Name: Ekspresja transgenu wirusa w sercach gryzoni i ocena ryzyka arytmii serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Poznaj minimalnie inwazyjną technikę ekspresji transgenu w sercach gryzoni przy użyciu wstrzyknięcia wirusowego pod kontrolą ultrasonograficzną. Metoda umożliwia ocenę skłonności do arytmii komorowych w izolowanych sercach perfundowanych układem Langendorffa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Granty Projektowe Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) (PJT-148918 i PJT-180533, dla WL), CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, dla WL), Stypendium McDonalda dla Fundacji Serca i Udaru Mózgu (HSFC) oraz Nagrodę dla Nowych Badaczy (S-17-LI-0866, do WL), Stypendia Studenckie (dla JW i YX) oraz Stypendium Podoktorskie (dla AL) z University of Ottawa Cardiac Endowment Funds w Instytucie Serca. Autorzy dziękują Panu Richardowi Seymourowi za wsparcie techniczne. Rysunek 2 został utworzony z Biorender.com z zatwierdzonymi licencjami.

Wszystkie opisane metody i procedury zostały zatwierdzone przez komisję ds. oceny etycznej badań na zwierzętach na Uniwersytecie w Ottawie oraz komisję ds. oceny bezpieczeństwa biologicznego w Instytucie Serca Uniwersytetu w Ottawie. Opracowane protokoły bezpieczeństwa zakładają, że wszystkie procedury dotyczące rekombinowanego adenowirusa lub wirusa związanego z adenowirusem (AAV) zostały przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego II stopnia. Wszystkie przedmioty, które miały kontakt z wirusem, zostały dokładnie odkażone po eksperymencie. Do niniejszego badania wykorzystano myszy Ctnnb1flox/flox i αMHC-MerCreMer (8-12 tygodni, obu płci) oraz szczury Sprague-Dawley (200-250 g, samce). Zwierzęta zostały pozyskane ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów). Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały wykonane przez personel, który został przeszkolony i zatwierdzony przez instytucjonalne komitety regulacyjne. Podczas wszystkich zabiegów stosowano odpowiednie środki ochrony osobistej.
1. Ekspresja transgenu wirusa w tkankach komorowych gryzoni
UWAGA: Przechowuj rekombinowany adenowirus lub AAV, który wyraża gen docelowy i odpowiadający mu wirus kontrolny, taki jak Ad-GFP (miano 1 x10 10 PFU/mL) lub AAV9-GFP (miano 1 x 1013 GC/mL) (patrz Tabela Materiałów), w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
<ol>
	<li>W dniu wstrzyknięcia wirusa rozmrozić wirusa na lodzie. Odessać wirusa wykazującego ekspresję genu docelowego i wirusa kontrolnego do dwóch oddzielnych strzykawek (objętość = 50 μl) za pomocą igieł 30 G 1/2 i przechowywać na lodzie do momentu użycia. 
	UWAGA: Wszelkie pęcherzyki powietrza w strzykawce i igle należy ostrożnie usunąć.</li>
	<li>Buprenorfinę należy podać szczurom lub myszom (0,05 mg/kg dla szczurów, 0,1 mg/kg dla myszy, podskórnie), 1 godzinę później wywołać znieczulenie za pomocą 3% izofluranu i utrzymać izofluran na poziomie 2% (w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 0,5-1,0 l/min) do następnego zabiegu.</li>
	<li>Delikatnie uszczypnij ciało zwierzęcia (np. ogon) parą kleszczy, a jeśli zwierzę nie reaguje na szczypanie żadnymi ruchami ciała, potwierdza się prawidłowe znieczulenie.</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą elektrycznej poduszki grzewczej. Ogol włosy w okolicy klatki piersiowej za pomocą maszynki do strzyżenia włosów. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas korzystania z elektrycznej poduszki grzewczej ze względu na potencjalny nierównomierny rozkład ciepła.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Utrzymywać zwierzę w pozycji leżącej na plecach i używać systemu obrazowania przedklinicznego (patrz tabela materiałów) do obrazowania ultrasonograficznego serca zwierzęcia w orientacji krótkoosiowej. 
	UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego II poziomu, która zapewnia sterylne środowisko. Stosowane są standardowe procedury bezpieczeństwa, w tym te dotyczące bezpiecznego obchodzenia się z igłą.</li>
	<li>Wysterylizuj lewą dolną część klatki piersiowej zwierzęcia za pomocą naprzemiennych rund peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny i alkoholu trzy razy okrężnymi ruchami.</li>
	<li>Pod nadzorem obrazowania ultrasonograficznego wprowadzić igłę 30 G 1/2 strzykawki zawierającej wirusa, jak przygotowano w kroku 1.1, do klatki piersiowej zwierzęcia przez lewą dolną część klatki piersiowej</li>.
	<li>Zbliżyć końcówkę igły do wolnej ściany przedniej komory lewej i powoli wstrzyknąć 10-15 μl wirusa. Pomyślne wstrzyknięcie na obrazach ultrasonograficznych należy sprawdzić za pomocą zwiększonej jasności w pobliżu końcówki igły. 
	UWAGA: Ilość wirusa wstrzykiwanego w każdym miejscu nie przekracza 15 μl, aby zapobiec fizycznemu uszkodzeniu tkanek mięśnia sercowego.</li>
	<li>Wyjąć igłę z serca i wprowadzić ją w inne obszary lewej komory w celu drugiego i trzeciego wstrzyknięcia tej samej ilości wirusa. 
	UWAGA: Całkowita liczba miejsc wstrzyknięcia jest określona na podstawie projektu doświadczalnego. Jeśli wymagana jest ogniskowa ekspresja transgenu, potrzebne jest tylko jedno wstrzyknięcie; Jeśli wymagana jest bardziej dyfuzyjna ekspresja transgenu, zwykle potrzebnych jest wiele miejsc wstrzyknięcia (od trzech do pięciu).</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzykiwań należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce.</li>
