Name: Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj metodę transcytozy komórek śródbłonka do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka przy użyciu ludzkich mikronaczyniowych komórek śródbłonka siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH (R01 EY028100, EY024963 i EY031765) dla JC. ZW otrzymał wsparcie od Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie do generowania mikroskopii świetlnej i obrazów EM (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Protokoły do badań in vivo można uzyskać od Wang et al.24. Wszystkie eksperymenty z udziałem ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (HRMEC) zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Roztwór do powlekania naczynia do hodowli tkankowej: Przygotować 0,1% roztwór żelatyny, rozpuszczając 1 ml roztworu podstawowego żelatyny (40%-50%) w 500 ml sterylnej hodowli tkankowej klasy 1x PBS (pH = 7,4). Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm. Przechowywać 0,1% roztwór żelatyny w temperaturze 2-8°C. Może być przechowywany w tej temperaturze przez czas nieokreślony w stanie sterylnym.</li>
	<li>Pożywka wzrostowa: Przygotować 500 ml kompletnej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (EGM), rozpuszczając suplementy EGM w pożywce podstawowej wzrostu komórek śródbłonka (EBM) zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). Podwielokrotną pożywkę rozlać na probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. Okres przechowywania pożywki wynosi 12 miesięcy w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Roztwór trypsyny: W przypadku 0,25% roztworu trypsyny-EDTA, porcję z fiolki podstawowej rozlać do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C (do 2 tygodni) lub -20 °C (do 24 miesięcy).</li>
</ol>
2. Hodowla HRMEC
<ol>
	<li>Początkowa hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Szalki Petriego (100 mm średnicy x 20 mm wysokości) pokryć 5 ml 0,1% roztworu żelatyny pod kapturem z przepływem laminarnym i przechowywać je w stanie nienaruszonym w kapturze przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu uzyskania jednolitego powlekania. 
		UWAGA: Żelatynowa powłoka naczyń zwiększa przyczepianie komórek. Alternatywnie można również użyć kolb hodowlanych T75 pokrytych żelatyną.</li>
		<li>Przed wysiewem komórek odessać roztwór żelatyny za pomocą pompy próżniowej. Podciśnienie zastosowanego aspiratora wynosiło do 724 mmHg. 
		UWAGA: Aspirację należy wykonać bezpośrednio przed wysiewem komórek, aby zapobiec wysychaniu roztworu powlekającego.</li>
		<li>Rozmrozić zamrożoną fiolkę z HRMEC (z przechowywania w ciekłym azocie) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub dodając do fiolki ciepłą pożywkę wzrostową. Po rozmrożeniu przenieść zawiesinę komórkową do 9 ml pożywki wzrostowej (zakładając, że rozmrożona fiolka z HRMEC ma 1 ml). 
		UWAGA: HRMEC zostały pozyskane komercyjnie (tabela materiałów). Pożywkę wzrostową dodaną do komórek należy zawsze podgrzać do temperatury 37 °C przed użyciem.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie zassać supernatant, aby uniknąć usunięcia osadu komórkowego.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wzrostowej i przenieść powstałą zawiesinę na pokrytą żelatyną płytkę Petriego. Utrzymać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zazwyczaj HRMEC zlewają się w 70%-80% po 72 godz. 
		UWAGA: Pożywka wzrostowa jest zmieniana co drugi dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Subkultura HRMEC na przepuszczalnych wkładach membranowych
	<ol>
		<li>Przygotować wkłady filtracyjne do hodowli komórkowych (wkładki 6,5 mm z membraną poliwęglanową o wielkości porów 0,4 μm, umieszczone na płytce 24-dołkowej) do wysiewu HRMEC poprzez pokrycie każdej wkładki (komory wierzchołkowej) 200 μl 0,1% roztworu żelatyny przez 30 minut pod okapem z przepływem laminarnym. Upewnij się, że roztwór pokrywa całą dolną powierzchnię wkładu filtra. 
		UWAGA: Każda studzienka ma komorę wierzchołkową i podstawno-boczną oddzieloną porowatą membraną.</li>
		<li>Wyjąć z inkubatora szalkę Petriego z hodowanymi HRMEC (etap 2.1.5) i odessać pożywkę wzrostową. Delikatnie przepłucz komórki 2x 10 ml 1x PBS pod kapturem z przepływem laminarnym, aby pozbyć się potencjalnych pływających/martwych komórek.</li>
		<li>Oddzielić komórki za pomocą 0,5-1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i umieścić szalkę Petriego w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) na 5 minut.</li>
