Name: Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj dynamikę mikrotubul w komórkach glejaka podczas inwazji mózgu danio pręgowanego. Ta metoda obrazowania na żywo umożliwia analizę cytoszkieletu z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Francja) i jego laboratorium, szczególnie Valérie Briolat, oraz Emmie Colucci-Guyon za dostarczenie nam linii do danio pręgowanego i plastikowej formy do płytek do mikroiniekcji, a także za ich cenną wiedzę na temat procedur eksperymentalnych dla danio pręgowanego. Z wdzięcznością dziękujemy firmie UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, wspieranej przez francuską Narodową Agencję Badawczą France BioImaging oraz ANR-10-INBS-04; Inwestycje na przyszłość). Prace te były wspierane przez Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique i Institut Pasteur oraz dzięki hojnym darowiznom pani Marguerite MICHEL i pana Porqueta.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Obrazowanie ksenoprzeszczepów nowotworowych w rozdzielczości pojedynczej komórki prawdopodobnie stanie się niezbędnym narzędziem do lepszego zrozumienia biologii GBM. Obrazowanie na żywo w mysich modelach PDX doprowadziło do cennych odkryć dotyczących tego, w jaki sposób GBM kolektywnie atakuje tkankę mózgową18. Jednak do tej pory rozdzielczość czasoprzestrzenna nie jest wystarczająco wysoka, aby ujawnić dynamikę białek kontrolujących inwazję GBM. Doszliśmy do wniosku, że poprzez sprzężenie ortoto...

Ruchliwość komórek to stereotypowy proces wymagający ustanowienia osi polaryzacji i rearanżacji cytoszkieletu generujących siłę. Polimeryzacja aktyny i jej związek z miozyną są uznawane za główne czynniki przyczyniające się do powstawania i kurczenia sił wymaganych do ruchu komórek1. Mikrotubule są uważane za głównych aktorów polaryzacji komórek i trwałości kierunkowej podczas migracji2. W ostatnich latach wykazano również, że MT tworzą i stabilizują wypukłości, aby wspierać siły mechanokompresyjne podczas inwazji komórek w 3D3. Ostatnio MT są bezpośrednio zaangażowane w mechanotransdukcję w zrostach ogniskowych i migrację mechanowrażliwą4. Niestabilność dynamiczna, która charakteryzuje dynamikę końcową MT-plus, składa się z powtarzających się faz polimeryzacji (wzrostu) i depolimeryzacji (skurczu), które są kontrolowane przez mnóstwo białek wiążących mikrotubule i wewnątrzkomórkowych kaskad sygnałowych, takich jak te regulowane przez RHO-GTPazy5,6,7. Rola sieci MT w migracji i inwazji komórek sprawiła, że badanie dynamiki MT stało się kluczowym elementem lepszego zrozumienia mechanizmów naprowadzania komórek odpornościowych, gojenia się ran i inwazji raka.
Zdolność komórek rakowych do ucieczki z rdzenia pierwotnego guza, rozprzestrzeniania się w tkankach i generowania wtórnych guzów jest kluczowym krokiem w zapobieganiu globalnemu sukcesowi w wojnie z rakiem ogłoszonej 50 lat temu8,9. Jedną z największych przeszkód było zrozumienie, w jaki sposób komórki rakowe aktywnie atakują tkankę. Kluczowe mechanizmy inwazji opierają się na tych samych zasadach, które rządzą migracją komórek nienowotworowych10. Pojawiły się jednak specyficzne aspekty migracji komórek nowotworowych11, co wywołało potrzebę lepszego scharakteryzowania tego typu migracji. W szczególności, ponieważ mikrośrodowisko guza wydaje się być kluczowym graczem w progresji raka12, obserwacja i analiza inwazji komórek rakowych w odpowiednim kontekście fizjologicznym jest niezbędna do rozwikłania mechanizmów rozprzestrzeniania się komórek rakowych.