	<li>Uważnie obserwować zwierzę, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku i powrócić do pomieszczenia socjalnego.</li>
	<li>Chlorowodorek buprenorfiny należy podawać zwierzęciu (0,1 mg/kg mc. dwa razy dziennie u myszy, 0,05 mg/kg mc. dwa razy dziennie u szczurów, podskórnie) przez kolejne 2 dni. Zwróć zwierzęta do wiwarium i codziennie monitoruj pod kątem wszelkich nietypowych objawów bólu lub niepokoju, a jeśli zostaną znalezione, traktuj zwierzęta zgodnie z protokołami Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami.</li>
</ol>
2. Ocena podatności na arytmię serca
UWAGA: Po 4-6 dniach od wstrzyknięcia adenowirusa i 1-2 tygodnie po wstrzyknięciu AAV, oceń podatność serc zwierząt na zaburzenia rytmu serca zgodnie z krokami 2.1.-2.2.
<ol>
	<li>Wykonaj perfuzję Langendorffa serca szczura lub myszy.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór Tyrode'a, dodając do 1 l wody następujące składniki: NaCl, 7,9 g (końcowy = 135 mM); KCl, 0,37 g (5,0 mM); CaCl2, 0,27 g (1,8 mM); MgCl2, 0,24 g (1,2 mM); HEPES, 2,38 g (10 mM); i glukozy 1,8 g (10 mM). Doprowadzić pH do 7,40 za pomocą NaOH (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i pęcherzykować 100%O2 w sposób ciągły podczas etapów 2.1.6.-2.2.8.</li>
		<li>Podaj heparynę szczurowi lub myszy (500 j./kg, wstrzyknięcie dootrzewnowe), a 10 minut później znieczulij zwierzę 3% izofluranem. Zapewnij odpowiednie znieczulenie delikatnym uszczypnięciem ciała.</li>
		<li>Za pomocą skalpela wykonaj pionowe nacięcie o długości 1-1,5 cm w linii środkowej obojczyka do torakotomii lewej strony i odsłoń serce.</li>
		<li>Zbierz serce, przecinając je nożyczkami na poziomie łuku aorty i natychmiast umieść serce w lodowatym roztworze Tyrode. 
		UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić serca podczas pobierania serca.</li>
		<li>Kankaniulować aortę serca igłą (18 G dla szczurów; 23 G dla myszy) podłączoną do zmodyfikowanego systemu perfuzyjnego Langendorffa (patrz Tabela materiałów) w trybie stałego natężenia przepływu. Dostosuj natężenie przepływu, aby utrzymać ciśnienie perfuzji na poziomie 70-80 mmHg. 
		UWAGA: Wszelkie pęcherzyki w igle perfuzyjnej muszą zostać usunięte przed kaniulacją aorty. Użycie mikroskopu preparacyjnego ułatwia kaniulację.</li>
		<li>Umieść kaniulowane serce w pokrytym elastomerem silikonowym naczyniu 9, 10 cm z lewą komorą skierowaną do góry i przeprowadź perfuzję serca9,12 zO-2-pęcherzykowym roztworem Tyrode w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Sprawdź prawidłową kaniulację aorty na początku perfuzji, obserwując wypłukiwanie krwi z serca podczas pierwszych dwóch do trzech uderzeń serca i zmianę koloru serca z czerwonego na blady.</li>
		<li>Umieść elektrody systemu EKG dla małych zwierząt (patrz tabela materiałów) wokół serca, wkładając je w silikonową powłokę elastomerową w naczyniu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Rejestruj EKG za pomocą kompatybilnego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj stymulację receptorów adrenergicznych i zaprogramowaną stymulację elektryczną w celu wywołania tachyarytmii komorowych.
	<ol>
		<li>Po udanej kaniulacji aorty kontynuuj perfuzję serca roztworem Tyrode przez 20 minut, aby ustabilizować przygotowanie serca.</li>
		<li>Dodać 1 μM izoproterenol (patrz tabela materiałów) do roztworu Tyrode stosowanego do perfuzji serca w krokach 2.2.3.-2.2.8.</li>
		<li>Po 10 minutach perfuzji izoproterenolu stymuluj serce na wierzchołku za pomocą dwóch platynowych elektrod podłączonych do stymulatora elektrycznego (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Zacznij od procedury stymulacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), która obejmuje 10 następujących po sobie bodźców (S1, 5 V, interwały 100 ms), po których następuje dodatkowy bodziec (S2) z początkowym odstępem 80 ms. Wielokrotnie zmniejszaj interwał S2 o 2 ms za każdym razem, aż bicie serca nie będzie już możliwe do uchwycenia (tj. osiągnięcie efektywnego okresu refrakcji serca, ERP)13.</li>
		<li>Monitoruj wszelkie indukowane tachyarytmie komorowe (w tym częstoskurcz komorowy i migotanie) za pomocą EKG.</li>
		<li>Jeśli powyższa procedura nie wywoła żadnych arytmii, dodaj kolejny dodatkowy bodziec (S3) po S2 z tymi samymi odstępami początkowymi (80 ms) i zmniejszającymi (o 2 ms), aż do osiągnięcia ERP.</li>
		<li>Jeśli tachyarytmie komorowe nadal nie są indukowane, dodaj jeszcze jeden dodatkowy bodziec (S4) po S3 z tymi samymi odstępami początkowymi i malejącymi, aż do osiągnięcia ERP.</li>
		<li>Jeśli tachyarytmie komorowe nadal nie są indukowane (zgodnie z oczekiwaniami w grupie kontrolnej zdrowych serc), należy przerwać protokół stymulacji elektrycznej i uznać serce za nieindukowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-specific+deletion+of+%CE%B2-catenin+protects+mouse+hearts+from+ventricular+arrhythmias+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction.</a> Scientific Reports. 11 (1), 17722(2021).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+exercise+training+on+the+FNDC5%2FBDNF+pathway+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats.</a> Physiological Reports. 7 (24), 14323(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+Nod1%2FRIP2+signaling+is+essential+for+cardiac+hypertrophy+but+requires+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+for+signal+transductions+and+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance.</a> Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).</li>