		<li>Ugasić aktywność trypsyny, dodając 4,5-9 ml pożywki wzrostowej i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą ręcznego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i zasiewaj w gęstości 4 x 104 komórek na wkład filtracyjny (tj. 1,25 x 105 komórek/cm2). Objętość zawiesiny komórek dla każdej wkładki wynosi 250 μL.</li>
		<li>Odessać roztwór powlekający ze studzienek zawierających przepuszczalne wkłady i przenieść 250 μl zawiesiny komórek na wkładkę (komorę wierzchołkową). Dodać tylko pożywkę (tj. bez komórek) do jednej z wkładek, która będzie używana jako "ślepa kontrola" do pomiaru TEER. Jednocześnie dodaj również 750 μl pożywki na studzienkę w komorach podstawno-bocznych.</li>
		<li>Przechowywać 24-dołkową płytkę z przepuszczalnymi wkładkami w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) przez 7-12 dni, aż wyhodowane komórki staną się w pełni zlewające się i zostanie osiągnięta pożądana wartość TEER wynosząca ~20 Ω·cm2.</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień. Podczas wymiany pożywki należy ostrożnie zassać pożywkę, aby zminimalizować zakłócenie monowarstwy komórkowej i dodać 250 μl i 750 μl świeżej pożywki na studzienkę odpowiednio do komory wierzchołkowej i podstawno-bocznej. 
		UWAGA: Pożywka wzrostowa jest zmieniana zarówno dla komory wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej studni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiary TEER (<silna klasa="xfig">Rysunek 4)
<ol>
	<li>W 14 dniu po wysiewie komórek (krok 2.2.9) zmierz TEER dla HRMEC za pomocą systemu rezystancji elektrycznej (ER) nabłonkowego woltomierza i omów (EVOM) (tabela materiałów) w następujący sposób.</li>
	<li>Naładuj wstępnie system ER i sprawdź działanie miernika za pomocą elektrody testowej STX04. W razie potrzeby przeprowadzić kalibrację.</li>
	<li>Podłącz elektrodę do miernika i zrównoważ elektrodę, najpierw mocząc ją w 70% etanolu na 15-20 minut, a następnie zanurzając ją na krótko w pożywce wzrostowej EGM do hodowli komórkowej.</li>
	<li>W międzyczasie trzymaj 24-dołkową płytkę zawierającą komórki w okapie z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut w celu zrównoważenia temperatury. 
	UWAGA: Na pomiary TEER ma wpływ temperatura, dlatego niezbędny jest krok równowagi.</li>
	<li>W celu pomiaru TEER należy dodać świeżą pożywkę wzrostową zarówno do komory wierzchołkowej (250 μl), jak i bazobocznej (750 μl) studzienek.</li>
	<li>Wykonaj pomiar TEER, ostrożnie zanurzając elektrodę tak, aby krótsza końcówka znajdowała się we wkładce, a dłuższa końcówka dotykała dna studni. Najpierw zmierz rezystancję w poprzek ślepej próby. Dla każdej wkładki zmierz TEER w trzech egzemplarzach. 
	UWAGA: Do płukania elektrody pomiędzy pomiarami stosuje się pożywkę hodowlaną. Upewnij się, że elektroda jest trzymana pod kątem 90° do dna wkładki, aby uzyskać stabilne odczyty.</li>
	<li>Obliczyć opór elektryczny (w Ω · cm2) na monowarstwie, korzystając ze wzoru, TEER = rezystancja netto (Ω) x pole powierzchni wkładu filtracyjnego (cm2); tutaj rezystancja netto to różnica między rezystancją każdego dołka (pożywka wzrostowa z komórkami) a studzienką ślepą (tylko pożywka wzrostowa).</li>
	<li>Dalszą obróbkę komórek należy przeprowadzić dopiero po osiągnięciu wartości TEER ~20 Ω·cm2. Jeśli żądany poziom TEER nie zostanie osiągnięty, należy przechowywać płytkę w inkubatorze i zmierzyć TEER następnego dnia. 
	UWAGA: Zbieganie HRMEC można również potwierdzić przez badanie morfologiczne kształtu komórki (pod mikroskopem) z typową morfologią bruku i/lub przez obecność białek połączenia komórkowego z oddzielnym barwieniem immunohistochemicznym.</li>
</ol>
4. Test transcytozy
<ol>
	<li>Test transcytozy in vitro za pośrednictwem klatryny przy użyciu transferyny znakowanej Cy3 (<silna klasa = "xfig">Figura 5)
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu zbiegu z wartościami TEER około 20 Ω·cm2, surowicę pozbawia komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy użyciu 0,5% FBS w EBM (pożywka o obniżonej surowicy) w obu komorach (komora wierzchołkowa: 250 μL i komora podstawno-boczna: 750 μL) przed leczeniem ligandem. W całym teście stosowano EBM o obniżonej zawartości surowicy.</li>