MTs są kluczowe dla progresji raka, aby utrzymać zarówno proliferację, jak i inwazję. Precyzyjna analiza dynamiki MT in situ może pomóc w identyfikacji czynników zmieniających MT (MTA) w obu procesach. Dynamika MT zmienia się drastycznie w zależności od zmiany środowiska. In vitro leczenie środkami destabilizującymi MT, takimi jak nokodazol, zapobiega powstawaniu wypukłości komórek, gdy komórki są osadzone w żelach w 3D, podczas gdy ma niewielki wpływ na migrację komórek 2D13,14. Chociaż jest to wyzwanie techniczne, postępy w obrazowaniu przyżyciowym umożliwiają analizę in vivo dynamiki MT podczas inwazji komórek nowotworowych. Na przykład obserwacja MT w podskórnie ksenoprzeszczepowanych komórkach włókniakomięsaka u myszy ujawniła, że makrofagi związane z nowotworem wpływają na dynamikę MT w komórkach nowotworowych15. Jednak te mysie modele obejmują rozległe zabiegi chirurgiczne i pozostają niezadowalające w przypadku mniej dostępnych nowotworów, takich jak wysoce inwazyjny guz mózgu, GBM.
Pomimo fatalnego średniego czasu przeżycia wynoszącego 15 miesięcy16, niewiele wiadomo na temat sposobu rozprzestrzeniania się GBM w miąższu mózgu lub kluczowych elementów molekularnych podtrzymujących inwazję komórek GBM w tkance mózgowej. Udoskonalenie mysiego ortotopowego ksenoprzeszczepu (PDX) i ustanowienie okien czaszkowych stworzyło nowe perspektywy dla badań nad inwazją komórek GBM17,18. Jednak ze względu na nieoptymalną jakość obrazowania, model ten umożliwił głównie obrazowanie podłużne powierzchownych ksenoprzeszczepów i nie był dotychczas z powodzeniem stosowany do badania subkomórkowego obrazowania białek cytoszkieletu. Ponadto, w ślad za nakazem "3R" dotyczącym ograniczenia wykorzystywania gryzoni i zastąpienia ich niższymi kręgowcami, ustanowiono alternatywne modele.
Korzystając z pierwotnej odporności obserwowanej u larw danio pręgowanego (Danio rerio), opracowano ortotopowe wstrzykiwanie komórek GBM do mózgu ryby19,20,21. Wstrzyknięcie w okolice komór w rozwijającym się śródmózgowiu podsumowuje większość patofizjologii GBM u człowieka21, i obserwuje się ten sam preferowany wzorzec inwazji GBM, co w przypadku kooptacji naczynia ludzkiego22. Dzięki przezroczystości larw ryb, model ten pozwala na wizualizację komórek GBM atakujących mózg z obszarów okołokomorowych, w których uważa się, że powstaje większość GBM23.
Ponieważ MT są niezbędne do inwazji komórek GBM in vitro24,25, potrzebna jest lepsza charakterystyka dynamiki MT i identyfikacja kluczowych regulatorów podczas inwazji komórek. Jednak do tej pory dane wygenerowane za pomocą modelu ortotopowego danio pręgowanego nie obejmowały subkomórkowej analizy dynamiki MT podczas procesu inwazji. W artykule przedstawiono protokół badania dynamiki MT in vivo i określenia jej roli podczas inwazji raka mózgu. Po stabilnym znakowaniu mikrotubulami, komórki GBM są mikrowstrzykiwane z prędkością 3 dpf do mózgów larw danio pręgowanego i obrazowane w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej podczas ich progresji w tkance mózgowej. Obrazowanie na żywo fluorescencyjnych MT umożliwia jakościową i ilościową analizę dynamiki MT plus-end. Co więcej, model ten umożliwia ocenę wpływu MTA na dynamikę MT oraz na właściwości inwazyjne komórek GBM w czasie rzeczywistym. Ten stosunkowo nieinwazyjny protokół w połączeniu z dużą liczbą larw obsługiwanych jednocześnie i łatwością aplikacji leku (w wodzie dla ryb) sprawia, że model ten jest atutem w testach przedklinicznych.