<li>Karunakaran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+expression+associates+with+inflammation+in+early+atherosclerosis+in+humans+and+can+be+therapeutically+silenced+to+reduce+NF-%CE%BAB+activation+and+atherogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice.</a> Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).</li>
<li>Gharibeh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+is+a+regulator+of+sinus+node+development+and+heart+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118(2021).</li>
<li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+suppression+of+Scn5a+gene+expression+mediates+cardiac+Na%2B+channel+inhibition+by+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling.</a> Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).</li>
<li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphoinositide+3-kinase+%7Balpha%7D%2C+protein+kinase+C%2C+and+L-type+Ca2%2B+channels+in+mediating+the+complex+actions+of+angiotensin+II+on+mouse+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility.</a> Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).</li>
<li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).</li>
<li>Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+complete+atrioventricular+block+recapitulates+clinical+indices+of+bradycardia+and+provides+a+platform+to+test+disease-modifying+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6930(2019).</li>
<li>Cingolani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+to+inhibit+the+calcium+channel+beta+subunit%3A+Physiological+consequences+and+pathophysiological+effects+in+models+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).</li>
<li>Ionta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHOX2+overexpression+favors+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+pacemaker+cells%2C+improving+biological+pacing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).</li>
<li>Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ventricular+refractoriness.+Effects+of+cycle+length%2C+pacing+site+and+atropine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine.</a> Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).</li>
<li>Segel, L. D., Ensunsa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+improves+stability+and+longevity+of+perfluorochemical-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts.</a> The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).</li>
<li>Hong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+as+a+potential+treatment+in+ischemic+stroke+concomitant+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121(2019).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-NLRP3+inflammasome+activation+exacerbates+cardiac+dysfunction+after+ischemic+stroke+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes.</a> Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).</li>
<li>Lin, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral-cardiac+syndrome+and+diabetes%3A+Cardiac+damage+after+ischemic+stroke+in+diabetic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state.</a> Frontiers in Immunology. 12, 737170(2021).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>Allison, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+nanoengineered+biomimetic+hybrid+fibers+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+human+cardiac+myocytes+for+medical+research%3A+Promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges.</a> Stem Cells International. 2017, 4528941(2017).</li>
<li>Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-based+treatment+of+acquired+heart+block%3A+The+battle+for+tomorrow+has+begun%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331(2017).</li>
<li>McLaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+human+recombinant+collagen+matrices+limit+adverse+remodeling+and+improve+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 4866(2019).</li>
<li>Villanueva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxalase+1+prevents+chronic+hyperglycemia+induced+heart-explant+derived+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction.</a> Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).</li>
<li>Kanda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+paracrine+repair+of+injured+myocardium+using+microfluidic-based+cocooning+of+heart+explant-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells.</a> Biomaterials. 247, 120010(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dla powodzenia izolowanego preparatu serca z perfuzją Langendorffa ma kluczowe znaczenie. Po pierwsze, ważne jest, aby uniknąć jakichkolwiek uszkodzeń serca podczas pobierania serca (np. z powodu przypadkowego ściśnięcia lub skaleczenia nożyczkami). Po drugie, bardzo ważne jest, aby jak najszybciej umieścić pobrane serce w zimnym roztworze Tyrode, ponieważ zatrzyma to bicie serca i zmniejszy zużycie tlenu przez serce. Po trzecie, wkłucie igły do aorty nie może być zbyt głębokie - idealnie, końcówka igły znajduje się blis...