		<li>Inkubować komórki (przy użyciu pożywki o obniżonej zawartości surowicy w kroku 4.1.1) w komorze wierzchołkowej z fluorescencyjnym (cyjanina 3) znakowanym ligandem transferyny (Cy3-Tf) (końcowe stężenie 40 μg/ml) przez 60 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Płytki zawierające Cy3-Tf należy chronić przed światłem, aby uniknąć fotowybielania Cy3-Tf poprzez owinięcie w nie folii aluminiowej i przeprowadzenie eksperymentu w kapturze do hodowli komórkowej przy wyłączonym świetle.</li>
		<li>Po 1 godzinie umieścić płytkę na lodzie i przemyć monowarstwę wierzchołkowo i zasadzkowo 4x (3-5 minut na mycie) pożywką o obniżonej zawartości surowicy w temperaturze pokojowej, aby usunąć wolny niezwiązany Cy3-Tf. 
		UWAGA: Mycie jest niezbędne, aby usunąć wolne cząsteczki znacznikowe i umożliwić dokładny odczyt transcytozy bez potencjalnego wycieku z drogi parakomórkowej.</li>
		<li>Dodać świeżą pożywkę o obniżonej surowicy (jak w kroku 4.1.1) do dokładnie umytych wkładów filtracyjnych zawierających komórki i przenieść wkładki do świeżych studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej wstępnie podgrzaną pożywkę o obniżonej surowicy.</li>
		<li>Inkubować komórki przez kolejne 90 minut w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ), a następnie pobrać pożywkę z komory podstawno-bocznej.</li>
		<li>Zapisać intensywność fluorescencji roztworu z komory podstawno-bocznej za pomocą detektora fluorescencji. Poziomy intensywności fluorescencji, mierzone jako względne jednostki fluorescencyjne (RFU), wskazują ilość kompleksu Cy3-Tf transcytozowanego przez monowarstwę HRMEC poprzez transcytozę zależną od klatryny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test transcytozy in vitro za pośrednictwem kaweoli przy użyciu HRP (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6)
	<ol>
		<li>Po osiągnięciu pełnej zbieżności z wartościami TEER około 20 Ω·cm2, surowicę pozbawić komórek przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy użyciu 0,5% pożywki EBM zawierającej FBS (pożywka o obniżonej surowicy) przed leczeniem (jak w kroku 4.1.1.). Pożywka EBM o obniżonej zawartości surowicy była używana przez cały czas trwania testu.</li>
		<li>Potraktuj komórki w komorze wierzchołkowej pożądanymi zabiegami i kontrolami nośnika. 
		UWAGA: Tutaj użyliśmy modulatorów Wnt jako przykładu, aby zademonstrować regulację transcytozy za pośrednictwem kaweoli przez szlak sygnałowy Wnt w HRMEC: ludzki rekombinowany Norrin i inhibitor Wnt XAV939. W typowym eksperymencie komórki traktowano przez 24 godziny w inkubatorze (37 °C i 5% CO2 ) następującymi stężeniami: Norrin (125 ng / ml), Norrin (125 ng / ml) + XAV939 (10 μM) i roztwór kontrolny nośnika. Ponadto zastosowano również pożywkę kondycjonowaną Wnt3a (wytwarzaną z ogniw L Wnt-3A).</li>
		<li>Inkubować komórki w komorze wierzchołkowej z HRP (5 mg/ml) przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnie umieść 24-dołkową płytkę na lodzie i intensywnie umyj komorę wierzchołkową i podstawno-boczną 6x buforem P (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM pirogronian sodu, 10 mM glukozy, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) w celu usunięcia wolnego zewnątrzkomórkowego HRP. 
		UWAGA: Mycie jest niezbędne, aby usunąć wolne cząsteczki znacznikowe i umożliwić dokładny odczyt transcytozy bez potencjalnego wycieku z drogi parakomórkowej.</li>
		<li>Dodać świeżą pożywkę o obniżonej surowicy (jak w kroku 4.1.1) do komory wierzchołkowej i przenieść wkładki do świeżej studzienki zawierającej wstępnie podgrzane podłoże.</li>
		<li>Inkubować monowarstwę przez dodatkowe 90 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed pobraniem pożywki z komory podstawno-bocznej.</li>
		<li>Do zebranej pożywki dodać 100 μl substratu peroksydazy fluorogenicznej HRP (tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed zatrzymaniem reakcji ze 100 μl roztworu Stop.</li>
		<li>Wykrywanie poziomów produktu reakcji substratu HRP w pożywce za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Zmierz intensywność fluorescencji przy długości fali emisji 420 nm (ze wzbudzeniem 325 nm) i jako względne jednostki fluorescencyjne (RFU). Wartości wskazują poziom HRP transcytozowanego w warstwie HRMEC przez transcytozę za pośrednictwem kaweoli. 
		UWAGA: Zastosowany tutaj produkt fluorescencyjny (Tabela materiałów) nie powoduje fotowybielania. Ochrona przed światłem przed fotowybielaniem nie jest potrzebna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają konfliktu interesów ani interesów finansowych, które mogliby ujawnić.