<table><tbody><tr><td>Hodowla komórek glejaka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>modyfikowany Eagle's Medium</td><td>Odczynnik Eurobio</td><td>CM1MEM18-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>U-87 MG</td><td>ECACC</td><td>89081402-1VL</td><td>Komórki</td></tr><tr><td><silna>Produkcja lenitiwirusa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument BD FACSDiva software v8.0</td><td>BD bioscience</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>Merck</td><td>12022001</td><td>Cells</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td></td><td>Addgene Plasmid #12259</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Przenikanie i barwienie komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63493</td><td>Trypsyna chemiczna</td></tr><tr><td>EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Hodowla danio pręgowanego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny LEICA M165FC</td><td>LEICA</td><td>https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/</td> <td>Instrument</td></tr><tr><td>Hydrat błękitu metylenowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4159</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pipety do transportu chemicznego cienkie końcówki</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Transfer sprzętu</td></tr><tr><td> Pipety Duża Żarówka 3mL</td><td>Samco Scientific</td><td>225</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Trikaina (3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: A5040</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>woda źródłowa Volvic</td><td>DUTSCHER DOMINIQUE SAS</td><td></td> 999556 <td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Ksenotransplantacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego (1,0 ODx0,58IDx150L mm)</td> <td>Aparat Harvarda</td><td>(#30-0017 GC100-15</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz oleju CellTram vario</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td>Przyrząd Końcówki</td></tr><tr><td>do pipet do mikroładowania (Microloader) 20 i mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; 5242956003</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Sprzęt</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410-100ml</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>KL 2500 LCD</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Uniwersalny uchwyt kapilarny</td><td>Eppendorf</td><td>5176190002</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet</td><td>KOPF (Roucaire)</td><td>Model 720</td><td>Instrument</td></tr><tr><td><mocny>Intravital Obrazowanie</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm talerz do obrazowania wideo ze szklanym dnem</td><td>MatTek Life Sciences, MA, USA</td><td>P35G-1,5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pozyskiwania sprzętu: NIS-Elements-AR wersja 5.21</td><td></td><td>Blok</td>grzewczy oprogramowania Nikon <td></td></tr><tr><td></td><td>Techne</td><td>DRI-BLOCK DB-2D</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt Głowica mikroskopu Nikon Ti2E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>sCMOS kamera Prime 95B</td><td>Instrument fotometryczny</td><td></td><td>Kamera</td></tr><tr><td>sCMOS Orca Flash 4</td><td>Hammatsu</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Ultrapure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>dysk przędzalniczy Yokagawa CSU-W1 jednostka</td><td>Hammatsu</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Leczenie lekami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404-2MG</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td><silny>Analiza obrazu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.5.1 oprogramowanie</td><td>Oxford Oprogramowanie Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImarisFileConverter 9.5.1</td><td>Oprogramowanie Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Z fatalną medianą czasu przeżycia w rzeczywistych populacjach - od 6 do 15 miesięcy - glejak wielopostaciowy (GBM) jest najbardziej niszczycielskim złośliwym nowotworem mózgu. Niepowodzenie leczenia wynika głównie z inwazyjności komórek GBM, co przemawia za potrzebą lepszego zrozumienia właściwości ruchliwych GBM. Aby zbadać mechanizm molekularny wspierający inwazję GBM, potrzebne są nowe modele fizjologiczne umożliwiające dogłębną charakterystykę dynamiki białek podczas inwazji. Obserwacje te utorowałyby drogę do odkrycia nowych celów do blokowania infiltracji guza i poprawy wyników leczenia pacjentów. W artykule opisano, w jaki sposób ortotopowy ksenoprzeszczep komórek GBM w mózgu danio pręgowanego umożliwia subkomórkowe obrazowanie na żywo w trybie intrażyciowym. Koncentrując się na mikrotubulach (MT), opisujemy procedurę znakowania MT w komórkach GBM, mikroiniekcji komórek GBM do przezroczystego mózgu larw zebrygowanego danio pręgowanego 3 dni po zapłodnieniu (dpf), obrazowania przyżyciowego MT w rozsiewających ksenoprzeszczepach, zmiany dynamiki MT w celu oceny ich roli podczas inwazji GBM oraz analizy uzyskanych danych.

