnym okresie fotografowania i wilgotności względnej 70%. W przypadku zanieczyszczenia należy natychmiast przeprowadzić subhodowlę nieskażonych zarodków na nową płytkę z tym samym podłożem.Gdy korzenie rozwiną się po 10 do 14 dniach, a liścienie rozwiną się po 15 do 21 dniach, wyjmij sadzonki z szalek Petriego i delikatnie zmyj podłoże znajdujące się wokół korzeni za pomocą wody z kranu. Umieść oczyszczone sadzonki w plastikowym pojemniku o wymiarach 14 na 9 na 4 centymetry i przykryj korzenie mokrymi ręcznikami papierowymi. Przykryj pojemnik i w razie potrzeby ponownie zwilż ręczniki papierowe.Trzymaj plastikowe pojemniki w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza i w 16-godzinnym okresie zdjęciowym, aby zaaklimatyzować sadzonki, utrzymując jednocześnie wilgotny stan ręczników papierowych. Po 7 do 10 dniach aklimatyzacji przenieś sadzonki o długości od trzech do czterech centymetrów do 50 mieszkań komórkowych zawierających komercyjną mieszankę doniczkową wzbogaconą nawozem i przenieś je do szklarni. Unikaj nadmiernego podlewania, aby zapobiec gniciu i w razie potrzeby dodaj około 10 do 20 mililitrów wody na komórkę.W przedostatniej trzeciej fazie prawdziwych liści przesadzaj sadzonki do doniczek o średnicy 25 centymetrów wypełnionych podłożem doniczkowym wzbogaconym nawozem i przeprowadź kontrolowaną hybrydyzację, gdy rośliny zaczną kwitnąć. Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze od 22 do 28 stopni Celsjusza w naturalnym reżimie oświetleniowym. I oceń rośliny pod kątem cech owoców i nasion.Do hybrydyzacji międzygatunkowej wybrano cztery Cucurbita pepo i 11 Cucurbita moschata. Spośród 24 prób krzyżowania międzygatunkowego, zestaw owoców uzyskano dla 22 krzyżówek, co stanowi ponad 92% sukces w zestawie owoców. Krzyżówki Cucurbita moschata i Cucurbita pepo obejmujące genotypy O i M oraz genotypy E i J nie dały dojrzałych owoców.Natomiast krzyżówka Cucurbita moschata i Cucurbita pepo o genotypach F i J dała sześć owoców. Liczba kwiatów zapylonych w różnych kombinacjach krzyżowych wahała się od 1 do 11. A wskaźnik sukcesu zapylania wahał się od 0% do 100%Spośród 44 owoców wyprodukowanych ze wszystkich kombinacji krzyżówek, tylko jeden owoc ze skrzyżowania Cucurbita moschata i Cucurbita pepo, genotypy C i J wytworzyły niedojrzałe zarodki, które można było uratować.W celu rozwoju tych słabo rozwiniętych zarodków hodowano je przy użyciu pożywki ratunkowej dla zarodków, co dało 80% wskaźnik sukcesu w ratowaniu zarodków. Dwie najważniejsze procedury to identyfikacja kompatybilnych krzyżówek między dwoma gatunkami, a mianowicie Cucurbita moschata i Cucurbita pepo, oraz udana regeneracja zarodków. Ponieważ technika ratowania zarodków jest prosta i łatwa do odtworzenia, hodowcy dyni na całym świecie mogą używać tej techniki do ratowania niedojrzałych zarodków pochodzących z krzyżówek międzygatunkowych między różnymi gatunkami Cucurbita.

embryo-rescue-protocol-for-interspecific-hybridization-in-squash

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Celem jest zilustrowanie, że modelowa roślina strączkowa Medicago truncatula może być łatwo wykorzystana do zbadania regulacji wczesnej embriogenezy roślin, aby uzupełnić model rzodkiewnika nie-strączkowego. Morfologia strąków jest powiązana z etapami embriogenezy zygotycznej, a także opracowano protokół pobierania zarodków za pomocą hodowli tkankowej.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Tym celem tego protokołu jest produkcja chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi pochodzącymi z tkanki dawcy zmutowanej, Cas9, przy użyciu technik przeszczepu tkanek embrionalnych.

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Poznaj protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu z wykorzystaniem Cucurbita pepo i Cucurbita moschata. Ta prosta metoda umożliwia regenerację niedojrzałych zarodków i poprawę różnorodności genetycznej w programach hodowlanych.

Protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu

Przeglądaj więcej filmów