BRB odgrywa istotną rolę w zdrowiu i chorobach siatkówki. Techniki in vitro oceniające przepuszczalność naczyń krwionośnych okazały się kluczowymi narzędziami w badaniach nad rozwojem i funkcją bariery (BRB/BBB). Opisana tutaj procedura może być wykorzystana do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transcytozy EC lub oceny powiązanych modulatorów molekularnych wpływających na przepuszczalność BRB. Metody in vitro Testy transcytozy EC mają wiele zalet w porównaniu z testami in vivo</em...

Ludzka siatkówka jest jedną z najbardziej energochłonnych tkanek w ciele. Prawidłowe funkcjonowanie siatkówki nerwowej wymaga wydajnego dostarczania tlenu i składników odżywczych wraz z ograniczonym strumieniem innych potencjalnie szkodliwych cząsteczek w celu ochrony środowiska siatkówki, w którym pośredniczy bariera krew-siatkówka (BRB)1. Podobnie jak bariera krew-mózg (BBB) w ośrodkowym układzie nerwowym, BRB działa jak selektywna bariera w oku, regulując ruch jonów, wody, aminokwasów i cukru do i z siatkówki. BRB utrzymuje również homeostazę siatkówki i jej przywilej immunologiczny, zapobiegając narażeniu na czynniki krążeniowe, takie jak komórki odpornościowe, przeciwciała i szkodliwe patogeny2. Dysfunkcja BRB przyczynia się do patofizjologii kilku chorób naczyniowych oczu, takich jak retinopatia cukrzycowa, zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), retinopatia wcześniaków (ROP), niedrożność żyły siatkówki i zapalenie błony naczyniowej oka, powodując obrzęk naczyniopochodny i późniejszą utratę wzroku3,4,5.
BRB składa się z dwóch oddzielnych barier dla dwóch odrębnych sieci naczyń ocznych, odpowiednio: unaczynienia siatkówki i fenestrowanej naczyniówki pod siatkówką. Wewnętrzny BRB (iBRB) składa się głównie z komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (RMEC) wyściełających mikrokrążenie siatkówki, które odżywia wewnętrzne warstwy neuronalne siatkówki. Z drugiej strony, nabłonek barwnikowy siatkówki stanowi główny składnik zewnętrznego BRB, który znajduje się między siatkówką neurosensoryczną a naczyniówką włosowatą2. W przypadku iBRB transport molekularny przez RMEC odbywa się zarówno drogą parakomórkową, jak i transkomórkową (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Wysoki stopień selektywności substancji w całym iBRB opiera się na (i) obecności kompleksów białek połączeniowych, które ograniczają transport parakomórkowy między sąsiednimi komórkami śródbłonka (EC) oraz (ii) niskich poziomach ekspresji mediatorów kaweoli, transporterów i receptorów w komórkach śródbłonka, które utrzymują niskie wskaźniki transportu międzykomórkowego1,6,7,8. Kompleksy połączeniowe regulujące przepływ przykomórkowy składają się z połączeń ścisłych (klaudyny, okludyny), połączeń adherenowych (kadheryny VE) i połączeń szczelinowych (koneksyny), umożliwiających przepływ wody i małych związków rozpuszczalnych w wodzie. Podczas gdy małe cząsteczki lipofilowe pasywnie dyfundują po wnętrzu RMEC, ruch większych cząsteczek lipofilowych i hydrofilowych jest regulowany przez szlaki transśródbłonkowe sterowane przez ATP, w tym transport pęcherzykowy i transportery błonowe5,9.
Transcytoza pęcherzykowa może być sklasyfikowana jako transcytoza kaweolinowa, transcytoza zależna od klatryny (i za pośrednictwem receptora) oraz makropinocytoza niezależna od klatryny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Te procesy transportu pęcherzykowego obejmują pęcherzyki różnej wielkości, przy czym makropinosomy są największe (w zakresie 200-500 nm), a kaweole są najmniejsze (średnio 50-100 nm), podczas gdy pęcherzyki pokryte klatryną wahają się od 70-150 nm10. Kaweole to bogate w lipidy wgłębienia błony plazmatycznej w kształcie kolby z płaszczem białkowym, składającym się głównie z kaweoliny-1, która wiąże błonę lipidową, cholesterol i inne białka strukturalne i sygnałowe poprzez ich domenę rusztowania kaweoliny11. Kaweoleliny współpracują z obwodowo przyczepioną caviną, aby promować stabilizację kaweoli na błonie plazmatycznej12. Błony kaweoli mogą również przenosić receptory dla innych cząsteczek, takich jak insulina, albumina i krążące lipoproteiny, w tym lipoproteiny o dużej gęstości (HDL) i lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL), aby wspomóc ich ruch przez komórki śródbłonka13. Podczas rozwoju tworzenie funkcjonalnego BRB zależy od supresji transcytozy EC8. Dojrzały śródbłonek siatkówki, w związku z tym, ma stosunkowo niski poziom receptorów kaweoliny, kaweoliny-1 i albuminy w stosunku do innych komórek śródbłonka w warunkach fizjologicznych, co przyczynia się do jego właściwości barierowych4,9.