Aby przeanalizować rolę, jaką odgrywają mikrotubule (MT) podczas inwazji GBM in vivo, opisujemy tutaj główne etapy przeprowadzania stabilnego znakowania MT w komórkach GBM za pomocą infekcji lentiwirusowej, ortotopowej ksenotransplantacji komórek GBM do larw zebrafish w 3. dniu po zapłodnieniu (dpf), wysokorozdzielczego obrazowania intravitalnego dynamiki MT, traktowania MTA i jego wpływu na inwazję GBM, a także analizy obrazowej dynamiki MT i inwazji in vivo (Rysunek 1)<st...

Zgłaszamy technikę pozwalającą na obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka (GBM) atakujących tkankę mózgową kręgowców. Sprzężenie ortotopowego wstrzykiwania fluorescencyjnie znakowanych komórek GBM do przezroczystego mózgu danio pręgowanego z obrazowaniem przyżyciowym o wysokiej rozdzielczości umożliwia pomiar dynamiki cytoszkieletu podczas inwazji raka in situ.

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Metoda ta dedykowana jest do badania roli mikrotubul podczas inwazji raka mózgu poprzez sprzężenie atopowego wstrzykiwania komórek raka mózgu u danio pręgowanego z subkomórkowym obrazowaniem przyżyciowym. Główną zaletą tej techniki jest wysoka przestrzenna rozdzielczość czasowa, w której pozyskiwany jest cytoszkielet mikrotubul. Jest unikalny dla modeli inwazji raka mózgu in vivo i umożliwia dogłębną analizę dynamiki mikrotubul.Subkomórkowe obrazowanie in situ inwazji komórek raka mózgu może być wykorzystane do analizy dowolnego białka potencjalnie zaangażowanego w inwazję raka. Na początek umyj komórki glejaka hodowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza PBS. Odłącz komórki, dodając jeden mililitr 0,05% trypsyny EDTA i inkubując przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze komórkowym, aż wszystkie komórki zostaną całkowicie odłączone.Ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach kompletnej pożywki komórkowej glejaka w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Dodaj 45 mililitrów lodowatego PBS i wiruj w temperaturze 134 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki jednym mililitrem lodowatego PBS, dokładnie pipetując w górę iw dół.Dodaj kolejne 49 mililitrów lodowatego PBS i odwiruj w temperaturze 134 razy G przez pięć minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach lodowatego PBS. Przechowywać na lodzie przez czas trwania zabiegu przeszczepu.Aby mikrowstrzyknąć komórki glejaka do śródmózgowia larw danio pręgowanego, należy wypełnić odlewaną płytkę do mikroiniekcji sześcioma mililitrami pożywki E3 uzupełnionej 160 miligramami na litr tricainy. Przenieś tuzin larw DEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED do płytki do mikroiniekcji. Gdy larwa zostanie znieczulona i całkowicie przestanie reagować na dotyk, wyrównaj je w rowach na boku, głowa do góry, a woreczek żółtkowy dociśnij do ściany rowu za pomocą pędzla w rozmiarze 00.Następnie załaduj pięć mikrolitrów komórek glejaka do mikrokapilary za pomocą końcówek do mikroładowania i włóż kapilę do uniwersalnego uchwytu kapilary. Umieścić płytkę do mikroiniekcji zawierającą znieczulone larwy na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Umieść końcówkę mikrokapilary na granicy płytki mikroiniekcyjnej za pomocą