Protokół ratowania zarodka dla hybrydyzacji międzygatunkowej w squashu

Protokół ratowania zarodków jest obowiązkowy w przypadku regeneracji niedojrzałych zarodków pochodzących z krzyżówek międzygatunkowych między różnymi gatunkami Cucurbita. Najczęściej stosuje się go do krzyżówek Cucurbita moschata i Cucurbita pepo. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota.

W protokole stosuje się wyłącznie pożywki dla stwardnienia rozsianego z antybiotykami. Dzięki temu może być łatwo odtworzony przez dowolne laboratorium. Możliwe byłoby zmodyfikowanie tej techniki w celu zbadania różnych barier dla hybrydyzacji międzygatunkowej lub międzyrodzajowej.

Zwracanie uwagi na szczegóły na każdym kroku będzie pomocne w osiągnięciu pomyślnego wyniku. Rozpocznij od posadzenia roślin Cucurbita, wypełniając 50 początkowych mieszkań o wymiarach 25 na 50 centymetrów za pomocą podłoża doniczkowego uzupełnionego kompletnym nawozem azotowym, fosforowym i potasowym, zawierającym 1,38 grama na kilogram azotu, fosforu i potasu każdy. Następnie wysiewaj nasiona na głębokość równą ich długości i przykrywaj je podłożem doniczkowym.

Podlewaj mieszkania bez tworzenia stojącej wody i utrzymuj media wilgotne, podlewając je raz dziennie. Pod koniec drugiej fazy prawdziwych liści przesadź sadzonki do doniczek o średnicy 30 centymetrów, uzupełnionych trzema łyżkami pełnowartościowego nawozu na doniczkę. Po każdych siedmiu dniach nawozić każdą doniczkę 500 mililitrami płynnego nawozu zawierającego 20, 20, 20 azotu, fosforu i potasu w jednym gramie dodanym do galonu wody.

Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturach od 22 do 28 stopni Celsjusza w naturalnym reżimie oświetleniowym. W przypadku genotypów winorośli należy zapewnić kratę nośną w szklarni. Przeprowadź kontrolowaną hybrydyzację lub zapylenie, gdy tylko rośliny zaczną kwitnąć po sześciu do ośmiu tygodniach od wysiewu.

Sprawdź nieotwarte kwiaty z żółtym odcieniem na płatkach i zidentyfikuj kwiaty męskie i żeńskie odmian Cucurbita pepo i Cucurbita moschata. Aby zapobiec przypadkowemu zapyleniu przez owady, delikatnie przyklej zamknięty kwiat u góry za pomocą taśmy maskującej. Następnego ranka przeprowadź zapylanie przed godziną 10:00, delikatnie usuwając zaklejoną taśmą górną część kwiatu męskiego i żeńskiego.

Oddzielenie płatków od kwiatu męskiego i przeniesienie pyłków poprzez delikatne pocieranie pylnika o znamię kwiatu żeńskiego. Po zapyleniu natychmiast zamknij zapylony kwiat żeński taśmą maskującą i użyj znacznika, aby zapisać datę zapylenia i wskazać rodziców ze strony ojca i matki użytych w krzyżówce. Udany krzyż wskazany przez rozszerzony jajnik utworzy mały owoc w ciągu jednego tygodnia.

Owoce zbierać po 45 do 55 dniach zapylenia. Przygotuj wywar z cefotaksymu. Przefiltruj go przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona.

I zrób 0,5 mililitra porcji po 250 miligramów na mililitr cefotaksymu przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Podobnie przygotuj bulion ampicyliny. Przefiltruj je przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona i przygotuj jedną mililitrową porcję 100 miligramów na mililitr ampicyliny przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Przygotuj pożywkę Murashige i Skoog lub MS, rozpuszczając 2,45 grama pożywki w 500 mililitrach wody destylowanej w litrowej butelce. Dodaj 1,5 grama gumy gellan do podłoża MS i sterylizuj w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut. Ostudzić podłoże, umieszczając butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Rozmrozić zapasy antybiotyków w komorze z przepływem laminarnym. Przenieś butelkę z pożywką do okapu z przepływem laminarnym i dodaj 0,6 mililitra bulionu cefotaksymu i 0,25 mililitra bulionu ampicyliny do pożywki przy odpowiednim wymieszaniu. Wlej około siedmiu mililitrów pożywki do sterylnej szalki Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów.

Pozwól pożywce zestalić się na szalkach Petriego przez około 15 do 20 minut. Zamknij szalki Petriego folią uszczelniającą i umieść je w pudełku do przechowywania w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia. Zbierz owoc dyni, odcinając go od głównej winorośli i zdezynfekuj owoc, myjąc jego powierzchnię w zlewie laboratoryjnym za pomocą płynnego detergentu, takiego jak 0,3% chlorooksylenolu.