Ponieważ rozpad iBRB jest główną cechą charakterystyczną wielu patologicznych chorób oczu, konieczne jest opracowanie metod oceny przepuszczalności naczyń siatkówki in vivo i in vitro. Metody te pomagają uzyskać prawdopodobny wgląd w mechanizmy naruszonej integralności BRB i ocenić skuteczność potencjalnych celów terapeutycznych. Obecne obrazowanie in vivo lub ilościowe testy przecieku naczyniowego zwykle wykorzystują fluorescencyjne (fluoresceina sodu i dekstran), kolorymetryczne (barwnik Evans Blue i substrat peroksydazy chrzanowej [HRP]) lub radioaktywne znaczniki14 do wykrywania wynaczynienia z układu krwionośnego do otaczających tkanek siatkówki za pomocą obrazowania mikroskopowego lub w izolowanym lizacie tkankowym. Idealny znacznik do ilościowego określania integralności naczyń krwionośnych powinien być obojętny i wystarczająco duży, aby swobodnie przenikać przez uszkodzone naczynia, gdy jest zamknięty w zdrowych i nienaruszonych naczyniach włosowatych. Metody wykorzystujące fluoresceinę sodu lub dekstran sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny (dekstran FITC) w angiografii fluoresceinowej żywego dna oka (FFA) lub izolowanych płaskich mocowań siatkówki są szeroko stosowane do ilościowego oznaczania wynaczynienia siatkówki in vivo lub ex vivo. FITC-dekstran ma tę zaletę, że jest dostępny w różnych masach cząsteczkowych w zakresie od 4 do 70 kDa do badań selektywnych pod względem wielkości15,16,17. Albumina FITC (~68 kDa) jest alternatywnym znacznikiem białkowym o dużym rozmiarze o znaczeniu biologicznym dla badań przecieków naczyniowych18. Niebieski barwnik Evansa, wstrzykiwany dosercowo19, retro-orbitalnie lub przez żyłę ogonową20, również opiera się na wiązaniu z endogenną albuminą, tworząc dużą cząsteczkę, którą można określić ilościowo głównie za pomocą detekcji spektrofotometrycznej lub, rzadziej, mikroskopii fluorescencyjnej w flat mounts20,21. Jednak te ilościowe lub lekkie metodologie obrazowania często nie odróżniają transportu parakomórkowego od transportu przezśródbłonkowego. Do specyficznej analizy transcytozy z ultrastrukturalną wizualizacją transcytozowanych pęcherzyków, cząsteczki znacznikowe, takie jak HRP, są zwykle używane do lokalizacji transcytozowanych pęcherzyków w komórkach śródbłonka, które można obserwować pod mikroskopem elektronowym22,23,24 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A-C).
Rozwój i wykorzystanie modeli iBRB in vitro do oceny przepuszczalności komórek śródbłonka może dostarczyć solidnej i wysokiej przepustowości oceny, która uzupełni eksperymenty in vivo i pomoże w badaniu molekularnych regulatorów przecieku naczyniowego. Powszechnie stosowane testy do oceny transportu parakomórkowego i integralności połączeń ścisłych obejmują transśródbłonkowy opór elektryczny (TEER), miarę przewodnictwa jonowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 4)2,25, oraz test przecieku naczyniowego in vitro przy użyciu znaczników fluorescencyjnych o małej masie cząsteczkowej26. Ponadto testy transcytozy oparte na transferynie modelujące BBB zostały wykorzystane do zbadania transcytozy zależnej od klatryny27. Mimo to testy do oceny BRB, a dokładniej transcytozy kawetolarnej EC siatkówki in vitro, są ograniczone.
W tym badaniu opisujemy test transcytozy EC z wykorzystaniem ludzkich komórek mikronaczyniowych śródbłonka siatkówki (HRMEC) jako modelu in vitro do określenia przepuszczalności iBRB i transcytozy EC. Test ten opiera się na zdolności HRMEC do transportu transferyny lub HRP odpowiednio przez szlaki transcytozy zależne od receptora lub kaweoli (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2). HRMEC hodowane do pełnej konfluencji w komorze wierzchołkowej (tj. wkładzie filtrującym) inkubowano z fluorescencyjnie sprzężoną transferyną (Cy3-Tf) lub HRP w celu zmierzenia intensywności fluorescencji odpowiadającej poziomom transferyny lub HRP przeniesionej do dolnej komory wyłącznie przez transcytozę EC. Zbieżność monowarstwy ogniwa można potwierdzić poprzez pomiar TEER, wskazujący na integralność złącza ścisłego25. Aby zademonstrować technikę testu TEER i transcytozy, wykorzystano znane molekularne modulatory przepuszczalności naczyń i transcytozy EC, w tym czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)28 oraz te w sygnalizacji Wnt (ligandy Wnt: Wnt3a i Norrin)29.