pokręteł mikromanipulatora.Następnie rozbij go skalpelem, aby utworzyć ostry punkt wejścia mniej więcej wielkości średnicy komórki. Sprawdź, czy komórki wypływają z kapilary, delikatnie wpuszczając olej do mikrowstrzykiwacza i zanurzając końcówkę igły w pożywce. Skoncentruj komórki na końcu naczynia włosowatego, aby zmaksymalizować liczbę wstrzykiwanych komórek na wstrzykniętą objętość i unikaj wypełniania tkanki mózgowej PBS.Dokładnie zbadaj komórki wychodzące z mikrokapilary, gdy olej jest ręcznie wprowadzany do wtryskiwacza. Zdefiniuj empirycznie liczbę obrotów potrzebnych do wykonania pokrętła ręcznego, aby dostarczyć od 20 do 50 komórek. Zazwyczaj, jeśli komórki są wystarczająco skoncentrowane, wystarczy jeden delikatny obrót, aby wyrzucić około 10 komórek.Zbliż się do końcówki naczynia włosowatego w stosunku do lewej kości nerwu wzrokowego tuż nad środkową żyłą mózgową. Delikatnie dociśnij naczynia włosowate do larw, aż błona skórna pęknie. Po osiągnięciu odpowiedniej pozycji w tektum optycznym wysuń ogniwa.Uważnie obserwuj końcówkę naczynia włosowatego, aby uwidocznić strumień komórek wchodzących do wnętrza zwierzęcia, zapewniając w ten sposób udane wstrzyknięcie. Powtórz procedurę dla tylu zwierząt, ile jest to wymagane. W zależności od tego, jak szybko eksperymentator wstrzykuje, zmiana igły może być potrzebna co 10 do 20 larw z powodu szybkiego zlepiania się komórek w naczyniach włosowatych.Po zakończeniu przeszczepu ksenoterapii należy usunąć larwy z płytki do mikroiniekcji i umieścić je na 24-dołkowej płytce wypełnionej wodą mineralną PTU i pożywką z błękitu metylenowego. Przygotować 1% niskotopliwy roztwór AH-KROH. Przenieś 500 mikrolitrów ugotowanego 1% niskotopliwego roztworu AH-KROH do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i pozwól mu ostygnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bloku grzewczym.dodać 160 mikrogramów na litr tricainy do AH-KROHS i dobrze wymieszać. Przenieś od jednej do czterech ksenoprzeszczepowanych larw na 3,5-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną wodą mineralną PTU i pożywką metylenową uzupełnioną 160 mikrogramami na litr tricainy. Gdy larwy zostaną znieczulone i całkowicie przestaną reagować na dotyk, należy je ostrożnie przenieść do probówki zawierającej AH-KROHS i trikainę za pomocą pipety do przenoszenia z cienką końcówką.Delikatnie wymieszaj larwę z AH-KROHS. Za pomocą dużej pipety do przenoszenia bańki umieść larwy zmieszane w AH-KROHS na środku 3,5-centymetrowej naczynia do obrazowania wideo ze szklanym dnem Pod mikroskopem stereoskopowym szybko umieść larwy na grzbiecie. Za pomocą końcówki do mikroładowania usuń nadmiar AH-KROHS, aby zachować możliwie najcieńszą warstwę AH-KROHS.Po zestaleniu się AH-KROHS dodaj 2,5 mililitra podłoża do obrazowania. W celu obrazowania na żywo in vivo, dynamiki mikrotubul w inwazyjnych komórkach glejaka, należy umieścić miskę do obrazowania wideo zawierającą osadzone ksenoprzeszczepowane larwy AH-KROHS w komorze środowiskowej odwróconego mikroskopu konfokalnego o temperaturze ustawionej na 32 stopnie Celsjusza. Znajdź larwy w naczyniu do obrazowania wideo za pomocą obiektywu 10x, korzystając z zmotoryzowanego stolika XY.Naciśnij