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na całym świecie, odbierając życie 18 milionom ludzi tylko w 2017 roku1. Gryzonie, zwłaszcza myszy i szczury, stały się najczęściej używanym modelem w badaniach sercowo-naczyniowych ze względu na łatwość obsługi i dostępność różnych transgenicznych linii nadekspresji lub nokautu. Modele gryzoni mają fundamentalne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów choroby i identyfikacji potencjalnych nowych celów terapeutycznych w zawale mięśnia sercowego2, nadciśnienie3, niewydolność serca4 i miażdżyca5. Jednak zastosowanie gryzoni w badaniach nad zaburzeniami rytmu serca jest ograniczone przez ich mały rozmiar serca i szybsze tętno w porównaniu z modelami ludzkimi lub dużymi zwierzętami. Dlatego spontaniczne śmiertelne arytmie u myszy lub szczurów po zawale mięśnia sercowego są rzadkie2. Badacze są zmuszeni skupić się na pośrednich zmianach wtórnych, które mogą odzwierciedlać substrat proarytmiczny, taki jak zwłóknienie lub ekspresja genów, bez wykazywania znaczących zmian w obciążeniu arytmią lub tendencjach proarytmicznych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, w niniejszym protokole opisano metodę, która pozwala na wiarygodną ocenę podatności serc myszy i szczurów na tachyarytmie komorowe po modyfikacji genetycznej6,7 lub zawał mięśnia sercowego2. Metoda ta łączy stymulację receptorów adrenergicznych z zaprogramowaną stymulacją elektryczną w celu wywołania tachyarytmii komorowych w izolowanych, perfused8 sercach myszy i szczurów.
Standardowe metody transferu genów wirusa w tkance mięśnia sercowego gryzoni często obejmują ekspozycję serca przez torakotomię9,10,11, która jest procedurą inwazyjną i wiąże się z opóźnionym powrotem do zdrowia zwierząt po zabiegu. W artykule opisano metodę bezpośredniego wstrzykiwania wirusa do mięśnia sercowego pod nadzorem obrazowania ultrasonograficznego w celu wykrycia nadekspresji transgenów. Ta mniej inwazyjna procedura pozwala na szybszy powrót zwierząt do zdrowia po wstrzyknięciu wirusa i mniejsze uszkodzenia tkanek w porównaniu z torakotomią, zmniejsza ból pooperacyjny i stan zapalny u zwierzęcia, a tym samym umożliwia lepszą ocenę wpływu genów transgenicznych na czynność serca.

<table><tbody><tr><td>30 G 1/2 PrecisionGlide Needle</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>wirus związany z adenowirusem (AAV9-GFP)</td><td>Wektor Biolabs</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>adenowirus (Ad-GFP)</td><td>Wektor Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>adenowirus (Ad-Wnt3a)</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-276318</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego (poziom II)</td><td>Microzone Corporation</td><td>N/A</td><td>Model #: BK-2-4</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Wetergezyjska</td><td>DIN 02342510</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102378</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukoza</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów</td><td>WAHL Clipper Corporation</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20701</td><td>705 LT, objętość 50 &mu; L</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Life</td><td>Marka E12107</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Fresenius Kabi</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Fresenius Kabi Ltd.</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek izoproterenolu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1351005</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8 oprogramowanie</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>Wersja 8.1.5</td><td>do zapisu EKG</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Myszy (Ctnnb1flox/flox)</td><td>Myszy Jackson Labs</td><td>4152</td><td></td></tr><tr><td>(&alpha; MHC-MerCreMer)</td><td>Jackson Labs</td><td>5650</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>do systemu Langendorff</td></tr><tr><td>Przetwornik MS400</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Systane</td><td>DIN 02444062</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Miernik ciśnienia</td><td>NETECH</td><td>DigiMano 1000</td><td>do systemu Langendorff</td></tr><tr><td>Pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-77924-65</td><td>do systemu Langendorff</td></tr><tr><td>Szczur (Sprague-Dawley, mężczyzna)</td><td>Charles River</td><td>400</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-12</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy</td><td>Down Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>do systemu Langendorff</td></tr><tr><td>System EKG dla małych zwierząt</td><td>ADInstruments Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Powerlab 8/35 i Animal Bio Amp</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>VEVO3100 System obrazowania przedklinicznego</td><td>VisualSonic Inc.</td><td>N/a</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja transgenu wirusa w sercach gryzoni i ocena ryzyka arytmii serca