<table><tbody><tr><td>Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa Petridyczny&nbsp;</td><td>Gniazdo Biotechnologia</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (15 ml)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Probówki wirówkowe (50 ml)</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanina 3-ludzka transferyna&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) Suplementy SingleQuots</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr żelatynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>(2-chipowy)</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa (HRP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka siatkówki (HRMEC)</td><td>Systemy komórkowe</td><td>Inkubator ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Electron Korporacja, Thermo Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L ogniwa (do podłoża kondycjonowanego kontrolnie)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Ogniwa Wnt-3A (do podłoża kondycjonowanego Wnt3A)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik płytek</td><td>EnSight, PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) bufor (1x)</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>QuantaBlu Zestaw substratów peroksydazy fluorogenicznej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka Norrin (rhNorrin)</td><td>R& D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (rhVEGF)</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,22 &mikro; m)</td> <td>Wkładki Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Transwell (6,5 mm transwell, 0,4 i mikro; wkładka z membrany poliestrowej o porach m)</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%) (1x)</td><td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr>Precyzyjna<td>kąpiel wodna</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>51221060</td><td></td></tr><tr><td>XAV939 (inhibitor Wnt/&beta;-kateniny)</td><td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunkcja bariery krew-siatkówka (BRB) przyczynia się do patofizjologii wielu chorób naczyniowych oczu, często powodując obrzęk siatkówki i późniejszą utratę wzroku. Wewnętrzna bariera krew-siatkówka (iBRB) składa się głównie ze śródbłonka naczyniowego siatkówki o niskiej przepuszczalności w warunkach fizjologicznych. Ta cecha niskiej przepuszczalności jest ściśle regulowana i utrzymywana przez niskie szybkości transportu parakomórkowego między sąsiednimi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki, a także transportu transkomórkowego (transcytozy) przez nie. Ocena przepuszczalności bariery transkomórkowej siatkówki może dostarczyć fundamentalnych informacji na temat integralności iBRB w zdrowiu i chorobie. W tym badaniu opisujemy test transcytozy komórek śródbłonka (EC) jako model in vitro do oceny przepuszczalności iBRB, przy użyciu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki (HRMEC). Test ten ocenia zdolność HRMEC do transportu transferyny i peroksydazy chrzanowej (HRP) odpowiednio w procesach transportu międzykomórkowego, w których pośredniczą receptory i kaweole. W pełni zlewające się HRMEC hodowane na porowatej błonie inkubowano z fluorescencyjnie znakowaną transferyną (transcytoza zależna od klatryny) lub HRP (transcytoza za pośrednictwem kaweoli) w celu zmierzenia poziomów transferyny lub HRP przenoszonych do dolnej komory, co wskazuje na poziomy transcytozy w monowarstwie EC. Sygnalizacja Wnt, znany szlak regulujący iBRB, została zmodyfikowana w celu zademonstrowania metody testu transcytozy opartej na HRP za pośrednictwem kaweoli. Opisany tutaj test transcytozy EC może stanowić użyteczne narzędzie do badania molekularnych regulatorów przepuszczalności EC i integralności iBRB w patologiach naczyniowych oraz do badań przesiewowych systemów dostarczania leków.