escape, aby opuścić wieżyczkę obiektywu i dolać oleju mineralnego do obiektywu z olejem 60x, a następnie naciśnij escape, aby wrócić do początkowej pozycji ogniskowej. Obserwuj atakujące komórki glejaka w czerwonym kanale ustawionym na źródło lasera 561 nanometrów, 20% mocy lasera i czas ekspozycji 200 milisekund. Następnie wybierz komórkę z rozproszoną siecią mikrotubul i łatwo rozróżnialnymi włóknami mikrotubul.Skonfiguruj ustawienia serii Z. Używając stolika piezoelektrycznego o zakresie 200 mikrometrów, wybierz górną i dolną pozycję sieci mikrotubul, w której wystarczy stos Z o głębokości od 10 do 30 mikrometrów, aby uwidocznić sieć mikrobiologiczną w występie migrującej komórki z krokiem warstwy Z wynoszącym 0,3 mikrometra. Ustaw ustawienia akwizycji poklatkowej, aby umożliwić optymalną równowagę między szybkością akwizycji, głębokością stosu Z i sygnałem fluorescencyjnym, aby uniknąć szybkiego wybielania zdjęć.Uzyskuj obrazy mikrotubul co pięć do 10 sekund przez kilka minut i zapisuj hiperstos 5D. Dynamikę mikrotubul mierzono, budując kimograf wzdłuż rosnących i kurczących się mikrotubul oraz ręcznie śledząc krawędzie poszczególnych mikrotubul w czasie. Leczenie farmakologiczne podawane w pożywce larwalnej i jego odwracalny wpływ na organizację sieci mikrotubul oceniano poprzez leczenie dawką 200 nanomolów nokodazolu.Doprowadziło to do postępującego kurczenia się sieci mikrotubul i zaniku wystających komórek glejaka po czterech godzinach. Wypłukanie leku przywróciło zdolność komórek glejaka do tworzenia wypukłości. Komórki wznowiły migrację wzdłuż układu krwionośnego 12 godzin po wypłukaniu, co wskazuje, że dawka 200 nanomoli nokodazolu była wystarczająca, aby przerwać sieć mikrotubul i szybko zablokować inwazję komórek glejaka in vivo.Trzydniowa analiza tego samego leczenia globalnej inwazji komórek glejaka wykazała, że nokodazol zatrzymał długotrwałą inwazję komórek glejaka in vivo, nie wpływając na ogólny stan zdrowia ryb w porównaniu z grupą kontrolną. Pamiętaj, aby zacząć od zdrowych larw trzy dni po zapłodnieniu, aby skoncentrować komórki w naczyniach włosowatych, zminimalizować objętość wstrzykiwaną do mózgu i utworzyć unikalną masę guza i starać się unikać wstrzykiwania do komór mózgu.

live-imaging-microtubule-dynamics-glioblastoma-cells-invading

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Chociaż obwodowy układ nerwowy (PNS) jest zdolny do znacznej naprawy po urazie, niewiele wiadomo o komórkowych i molekularnych mechanizmach rządzących tym zjawiskiem. Korzystając z żywego, transgenicznego danio pręgowanego i powtarzalnego testu przecięcia nerwów, możemy badać dynamiczne zachowania komórek glejowych podczas degeneracji i regeneracji nerwów.

Przekrój nerwu ruchowego i obrazowanie poklatkowe zachowań komórek glejowych u żywych danio pręgowanego

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Poznaj dynamikę mikrotubul w komórkach glejaka podczas inwazji mózgu danio pręgowanego. Ta metoda obrazowania na żywo umożliwia analizę cytoszkieletu z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną.

Obrazowanie na żywo dynamiki mikrotubul w komórkach glejaka atakujących mózg danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów