Name: Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Odkryj metodę bezinwazyjnego badania mechanobiologii jądra komórkowego z wykorzystaniem mikrokulek magnetycznych i obrazowania fluorescencyjnego. Technika ta pozwala analizować mechanosensing jądra oraz szlaki sygnałowe w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt jest finansowany przez UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. i Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) oraz UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Serdecznie dziękujemy za intelektualne dyskusje i wsparcie techniczne ze strony dr Jonathana Lichta (UFHCC), dr Rolfa Renne (UFHCC), dr Christophera Vulpe (UFHCC), dr Blanki Sharmy (BME), dr Marka Sheplaka (MAE i ECE), dr Daniela Ferrisa (BME), dr Malisy Sarntinoranont (MAE), dr Ashoka Kumara (MAE), dr Benjamina Keselowsky'ego (BME), dr Brenta Gila (RSC), dr Philipa Fenga (ECE), dr Gregory A. Hudalla (BME), dr Steven Ghivizzani (OSSM), dr Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), dr Roger Fillingim (CD-BS), dr Robert Caudle (OMS), dr John Neubert (DN-OR), dr Justin Hiliard (neurochirurgia), dr Tian He (Uniwersytet Harvarda), dr Youhua Tan (Politechnika w Hongkongu), dr Jessie L-S Au (Instytut Farmakologii Systemów Ilościowych), dr David Hahn (Uniwersytet Arizony), oraz zespół wsparcia firmy Nikon (dr Jose Serrano-Velez, dr Larry Kordon i dr Jon Ekman). Jesteśmy głęboko wdzięczni za skuteczne wsparcie ze strony wszystkich członków laboratoriów badawczych Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann i Guan oraz wszystkich pracowników Wydziału UF MAE.

1. Konserwacja komórek B2B zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9
<ol>
	<li>Hodowla komórek B2B w kolbie T25 z RPMI-1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną.</li>
	<li>Utrzymuj komórki B2B w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Subkulturuj komórki B2B, gdy zbieg osiąga 70% do 80%.</li>
	<li>Przechowuj linię komórkową B2B w pożywce hodowlanej RPMI-1640 z 10% (v/v) DMSO w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W eksperymentach należy używać komórek B2B o numerze przejścia mniejszym niż 10.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Wysiewaj komórki na szalce Petriego ze szklanym dnem.
	<ol>
		<li>Przenieś kolbę zawierającą komórki B2B z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z kolby za pomocą pipety zasysającej z podłączoną pompą próżniową.</li>
		<li>Przemyć kolbę 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). </li>
		<li>Usunąć PBS za pomocą pipety zasysającej.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml 0,05% roztworu trypsyny, aby oderwać komórki od dna podłoża kolby.</li>
		<li>Umieścić kolbę w inkubatorze na 5 minut.</li>
		<li>Przenieść kolbę do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 5 ml nowej pożywki hodowlanej do kolby i pipetować roztwór w górę i w dół.</li>
		<li>Umieścić 50 μl pożywki z komórkami (300 komórek/μl) na szalce Petriego ze szklanym dnem. Dodać 2 ml pożywki hodowlanej do szalki Petriego.</li>
		<li>Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze. Poczekaj 12 godzin, aż ogniwa się przyczepią.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj komórki za pomocą mikrokulek magnetycznych.
	<ol>
		<li>Odważyć 0,2 g mikrokulek karbonylożelaza o średniej średnicy 7 μm (zwanych dalej mikrogranulkami 7 μm, patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Za pomocą pipety zawiesić mikrogranulki w 1 ml pożywki hodowlanej RPMI-1640.</li>
		<li>Zanieś szalkę Petriego z komórkami B2B do szafy bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Dodać 200 μl pożywki zawierającej mikrogranulki do szalki Petriego. 
		UWAGA: Szybko dodaj pożywkę, aby uniknąć wytrącania się mikrogranulek.</li>
		<li>Umieść szalkę Petriego z powrotem w inkubatorze, aż mikrogranulki zostaną zinternalizowane przez komórki. Sprawdzaj internalizację co 6 godzin, aby określić optymalny czas internalizacji dla różnych linii komórkowych.</li>
		<li>Aby sprawdzić internalizację, wykonaj konfokalne obrazowanie fluorescencyjne, aby uwidocznić granicę mikrokulki, jądra i komórki. Jeśli mikrokulka zostanie zinternalizowana przez komórkę, znajdzie się w granicach komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wizualizacja jądra
<ol>
	<li>Ogrzewać 1,5 ml pożywki hodowlanej w inkubatorze przez 15 minut.</li>
	<li>Wyłącz światło w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Weź szalkę Petriego, która zawiera komórkę, podgrzaną pożywkę hodowlaną, barwienie jądrowe i HCl werapamilu do szafki bezpieczeństwa biologicznego. 