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Choroby serca są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Ze względu na łatwość obsługi i obfitość szczepów transgenicznych, gryzonie stały się niezbędnymi modelami w badaniach sercowo-naczyniowych. Jednak spontaniczne śmiertelne zaburzenia rytmu serca, które często powodują śmiertelność u pacjentów z chorobami serca, są rzadkie w modelach chorób serca u gryzoni. Wynika to przede wszystkim z różnic gatunkowych we właściwościach elektrycznych serca między ludźmi a gryzoniami i stanowi wyzwanie dla badań nad zaburzeniami rytmu serca z udziałem gryzoni. Protokół ten opisuje podejście umożliwiające efektywną ekspresję transgenu w mięśniu sercowym komorowym myszy i szczura za pomocą domięśniowych wstrzyknięć rekombinowanego wirusa (adenowirusa i wirusa związanego z adenografią) pod kontrolą echokardiografii. W pracy przedstawiono również metodę umożliwiającą wiarygodną ocenę podatności serca na arytmie przy użyciu izolowanych, perfundowanych przez Langendorffa serc myszy i szczurów z adrenergiczną i zaprogramowaną stymulacją elektryczną. Techniki te mają kluczowe znaczenie dla badania zaburzeń rytmu serca związanych z niekorzystną przebudową serca po urazach, takich jak zawał mięśnia sercowego.