Opłucz owoce dużą ilością wody z kranu i osusz je czystymi ręcznikami papierowymi przed przeniesieniem owoców do szafki z przepływem powietrza z laminatu. Wysterylizuj powierzchnię owoców wewnątrz szafki, rozpylając 70% etanolu. Przetnij owoce sterylnym nożem i usuń nasiona.

Za pomocą sterylnych kleszczy lub rąk w sterylnych rękawiczkach należy aseptycznie otworzyć okrywę nasienną i odsłonić niedojrzałe zarodki przed umieszczeniem ich na szalce Petriego zawierającej pożywkę MS uzupełnioną antybiotykami. Uszczelnij płytki Petriego folią do owijania i umieść je w komorze wzrostowej o temperaturze 25 stopni Celsjusza, 16-godzinnym okresie fotografowania i wilgotności względnej 70%. W przypadku zanieczyszczenia należy natychmiast przeprowadzić subhodowlę nieskażonych zarodków na nową płytkę z tym samym podłożem.

Gdy korzenie rozwiną się po 10 do 14 dniach, a liścienie rozwiną się po 15 do 21 dniach, wyjmij sadzonki z szalek Petriego i delikatnie zmyj podłoże znajdujące się wokół korzeni za pomocą wody z kranu. Umieść oczyszczone sadzonki w plastikowym pojemniku o wymiarach 14 na 9 na 4 centymetry i przykryj korzenie mokrymi ręcznikami papierowymi. Przykryj pojemnik i w razie potrzeby ponownie zwilż ręczniki papierowe.

Trzymaj plastikowe pojemniki w temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza i w 16-godzinnym okresie zdjęciowym, aby zaaklimatyzować sadzonki, utrzymując jednocześnie wilgotny stan ręczników papierowych. Po 7 do 10 dniach aklimatyzacji przenieś sadzonki o długości od trzech do czterech centymetrów do 50 mieszkań komórkowych zawierających komercyjną mieszankę doniczkową wzbogaconą nawozem i przenieś je do szklarni. Unikaj nadmiernego podlewania, aby zapobiec gniciu i w razie potrzeby dodaj około 10 do 20 mililitrów wody na komórkę.

W przedostatniej trzeciej fazie prawdziwych liści przesadzaj sadzonki do doniczek o średnicy 25 centymetrów wypełnionych podłożem doniczkowym wzbogaconym nawozem i przeprowadź kontrolowaną hybrydyzację, gdy rośliny zaczną kwitnąć. Utrzymuj rośliny w szklarni w temperaturze od 22 do 28 stopni Celsjusza w naturalnym reżimie oświetleniowym. I oceń rośliny pod kątem cech owoców i nasion.

Do hybrydyzacji międzygatunkowej wybrano cztery Cucurbita pepo i 11 Cucurbita moschata. Spośród 24 prób krzyżowania międzygatunkowego, zestaw owoców uzyskano dla 22 krzyżówek, co stanowi ponad 92% sukces w zestawie owoców. Krzyżówki Cucurbita moschata i Cucurbita pepo obejmujące genotypy O i M oraz genotypy E i J nie dały dojrzałych owoców.

Natomiast krzyżówka Cucurbita moschata i Cucurbita pepo o genotypach F i J dała sześć owoców. Liczba kwiatów zapylonych w różnych kombinacjach krzyżowych wahała się od 1 do 11. A wskaźnik sukcesu zapylania wahał się od 0% do 100%Spośród 44 owoców wyprodukowanych ze wszystkich kombinacji krzyżówek, tylko jeden owoc ze skrzyżowania Cucurbita moschata i Cucurbita pepo, genotypy C i J wytworzyły niedojrzałe zarodki, które można było uratować.

W celu rozwoju tych słabo rozwiniętych zarodków hodowano je przy użyciu pożywki ratunkowej dla zarodków, co dało 80% wskaźnik sukcesu w ratowaniu zarodków. Dwie najważniejsze procedury to identyfikacja kompatybilnych krzyżówek między dwoma gatunkami, a mianowicie Cucurbita moschata i Cucurbita pepo, oraz udana regeneracja zarodków. Ponieważ technika ratowania zarodków jest prosta i łatwa do odtworzenia, hodowcy dyni na całym świecie mogą używać tej techniki do ratowania niedojrzałych zarodków pochodzących z krzyżówek międzygatunkowych między różnymi gatunkami Cucurbita.