	UWAGA: Elementy do barwienia jądrowego są wrażliwe na światło. Unikaj ekspozycji na światło podczas pracy.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1000x barwienie jądrowe przez DMSO do 100x.</li>
	<li>Rozcieńczyć 100 mM Verapamil HCl przez DMSO do 10 mM.</li>
	<li>Dodaj 15 μl 100x barwienia jądrowego i 15 μl 10 mM HCl werapamilu do 1,5 ml pożywki hodowlanej. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z szalki Petriego. Dodać pożywkę zawierającą barwienie jądrowe do szalki Petriego.</li>
	<li>Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na ponad 2 godziny.</li>
</ol>
4. Przygotowanie sprzętu do przyłożenia siły magnetycznej
<ol>
	<li>Wydrukuj wszystkie części w 3D za pomocą akrylonitrylu-butadienu i styrenu (ABS) i zmontuj je zgodnie z projektem CAD (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Projekt CAD znajduje się w Tabeli Materiałów.</li>
	<li>Użyj taśmy dwustronnej, aby przymocować magnes do urządzenia poruszającego magnesem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Ustaw urządzenie poruszające magnesem obok stolika mikroskopu. Użyj trzech pokręteł, aby dostosować przestrzenne położenie magnesu, aż będzie mógł poruszać się nad szalką Petriego w zakresie od 13 mm do 120 mm. 
	UWAGA: Upewnij się, że górna granica odległości między magnesem a szalką Petriego jest jak największa, aby uniknąć niepożądanego przyłożenia siły do mikrokulek magnetycznych. 120 mm to maksymalna wartość w tej eksperymentalnej konfiguracji. Upewnij się, że magnes nie koliduje z częściami mikroskopu, w tym obiektywami i zmotoryzowanymi stolikami.</li>
	<li>Ustaw magnes w najwyższym położeniu z (na 120 mm).</li>
</ol>
5. Zastosowanie siły i obrazowanie żywych komórek
<ol>
	<li>Konfiguracja komory środowiskowej do obrazowania długoterminowego
	<ol>
		<li>Zastosuj 75% roztwór etanolu, aby dokładnie wysterylizować i wyczyścić komorę środowiskową.</li>
		<li>Umieść komorę środowiskową na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu odwróconego.</li>
		<li>Otwórz zbiornik CO2 i ustaw natężenie dopływu CO2 na 160 ml/min.</li>
		<li>Dostosuj temperaturę komory do 44 °C (góra), 42 °C (kąpiel) i 40 °C (Stage).</li>
		<li>Dodaj 20 ml oczyszczonej wody do kąpieli w komorze środowiskowej, aby utrzymać wilgotność 90%.</li>
		<li>Wyjąć szalkę Petriego ze szklanym dnem, która zawiera komórki docelowe, z inkubatora do hodowli tkankowych i umieścić ją w komorze</li>.
		<li>Zastosuj metalowy zacisk komory środowiskowej, aby ustalić pozycję szalki Petriego. 
		UWAGA: Szalka Petriego musi być mocno zaciśnięta w komorze, ponieważ siła magnetyczna może przesunąć szalkę, jeśli nie jest ona zaciśnięta.</li>
		<li>Zamknij pokrywę komory. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja parametrów obrazowania
	<ol>
		<li>Zoptymalizuj rozmiar otworka: Otwór blokuje nieostre fotony. Większy rozmiar otworka daje więcej nieostrych fotonów, ale jaśniejszy obraz. Mniejszy rozmiar otworka zapewnia bardziej ostry i ciemniejszy obraz. Upewnij się, że zoptymalizujesz rozmiar otworka, aby uzyskać ostre obrazy konfokalne z odpowiednim stosunkiem sygnału do szumu.</li>
		<li>Zoptymalizuj intensywność lasera: Intensywność lasera określa intensywność wzbudzenia, a tym samym emisji światła. Niska intensywność lasera zapewnia niski stosunek sygnału do szumu. Zbyt duże natężenie lasera spowoduje fotowybielanie. Dostosuj odpowiednio intensywność lasera.</li>
		<li>Zoptymalizuj rozmiar kroku i kroki: Kroki i rozmiar kroku określają, ile obrazów zajmie stos Z. Mniejsze rozmiary kroków i więcej kroków zwiększą rozdzielczość stosu Z, ale także zwiększą fotowybielanie. W tym eksperymencie zastosowano rozmiar kroku 1 μm dla komórek o wysokości komórki ~15 μm.</li>
		<li>Zoptymalizuj czas ekspozycji: Czas ekspozycji określa, jak długo komórka będzie wystawiona na działanie lasera wzbudzającego. Krótki czas ekspozycji zmniejszy stosunek sygnału do szumu. Długi czas naświetlania spowoduje fotowybielanie. W tym eksperymencie zastosowano czas naświetlania wynoszący 1 klatkę na 4 s.</li>
		<li>Optymalizacja parametrów obrazowania: Zmieniaj jeden z czterech parametrów iteracyjnie i utrzymuj spójność pozostałych parametrów. Za każdym razem zmierz współczynnik YAP N/C każdego obrazu i porównaj zmianę współczynnika YAP N/C, aby określić poziom fotowybielania. Powtarzaj proces optymalizacji, aż do uzyskania równowagi między stosunkiem sygnału do szumu, szybkością obrazowania i fotowybielaniem.</li>
		<li>Zdefiniuj konfiguracje obrazowania przy użyciu zoptymalizowanych parametrów obrazowania, aby przyspieszyć ustawienia obrazowania podczas eksperymentów. 
		UWAGA: Konfiguracje zastosowane w tym badaniu opisano w punkcie 5.3 parametrów obrazowania. Aby zoptymalizować parametry obrazowania konfiguracji w sekcji 5.3, należy zastosować tę samą metodę, co w kroku 5.2.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyłożenie małej siły i obrazowanie konfokalne 
	UWAGA: W tym badaniu do obrazowania użyto mikroskopu Nikon Ti2-E, a szczegółowe kroki pozyskiwania obrazu podano poniżej.
	<ol>
		<li>Otwórz odwrócony mikroskop. Otwórz aplikację Elements.</li>
		<li>Zdefiniuj konfigurację magnetic_find. Sprawdź tylko kanał FITC. Ustaw PMT HV = 70, Przesunięcie = 0, Natężenie lasera = 10. Ustaw szybkość skanowania na 1 klatkę na 2 s, klikając przycisk 1/2. Ustaw rozmiar otworka na 1.2 AU, klikając przycisk 1.2 AU. Ta konfiguracja zostanie użyta w kroku 5.3.5.</li>
		<li>Zdefiniuj konfigurację magnetic_YAP_Nucleus. Sprawdź kanał FITC. Ustaw PMT HV = 70, Przesunięcie = 0, Natężenie lasera = 10. Ustaw prędkość skanowania na 1 klatkę na 4 s, klikając przycisk 1/2. Ustaw rozmiar otworka na 1.2 AU, klikając przycisk 1.2 AU. Aby zobrazować granicę jądra i intensywność barwienia jądrowego, sprawdź kanał Cy5. Ustaw PMT HV = 70, Przesunięcie = 0, Natężenie lasera = 10. Rozmiar otworka jest zoptymalizowany pod kątem obrazowania 3D YAP. Nie klikaj ponownie przycisku 1.2 AU po sprawdzeniu kanału Cy5. Ta konfiguracja zostanie użyta w kroku 5.3.7.</li>
		<li>W razie potrzeby włącz DIA za pomocą Elements. Otwórz aplikację SpinView, użyj jasnego pola i dostosuj ostrość obiektu, aby uzyskać wyraźny obraz komórek z ostrością. Użyj obiektywu 10x, aby znaleźć odpowiednie wiele pojedynczych komórek w trzech warunkach: z pojedynczą mikrokulką w środku, z wieloma mikrokulkami w środku i bez żadnej mikrokulki w środku. Przełącz się na obiektyw 40x. Nazwij to stanowisko, podając odpowiedni numer stanowiska.</li>
		<li>Otwórz Elementy. Kliknij magnetic_find. Kliknij przycisk Usuń blokadę.</li>
		<li>Kliknij przycisk Skanuj i dostosuj pozycję Z płaszczyzny ogniskowej. Kliknij przyciski Góra i Dół, aby ustawić dolny i górny limit stosu Z zaznaczonych komórek. Zatrzymaj skanowanie, klikając ponownie przycisk Skanuj.</li>
		<li>Przełącz się na konfigurację magnetic_YAP_Nucleus. Ustaw nazwę pliku na before_small_force.nd2. Kliknij przycisk Uruchom z nagranym stosem Z.</li>
		<li>Przełącz się na właściwą ścieżkę światła i włącz DIA. Otwórz SpinView i kliknij przycisk Nagrywanie. W międzyczasie przekręć pokrętło urządzenia poruszającego magnes, aby przesunąć magnes w dół do 46 mm nad dnem szalki Petriego. Zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu. Sprawdź wideo, aby potwierdzić, że mikrokulki wykazują przemieszczenie wywołane siłą magnetyczną.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.3.5-5.3.7; ustaw nazwę pliku na after_small_force.nd2.</li>
		<li>Przełącz się na właściwą ścieżkę światła i włącz DIA. Następnie otwórz SpinView i kliknij przycisk Nagrywanie. W międzyczasie obróć pokrętło urządzenia poruszającego magnes, aby przesunąć magnes do 120 mm nad dnem szalki Petriego. Zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.3.5-5.3.7 i ustaw nazwę pliku na before_large_force.nd2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyłożenie dużej siły i obrazowanie konfokalne
	<ol>
		<li>Zdejmij pokrywę komory środowiskowej, aby magnes sięgał 13 mm ponad dno szalki Petriego.</li>
		<li>Przełącz się na właściwą ścieżkę światła i włącz DIA. Otwórz SpinView i kliknij przycisk Nagrywanie. W międzyczasie obróć pokrętło urządzenia poruszającego magnes, aby przesunąć magnes w dół do 13 mm nad dnem szalki Petriego. Zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu. Sprawdź wideo, aby potwierdzić, że mikrokulki wykazują przemieszczenie wywołane siłą magnetyczną.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.3.5-5.3.7 i ustaw nazwę pliku na after_large_force.nd2.</li>
		<li>Przełącz się na właściwą ścieżkę światła i włącz DIA. Następnie otwórz SpinView i kliknij przycisk Nagrywanie. W międzyczasie obróć pokrętło urządzenia poruszającego magnes, aby przesunąć magnes do 120 mm nad dnem szalki Petriego. Zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.3.5-5.3.7 i ustaw nazwę pliku na retract_large_force.nd2.</li>
		<li>Zamknij pokrywę komory środowiskowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 5.2 i 5.3 dla wielu pól widoku, aby w razie potrzeby uzyskać więcej danych.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazów i analiza danych
<ol>
	<li>Kwantyfikacja wskaźnika YAP N/C
	<ol>
		<li>Otwórz Fiji ImageJ. Otwórz obrazy .nd2 zrobione w kroku 5.</li>
		<li>Kliknij Analizuj > ustaw pomiary. Sprawdź obszar, zintegrowaną gęstość, średnią wartość szarości i deskryptory kształtu.</li>
		<li>Użyj kanału Cy5, aby zidentyfikować jądro. Kliknij Zaznaczanie odręczne, aby użyć narzędzia do swobodnego zaznaczania w celu obrysowania jądra. Sprawdź również makro automatycznej maski nuklearnej w ImageJ (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Kliknij opcję Analizuj > Mierz w kanale FITC. Zmierzona wartość średniej jest średnią intensywnością jądrową YAP DN.</li>
		<li>Użyj kanału Cy5, aby zidentyfikować jądro. Użyj kanału FITC, aby zidentyfikować komórkę. Kliknij opcję Zaznaczanie odręczne, aby użyć narzędzia do swobodnego zaznaczania w celu wybrania interesującego obszaru w cytoplazmie i uniknięcia mikrokulki magnetycznej. Ten obszar zainteresowania nie może obejmować jądra.</li>
		<li>Kliknij opcję Analizuj > Mierz w kanale FITC. Zmierzona wartość średniej to średnia intensywność cytoplazmatycznego YAP DC.</li>
		<li>Obliczyć stosunek YAP N/C = DN / DC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja kształtu jądra i znormalizowana intensywność barwienia jądrowego
	<ol>
		<li>Otwórz Fiji ImageJ. Otwórz obrazy .nd2 zrobione w kroku 5.</li>
		<li>Kliknij Analizuj > ustaw pomiary. Sprawdź obszar, zintegrowaną gęstość, średnią wartość szarości i deskryptory kształtu.</li>
		<li>Użyj kanału Cy5, aby zidentyfikować jądro. Kliknij Zaznaczanie odręczne, aby użyć narzędzia do swobodnego zaznaczania w celu obrysowania jądra.</li>
		<li>Kliknij Analizuj > mierz w kanale Cy5. Zmierzona wartość średniej to intensywność barwienia jądrowego. Zmierzona wartość Circ. jest jądrowy obieg zamknięty.</li>
		<li>Aby porównać intensywność plamy jądrowej w różnych stanach siły, cała intensywność plamy jądrowej jest dzielona przez intensywność plamy jądrowej w "before_small_force.nd2", aby wygenerować znormalizowaną intensywność plamy jądrowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Internalizacja mikrokulek magnetycznych (sekcja 2.2) ma kluczowe znaczenie, ponieważ mikrogranulki zewnątrzkomórkowe nie mogą wywierać siły bezpośrednio na jądro. Przyłożenie siły i obrazowanie (sekcja 5.3) są krytycznymi etapami tego eksperymentu, a siła potrzebna do deformacji jądra i wywołania znaczących konsekwencji biologicznych może być zależna od próbki. Wielkość siły w tym eksperymencie (0,8 nN i 1,4 nN) może być jeszcze większa, aby uruchomić mechano-wykrywanie jądra w mniej wrażliwych komórkach.
<p class="j...

To badanie ma na celu opracowanie i zastosowanie nowej techniki do wyjaśnienia mechanobiologii jądra poprzez połączenie magnetycznych siłowników, które przykładają siłę mechaniczną bezpośrednio do jądra komórkowego i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej, która jednocześnie obrazuje strukturalne i funkcjonalne zmiany subkomórkowe. Komórki wyczuwają zewnątrzkomórkowe sygnały biofizyczne, w tym sztywność tkanki1,2,3,4, ciśnienie płynu śródmiąższowego i naprężenie ścinające5,6,7, topologia powierzchni/geometria8,9,10,11,12, oraz naprężenie rozciągające/ściskające13,14,15,16. Sygnały biofizyczne są przekształcane w sygnały biochemiczne i wywołują potencjalne zmiany w ekspresji genów i zachowaniu komórek - proces znany jako mechanotransdukcja17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Aby badać procesy mechanotransdukcji, opracowano niezliczone techniki wywierania siły mechanicznej na komórki, takie jak mikroskopia sił atomowych28, urządzenie do rozciągania komórek29, bio-MEMS (systemy mikroelektromechaniczne) czujnik siły15,30,31, reologia ścinania32 i Stereo Vision System33. Niedawny przegląd podsumowuje podejścia do stosowania zewnątrzkomórkowych sygnałów mechanicznych i zakłócania mechanosensingu34. Do tej pory większość tych metod wywiera siłę na błonę plazmatyczną komórki, a komórki bezpośrednio odbierają te zewnątrzkomórkowe sygnały biofizyczne za pośrednictwem receptorów błonowych, takich jak integryna, kadheryna, kanały jonowe i receptory sprzężone z białkiem G. Następnie przekazują sygnał do wewnątrzkomórkowego cytoszkieletu i jądra. Na przykład, wykorzystując translokację białka związanego z tak (YAP) jako wskaźnik wykrywania mechanicznego, wykazano, że komórki wyczuwają mechaniczne sygnały sztywności substratu i napięcia zewnątrzkomórkowego z błony komórkowej i przekazują je przez cytoszkielet do jądra w celu wywołania translokacji cytoplazmy YAP do jądra28,35.