Podczas perfuzji przeprowadzonej zgodnie z opisanym tutaj protokołem (Rysunek 1), izolowane serce szczura lub myszy bije rytmicznie i stabilnie przez co najmniej 4 h. Jeśli projekt eksperymentu wymaga dłuższego okresu perfuzji serca, pomocne jest dodanie albuminy do roztworu perfuzyjnego w celu zmniejszenia ryzyka wystąpienia obrzęku mięśnia sercowego po długotrwałej perfuzji14. Dodatek izoproterenolu do roztworu perfuzyjnego naśladuje aktywację układu współczulnego, ...

Obecny protokół opisuje metody ekspresji transgenu w sercach szczurów i myszy poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa do mięśnia sercowego pod kierunkiem echokardiografii. Wyjaśniono również metody oceny podatności serca na komorowe zaburzenia rytmu serca poprzez programowaną stymulację elektryczną izolowanych serc z perfuzją Langendorffa.

Ekspresja transgenu wirusa w sercach gryzoni i ocena ryzyka arytmii serca

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...

Protokół ten pozwala użytkownikowi osiągnąć wydajną ekspresję transgenu w mięśniu sercowym komory, ułatwiając badania ekspresji genów w celu zbadania arytmii serca i funkcji w tkance komorowej. Technika ekspresji transgenu wirusa jest minimalnie inwazyjna dla zwierzęcia, powodując mniej uszkodzeń i krótszy czas rekonwalescencji niż konwencjonalne podejścia, które obejmują torakotomię. Technika wywoływania arytmii w sercach małych gryzoni jest przydatna do oceny podatności na arytmie w małych zwierzęcych modelach chorób serca.Procedurę zademonstruje doktor Alice Lu, doktor habilitowany z laboratorium. Na początek wysterylizuj lewy dolny obszar klatki piersiowej znieczulonej myszy naprzemiennie wykonując peeling na bazie jodu lub chlorheksydyny w alkoholu, trzy razy okrężnymi ruchami. Pod nadzorem obrazowania ultrasonograficznego wprowadzić igłę strzykawki zawierającej wirusa do klatki piersiowej zwierzęcia.Zbliżyć końcówkę igły do wolnej ściany lewej komory przedniej i powoli wstrzyknąć od 10 do 15 mikrolitrów wirusa. Pomyślne wstrzyknięcie należy sprawdzić na obrazach ultrasonograficznych dzięki zwiększonej jasności w pobliżu końcówki igły. Wyjąć igłę z serca i wprowadzić ją w inne obszary lewej komory w celu drugiego i trzeciego wstrzyknięcia tej samej ilości wirusa.Aby wykonać perfuzję Langendorffa serca myszy, umieść kaniulowane serce w pokrytym elastomerem silikonowym, 10-centymetrowym plastikowym naczyniu, z lewą komorą skierowaną do góry. Kankaniulować aortę serca igłą podłączoną do zmodyfikowanego systemu profuzji Langendorffa w trybie stałego natężenia przepływu. Ukrwić serce roztworem tyrodu z pęcherzykami tlenu w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Na początku perfuzji sprawdź prawidłową kaniulację aorty, obserwując wypłukiwanie krwi z serca podczas pierwszych dwóch do trzech uderzeń serca i zmieniając kolor serca z czerwonego na blady. Dostosuj natężenie przepływu, aby utrzymać ciśnienie perfuzji na poziomie od 70 do 80 milimetrów słupa rtęci. Po potwierdzeniu umieść elektrody systemu EKG dla małych zwierząt wokół serca, wkładając je w powłokę silikonowo-elastomerową w naczyniu.Następnie zarejestruj EKG za pomocą kompatybilnego oprogramowania. Następnie wykonaj stymulację receptorów adrenergicznych i przeprowadź perfuzję serca izoproterenolem i roztworem Tyrode. Po 10 minutach wykonaj zaprogramowaną stymulację elektryczną w celu wywołania tachyarytmii komorowych poprzez stymulację serca na wierzchołku za pomocą dwóch platynowych elektrod podłączonych do stymulatora elektrycznego.Rozpocznij procedurę stymulacji od początkowych 10 kolejnych bodźców, S1, a następnie dodatkowego bodźca, S2, z początkowym odstępem 80 milisekund. Następnie należy wielokrotnie zmniejszać odstęp S2 o dwie milisekundy za każdym razem, aż nie będzie można już uchwycić bicia serca lub nie zostanie osiągnięty efektywny okres refrakcji serca lub ERP. Monitoruj wszelkie indukowane tachyarytmie komorowe, w tym częstoskurcz komorowy i migotanie, za pomocą EKG.Jeśli nie zostaną wywołane żadne arytmie, dodaj kolejny dodatkowy bodziec, S3, po S2, o tych samych parametrach, aż do osiągnięcia ERP. Jeśli tachyarytmie komorowe nadal nie są indukowane, przerwij stymulację elektryczną i uznaj serce za nieindukowane.Podczas zaprogramowanej stymulacji elektrycznej skuteczna stymulacja serca jest weryfikowana przez indywidualne uchwycenie bicia serca podczas kolejnych bodźców S1 i przedłużonego zespołu QRS podczas stymulacji S1. Te połączone stymulacje adrenergiczne i elektryczne nie indukowały tachyarytmii komorowych w zdrowych, pozorowanych sercach myszy typu dzikiego lub w kontrolnych sercach szczurów, którym wstrzyknięto adenowirusa GFP. W przeciwieństwie do tego, ten sam protokół wywołał tachyarytmie komorowe u 77% serc myszy typu dzikiego po zawale mięśnia sercowego i u trzech z czterech szczurów po wstrzyknięciu do mięśnia sercowego Ad-Wnt3a.Podczas wprowadzania igły należy upewnić się, że końcówka igły jest osadzona w wolnej ścianie, a nie w komorze serca. Również zabezpieczenie i kaniulacja aorty serca jest najważniejszym krokiem. Po tych procedurach serca mogą być wykorzystywane do standardowych badań histologicznych lub testów biologii molekularnej.Alternatywnie żywe komórki można wyizolować w celu przeprowadzenia badań elektrofizjologii pojedynczych komórek.

viral-transgene-expression-rodent-hearts-assessment-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Telemetry EKG stała się niezbędnym narzędziem w ocenie modeli zwierzęcych pod kątem arytmii serca i nagłej śmierci sercowej. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję krok po kroku dotyczącą rejestracji telemetrycznego EKG w celu długoterminowego ambulatoryjnego monitorowania EKG u myszy.

Ambulatoryjne zapisy EKG u myszy

Opisano metodę transferu genów w leczeniu niedokrwiennej niewydolności serca z wykorzystaniem modelu zawału mięśnia sercowego u świń. Nasza prosta i powtarzalna metoda pozwala na łatwą ocenę skuteczności różnych transferów genów w sposób bardzo prosty i odtwarzalny.

Transfer genów w przedklinicznym modelu niedokrwiennej niewydolności serca

W tym filmie pokazujemy dostarczanie rekombinowanego genu związanego z adeno na bazie wirusa u szczeniaka myszy. Metoda ta pomaga w badaniu ekspresji genów w docelowych komórkach.

Dostarczanie genów na podstawie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem: technika dostarczania transgenu i ekspresji specyficznej dla serca w modelu gryzoni

Ten protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek przy użyciu pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej za pomocą konfokalnej mikroskopii wirującego dysku. Umożliwia to szczegółowe obserwacje procesów komórkowych w żywych kardiomiocytach.

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku

W tym manuskrypcie opisana jest metoda przygotowania rekombinowanych wektorów wirusa 9 (rAAV9) do manipulowania ekspresją genów w sercu myszy.

Przygotowanie rAAV9 do nadekspresji lub knockdown genów w sercach myszy

Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Tutaj prezentujemy protokół modulacji wewnątrzsercowego autonomicznego układu nerwowego i oceny jego wpływu na podstawową elektrofizjologię, arytmogenezę i dynamikę cAMP przy użyciu układu Langendorffa ex vivo.

Wpływ neuronów wewnątrzsercowych na elektrofizjologię serca i arytmogenezę w układzie Langendorffa ex vivo

Ta praca opisuje metodę kontrolowania rytmu serca nienaruszonych mysich serc transgenicznych myszy z rodopsyną kanałową-2 (ChR2) za pomocą lokalnej fotostymulacji za pomocą mikro-LED i jednoczesnego optycznego mapowania potencjału błony nasierdziowej.

Zaawansowane zarządzanie rytmem serca poprzez zastosowanie optogenetycznej fotostymulacji wieloośrodkowej w mysich sercach

Terapia genowa mięśnia sercowego w chorobie niedokrwiennej serca jest bardzo obiecująca dla przyszłych terapii. W tym miejscu przedstawiamy duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwiennym sercu.

Duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca

Ten protokół wprowadza dwubarwne optyczne mapowanie serc myszy uzyskanych od zwierząt typu dzikiego i knock-in dotkniętych katacholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym, w tym elektrofizjologiczne pomiary napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Ten protokół przedstawia szczegółowe ramy metodologiczne dla opartej na elektroporacji transgenezy komórek serca w rozwijających się sercach myszy. Udostępnione tutaj materiały wideo ułatwią naukę tej wszechstronnej techniki.

Skuteczne podejście do transgenezy w dostarczaniu genów w embrionalnym sercu myszy

Poznaj minimalnie inwazyjną technikę ekspresji transgenu w sercach gryzoni przy użyciu wstrzyknięcia wirusowego pod kontrolą ultrasonograficzną. Metoda umożliwia ocenę skłonności do arytmii komorowych w izolowanych sercach perfundowanych układem Langendorffa.

Ekspresja transgenu wirusa w sercach gryzoni i ocena ryzyka arytmii serca

Przeglądaj więcej filmów