Obrazy EM śródbłonka naczyń siatkówki wykazują pęcherzykowy transport transcytotyczny oraz pęcherzyki kaweolarne w komórkach śródbłonka in vivo. 
Transcytózę komórek śródbłonka można zwizualizować in vivo w przekrojach poprzecznych siatkówki jako ciemnobrązowy osad odpowiadający naczyniom krwionośnym zawierającym HRP pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 3A) oraz jako elektrongęsty osad wskazujący na pęcherzyki transcytotyc...

Ten protokół ilustruje test transcytozy komórek śródbłonka in vitro jako model do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka poprzez pomiar zdolności ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki do transportu peroksydazy chrzanowej przez komórki w procesach transportu transkomórkowego, w których pośredniczą kaweole.

Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Protokół ten zapewnia użyteczny model komórkowy do badania funkcji i przepuszczalności selektywnych barier naczyniowych, takich jak bariera krew-siatkówka lub bariera krew-mózg, ze szczególnym naciskiem na transcytozę śródbłonka. Ten test jest łatwy w konfiguracji i obsłudze, nie wymaga żywych zwierząt. Może być wykorzystany do badania różnych molekularnych regulatorów przepuszczalności komórek śródbłonka i transcytozy wpływających na integralność wewnętrznej bariery krew-siatkówka.Test ten może dostarczyć informacji na temat biologii naczyń krwionośnych oraz badań nad oczami i mózgiem, umożliwiając lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kontroli BRB BBB i zbadanie potencjalnego dostarczania leków przez bariery. Na początek przygotuj wkłady filtracyjne do hodowli komórkowych do wysiewu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki lub HRMEC, pokrywając każdą wkładkę 200 mikrolitrami 0,1% roztworu żelatyny przez 30 minut pod kapturem z przepływem laminarnym. Upewnij się, że roztwór pokrywa całą dolną powierzchnię wkładu filtra.Weź szalkę Petriego z hodowanymi HRMEC inkubowanymi w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla i odessaj pożywkę wzrostową. Delikatnie przepłucz ogniwa dwukrotnie 10 mililitrami 1X PBS pod okapem z przepływem laminarnym, aby pozbyć się potencjalnych pływających lub martwych komórek. Oddziel komórki za pomocą 0,5 do 1 mililitra 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i umieść szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 5 minut.Ugasić aktywność trypsyny, dodając od 4,5 do 9 mililitrów pożywki wzrostowej i przenieść zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki za pomocą 10-mililitrowej pipety. Wiruj komórki 200 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 mililitrach pożywki wzrostowej.Policz liczbę komórek za pomocą ręcznego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek i zasiewaj z gęstością 40 000 komórek na wkład filtracyjny. Objętość zawiesiny komórek dla każdej wkładki wynosi 250 mikrolitrów. Odessać roztwór powlekający z dołków zawierających przepuszczalne wkładki i przenieść 250 mikrolitrów zawiesiny komórek na wkładkę, a następnie dodać tylko pożywkę do jednej z wkładek, która zostanie użyta jako ślepa próba kontrolna do pomiaru przezśródbłonkowego oporu elektrycznego lub TEER.Jednocześnie dodaj również 750 mikrolitrów pożywki na studzienkę w komorach podstawno-bocznych. Przechowywać 24-dołkową płytkę z przepuszczalnymi wkładkami w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 7 do 12 dni, aż wyhodowane komórki staną się w pełni zlewające się i zostanie osiągnięta pożądana wartość TEER wynosząca około 20 omów na centymetr kwadratowy. Przed pomiarami TEER należy umieścić 24-dołkową płytkę zawierającą komórki w okapie z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej na 15 do 20 minut w celu zrównoważenia temperatury.Aby zmierzyć TEER dla HRMEC, za pomocą nabłonkowego woltomierza/omomierza systemu oporu elektrycznego, podłącz elektrodę do miernika i wyrównaj elektrodę, najpierw mocząc ją w 70% etanolu na 15 do 20 minut, a następnie zanurzając ją na krótko w pożywce wzrostowej EGM do hodowli komórkowej. Wykonaj pomiar TEER, ostrożnie zanurzając elektrodę tak, aby krótsza końcówka znajdowała się we wkładce, a dłuższa końcówka dotykała dna studzienki. Najpierw zmierz rezystancję na ślepej próbie, a następnie dla każdej wkładki zmierz TEER w trzech egzemplarzach.Po osiągnięciu zbieżności z wartościami TEER około 20 omów kwadratowych, przed leczeniem ligandem należy pozbawić komórki surowicy przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla za pomocą 0,5% FBS w EBM w obu komorach. W całym teście stosowano EBM o obniżonej zawartości surowicy. Inkubować komórki za pomocą pożywki o obniżonej surowicy w komorze wierzchołkowej z fluorescencyjnym znacznikiem cyjaniny-3 do ligandu transferyny przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po 4-krotnym przemyciu monowarstwy wierzchołkowo i zasadkowo pożywką o obniżonej surowicy, dodać świeżą pożywkę do wkładów filtracyjnych zawierających komórki i przenieść wkładki do świeżych studzienek 24-dołkowej płytki zawierającej wstępnie podgrzaną pożywkę o obniżonej surowicy. Inkubować komórki przez kolejne 90 minut w inkubatorze, a następnie zebrać pożywkę z komory podstawno-bocznej. Zapisać intensywność fluorescencji roztworu z komory podstawno-bocznej za pomocą detektora fluorescencji.Po osiągnięciu zbieżności z wartościami TEER około 20 omów kwadratowych, przed leczeniem ligandem należy pozbawić komórki surowicy przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla za pomocą 0,5% FBS w EBM w obu komorach. W całym teście stosowano EBM o obniżonej zawartości surowicy. Następnie potraktuj komórki w komorze wierzchołkowej pożądanymi zabiegami i kontrolami nośnika.Dodaj 5 miligramów na mililitr peroksydazy chrzanowej lub HRP do komórek i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodać świeżą pożywkę o obniżonej surowicy do komory wierzchołkowej i przenieść wkładki do świeżej studzienki zawierającej wstępnie podgrzane podłoże. Inkubować monowarstwę przez dodatkowe 90 minut w inkubatorze.Po pobraniu pożywki z komory podstawno-bocznej dodać 100 mikrolitrów substratu peroksydazy fluorogenicznej HRP do zebranej pożywki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zatrzymać reakcję za pomocą 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego i wykryć poziomy produktu reakcji substratu HRP w pożywce za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Przed zademonstrowaniem testów transcytozy in vitro, wizualizacja transcytozy komórek śródbłonka w siatkówce jest pokazana jako informacje podstawowe.Tutaj obraz z mikroskopu świetlnego pokazuje światło naczynia krwionośnego wypełnione HRP z 3-miesięcznego odcinka siatkówki myszy typu dzikiego wybarwionego DAB. HRP został wstrzyknięty retroorbitalnie. Naczynia siatkówki wypełnione HRP można zobaczyć jako ciemnobrązowy osad pod mikroskopem świetlnym.Ultracienki przekrój transmisyjnego mikroskopu elektronowego pokazuje naczynia transcytotyczne wypełnione HRP z RMEC przedstawiającymi transcytozę EC przez wewnętrzną barierę krew-siatkówka. W tym przypadku duży pęcherzyk potencjalnie odbija makropinosom i czerwoną krwinkę po stronie luminolu. Obraz TeM pokazuje wypełnione HRP małe pęcherzyki transcytotowe, prawdopodobnie pęcherzyki kaweoli, w obrębie RMEC.Barwienie immunohistochemiczne przeciwciała CAV-1 i izolektyny B4 wykazało lokalizację CAV-1, markera pęcherzyków kaweoli w naczyniach krwionośnych siatkówki, w 3-miesięcznej siatkówce myszy typu dzikiego. Obraz TeM CAV-1 znakowanego immunozłotem w komórkach śródbłonka siatkówki jest pokazany tutaj z powiększonym obrazem pęcherzyka kaweoli CAV-1 dodatniego. W przypadku testu transcytozy EC za pośrednictwem klatryny w HRMEC przy użyciu transferyny, tutaj obraz z mikroskopu fluorescencyjnego pokazuje endocytozowaną transferynę Cy3 w kolorze czerwonym w HRMEC barwionych DAPI na niebiesko.W przypadku transcytozy EC za pośrednictwem kaweoli przy użyciu HRP, sygnalizacja Wnt jest tutaj używana jako przykład w celu zademonstrowania testu. Niedawno odkryto, że sygnalizacja Wnt reguluje transcytozę EC za pośrednictwem kaweoli. Komórki traktowano aktywatorem szlaku Wnt pożywką kondycjonowaną Wnt3a i rekombinowanym Norrinem, z lub bez inhibitora sygnalizacji Wnt XAV939 i ich reaktywnymi kontrolami.Aktywatory Wnt zmniejszały poziom transcytozy opartej na HRP, które zostały odwrócone przez XAV939. Prawidłowy pomiar TEER ma kluczowe znaczenie dla określenia integralności monowarstwy. Duży wpływ na to mają różne czynniki, takie jak niewłaściwa obsługa, wahania temperatury, pożywka, czas trwania hodowli i tak dalej.Test ten może być zmodyfikowany jako kokultura lub systemy hodowli organotypowych 3D naśladujące warunki in vivo.