Ostatnie dowody sugerują, że jądro komórkowe samo w sobie jest niezależnym czujnikiem mechanicznym8,36,37. Dowodzi tego eksperymenty przeprowadzone na wyizolowanym jądrze pobranym z komórek, w których wykazano, że jądra adaptacyjnie zmieniają swoją sztywność w odpowiedzi na siłę mechaniczną przyłożoną bezpośrednio do nich36. W wielu stanach fizjologicznych jądra zarówno w komórkach nowotworowych, jak i zdrowych wyczuwają zewnątrzkomórkowe sygnały biofizyczne i zmieniają swoje właściwości mechaniczne i złożenia38,39,40. Na przykład po wynaczynieniu sztywność jądrowa komórek nowotworowych zmniejsza się i utrzymuje miękkość przez ponad 24 h38. Podczas migracji przez ograniczoną przestrzeń śródmiąższową jądra komórek nowotworowych często tracą i odzyskują swoją integralność strukturalną39. Jednak sposób, w jaki jądro wyczuwa sygnał biofizyczny, jest nieznany, chociaż stwierdzono, że zaangażowanych jest kilka białek otoczki jądrowej i rodzin białek, takich jak Lamin A/C i łącznik nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC) complex38,41. W związku z tym nowe nieinwazyjne metody, które mogą bezpośrednio przyłożyć siłę do jądra, rozprzęgną efekt przenoszenia siły z błony komórkowej i cytoszkieletu plazmatycznego oraz pomogą wyjaśnić wcześniej niedostępne mechanizmy molekularne mechanodetekcji jądrowej.
Badania, które wykorzystywały pęsetę optyczną do manipulowania organellami42 i mikrogranulki wstrzyknięte do komórek43 wykazały technologiczną zdolność bezpośredniego oddziaływania siły na jądro. Jednak technika pęsety optycznej ma kilka ograniczeń: (1) pęseta optyczna o niskiej przepustowości często manipuluje tylko jedną komórką lub mikrokulką na raz; oraz (2) potencjalne fotouszkodzenia i deformacje artefaktów temperaturowych jądra wymagają dziesiątek pN36, a odpowiednia niezbędna moc lasera wynosi około 10 mW na pN44,45. Taka intensywność lasera jest wystarczająca, aby wywołać fotouszkodzenia w komórkach i zakłócić funkcje komórek podczas eksperymentu46.
Siła magnetyczna przyłożona przez mikrogranulki w żywych komórkach pokazuje potencjał do bezpośredniego przyłożenia siły do jądra i pokonuje ograniczenia pęsety optycznej. Gdy mikrogranulki zostaną dostarczone do cytoplazmy, pole magnetyczne może wywierać siłę magnetyczną na wiele mikrokulek jednocześnie w sposób wysokoprzepustowy. Pole magnetyczne nie wpływa na funkcje komórki47, ale generuje siłę od pN do nN, która wystarcza do wywołania deformacji jądrowej36,48,49. Do tej pory manipulacja mikrogranulkami magnetycznymi była stosowana na błonie komórkowej plazmatycznej48, wewnątrz cytoplazmy50, na F-aktynie51, wewnątrz jądra47, a na izolowanym jądrze36. Jednak manipulacja magnetyczna mikrokulkami nigdy nie została wykorzystana do przyłożenia bezpośredniej siły mechanicznej do otoczki jądrowej w celu zbadania mechanotransdukcji w jądrze.
W tym artykule opracowano prostą technikę nieinwazyjnego dostarczania mikrokulek magnetycznych do cytoplazmy i używania tych mikrokulek do wywierania siły mechanicznej na jądro (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W tym przypadku do walidacji metody wykorzystano zmodyfikowane przez CRISPR/Cas9 ludzkie normalne linie komórkowe B2B, które endogennie eksprymują mNeonGreen21-10/11-taged YAP. YAP jest białkiem wrażliwym na mechano, a translokacja YAP jest regulowana przez mechano-sensing jądrowy14,28. Podejście knock-in regulowane przez CRISPR/Cas9 zostało wybrane do oznaczania endogennego YAP białkiem fluorescencyjnym (FP) mNeonGreen21-10/11. Chociaż wiadomo, że edycja CRISPR ma niepełną wydajność i efekt niezamierzony, protokoły w poprzednich publikacjach integrowały sortowanie fluorescencyjne w celu wybrania prawidłowego wstawiania ramki odczytu otwartego52,53,54. Dzięki tej dodatkowej warstwie selekcji nie zaobserwowano żadnego zdarzenia tagowania poza celem w 20+ wcześniej wygenerowanych liniach komórkowych52,53,54,55. Jest to rozszczepiony konstrukt białka fluorescencyjnego, ale w zasadzie każdy wyrażalny znacznik fluorescencyjny może być użyteczny. Takie podejście do znakowania jest lepsze od metod transgenowych lub przeciwciał. Po pierwsze, w przeciwieństwie do ekspresji transgenu, znakowane białko utrzymuje dawkę pojedynczej kopii genu i ulega ekspresji w fizjologicznym kontekście natywnej sieci regulacyjnej genów, ograniczając odchylenia w stężeniu, lokalizacji i interakcji białka. Metoda tagowania zastosowana w tym badaniu osiąga o ponad rząd wielkości wyższą przepustowość i wydajność niż pełne znakowanie FP. Pozwala to również uniknąć wyzwań związanych z immunofluorescencją spowodowanych artefaktami wiązania i ograniczoną dostępnością wysokiej jakości przeciwciał o wysokiej swoistości. Po drugie, podejście zastosowane w tym artykule minimalizuje zakłócenia w fizjologii komórki i umożliwia autentyczne ujawnienie w czasie rzeczywistym wszystkich endogennych YAP. W przeciwieństwie do tego, inne popularne metody transgenowe często prowadzą do nadekspresji YAP. Wynikająca z tego sztuczna dystrybucja może potencjalnie powodować cytotoksyczność i wpływać na mechano-wykrywanie komórek56,57,58.