endothelial-cell-transcytosis-assay-as-an-vitro-model-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Ten film przedstawia metodę oceny przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu myszy in vitro. Wysoka wartość TEER wskazuje na nienaruszone połączenia komórek śródbłonka, podczas gdy dodanie aktywowanych limfocytów T obniża wartość TEER, odzwierciedlając przerwanie bariery połączeniowej.

Ocena przezśródbłonkowej oporności elektrycznej w modelu bariery krew-mózg in vitro

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Wiele zastosowań terapeutycznych wymaga bezpiecznego i wydajnego transportu nośników leków i ich ładunków przez bariery komórkowe w ciele.  W artykule opisano adaptację uznanych metod do oceny szybkości i mechanizmu transportu nanonośników leków (NC) przez bariery komórkowe, takie jak nabłonek przewodu pokarmowego (GI).

Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Opisano i zweryfikowano metodę tworzenia modelu in vitro bariery krew-mózg opartej na wspólnej hodowli komórek mikronaczyniowych śródbłonka i astrocytów mózgu szczura. System ten okazał się przydatnym narzędziem do badania wpływu nanoformulacji na przenikanie przez barierę cząsteczek fluorescencyjnych.

In vitro Przenikanie ferrytyn obciążonych FITC przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Stworzono tani, łatwy w użyciu i potężny system do oceny potencjalnych metod leczenia, które mogłyby złagodzić naruszenie bariery siatkówki krwi wywołane przez histaminę. Nieszczelność naczyń krwionośnych, aktywacja komórek Müllera i ciągłość procesów neuronalnych są wykorzystywane do oceny odpowiedzi na uszkodzenie i jej odwrócenia za pomocą potencjalnego leku, lipoksy A4.

Model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery siatkówkowej krwi i potencjalnych leków do leczenia

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Poznaj metodę transcytozy komórek śródbłonka do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka przy użyciu ludzkich mikronaczyniowych komórek śródbłonka siatkówki.

Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka

Przeglądaj więcej filmów