To badanie przedstawia protokół bezpośredniego przykładania siły do jądra za pomocą magnetycznych mikrokulek dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego przeprowadzania obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek. Podsumowując, przedstawione tutaj protokoły pokazują, jak (1) dostarczać mikrogranulki magnetyczne do komórki na zewnątrz jądra, (2) manipulować mikrokulkami w celu przyłożenia siły magnetycznej do jądra, (3) wykonywać konfokalne obrazowanie fluorescencyjne komórek podczas manipulacji oraz (4) ilościowo analizować stosunek jądra YAP do cytoplazmy (N / C) w całym procesie przyłożenia siły. Wyniki sugerują, że (1) poprzez endocytozę mikrogranulki magnetyczne mogą być nieinwazyjnie dostarczane do cytoplazmy komórek B2B w ciągu 7 godzin (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3); oraz (2) sama w sobie określona ilościowo siła magnetyczna przyłożona bezpośrednio do jądra (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4, <silna klasa = "xfig" > Rysunek 5 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 6) mogą wywołać różne zmiany stosunku YAP N/C w komórkach B2B zaprojektowanych przez CRISPR/Cas9 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 8).

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsyna</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 kolba</td><td>Corning</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>7-&micro; m mikrokulki karbonylowo-żelazowe o średniej średnicy</td><td></td><td></td>: <td>nie</td></tr> dotyczy <tr><td>Nie dotyczy A1R System konfokalny</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbonylowo-żelazowy w proszku CM</td><td>BASF</td><td>30042253</td><td>Mikrokulki magnetyczne</td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana (RPMI-1640)</td><td>Komputer</td><td></td> stacjonarny Gibco 11875093 <td></td></tr> Dell <tr><td></td><td></td><td>z systemem operacyjnym Windows 10</td>Komora środowiskowa TIZB <td></td></tr><tr><td></td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia i Laboratorium Oprzyrządowania</td><td></td><td></td>Optycznego i Obliczeniowego</tr><tr><td>Szalka Petriego ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Magnes</td><td>K& J Magnetics, Inc.</td><td>D99-N52</td><td></td></tr><tr><td>Monochromatyczny&nbsp; Aparat</td><td></td><td>FLIR BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>PLATFORMA OPROGRAMOWANIA NIS-Elements</td><td>Platforma oprogramowania</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Maska Nucleus Maska makro</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/Nuclear</td></tr><tr><td>ImageJ NucSpot Live 650</td><td>Biotium</td><td>#40082</td><td>Barwnik jądrowy</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fosforanem sól fizjologiczna (PBS)</td>Mikroskop odwrócony <td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ti2-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XYZ mover (pliki CAD)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover</td></tr></tbody></table>

połączenie siłownika siły magnetycznej 3d i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology

Fundamentalnym pytaniem w mechanobiologii jest to, jak żywe komórki odbierają zewnętrzne bodźce mechaniczne w kontekście fizjologii i patologii komórki. Uważa się, że mechano-odczucie zewnątrzkomórkowe bodźców mechanicznych odbywa się za pośrednictwem receptorów błonowych, powiązanego kompleksu białkowego i cytoszkieletu. Ostatnie postępy w mechanobiologii pokazują, że jądro komórkowe w cytoplazmie samo w sobie może niezależnie odczuwać bodźce mechaniczne jednocześnie. Brakuje jednak mechanistycznego zrozumienia, w jaki sposób jądro komórkowe wyczuwa, przekształca i reaguje na bodźce mechaniczne, głównie z powodu wyzwań technicznych związanych z dostępem i ilościowym określeniem mechaniki jądra za pomocą konwencjonalnych narzędzi. W artykule opisano projekt, produkcję i wdrożenie nowego siłownika siły magnetycznej, który stosuje precyzyjne i nieinwazyjne bodźce mechaniczne 3D do bezpośredniego deformowania jądra komórkowego. Wykorzystując komórki zmodyfikowane za pomocą CRISPR/Cas9, badanie to pokazuje, że narzędzie to, w połączeniu z konfokalnym obrazowaniem fluorescencyjnym o wysokiej rozdzielczości, umożliwia ujawnienie w czasie rzeczywistym dynamiki mechano-wrażliwego białka związanego z tak (YAP) w pojedynczych komórkach w funkcji deformacji jądra. Ta prosta metoda ma potencjał, aby wypełnić obecną lukę technologiczną w społeczności mechanobiologii i dostarczyć odpowiedzi na lukę w wiedzy, która istnieje w związku między mechanotransdukcją jądra a funkcją komórki.

Projekt urządzenia do przesuwania magnesu i zastosowanie siły magnetycznej 
W celu przyłożenia siły do jądra komórkowego za pomocą magnetycznych mikrokulek, zaprojektowano i zbudowano urządzenie do przesuwania magnesu, które pozwala kontrolować jego pozycję przestrzenną. Urządzenie do przesuwania magnesu składa się z centralnej ramy, trzech pokręteł oraz szyn umożliwiających niezależne przesuwanie przymocowanego magnesu w kierunkach x, y i z z rozdzielczością przestrzenną 1,59 mm na cykl (<strong clas...

To badanie przedstawia nowy protokół bezpośredniego przykładania siły mechanicznej do jądra komórkowego za pomocą mikrokulek magnetycznych dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.

Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

A fundamental question in mechanobiology is how living cells sense extracellular mechanical stimuli in the context of cell physiology and pathology. The ...

W tej metodzie siła jest bezpośrednio przykładana do jądra. Powoduje to rozprzęgnięcie efektu przenoszenia siły z błony komórkowej i cytoszkieletu, ujawniając mechanizmy molekularne mechanodetekcji jądrowej. Siła jest przykładana do żywych komórek w sposób nieinwazyjny.W porównaniu z pęsetą optyczną, pole magnetyczne i siła magnetyczna nie wpływają na funkcje komórki i mają większą przepustowość. Rozpocznij hodowlę komórek za pomocą mikrokulek magnetycznych, ważąc 0,2 grama mikrokulek karbonylowo-żelazowych o średniej średnicy siedmiu mikrometrów. Zawiesić mikrogranulki w jednym mililitrowym pożywce hodowlanej RPMI 1640 za pomocą pipety.Następnie przenieś szalkę Petriego z komórkami B2B do szafki bezpieczeństwa biologicznego i szybko dodaj 200 mikrolitrów pożywki zawierającej mikrogranulki do szalki Petriego. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze, aż mikrogranulki zostaną zinternalizowane przez komórki. Otwórz odwrócony mikroskop i za pomocą konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego określ optymalny czas internalizacji linii komórkowych co sześć godzin, wizualizując granicę mikrokulki, jądra i komórki.Zinternalizowane mikrogranulki będą obecne w granicach komórki. W przypadku aplikacji z małą siłą i obrazowania na żywo otwórz aplikację Elements. Aby zdefiniować konfigurację wyszukiwania magnetycznego, kliknij przycisk jeden na dwa, aby ustawić szybkość skanowania na jedną klatkę na dwie sekundy.Ustaw rozmiar otworka na 1.2 Jednostka Airy. Sprawdź tylko kanał FITC i ustaw PMT HV na 70, przesunięcie na zero, intensywność lasera na 10. Aby zdefiniować konfigurację jądra magnetycznego YAP, ustaw prędkość skanowania na jedną klatkę na cztery sekundy, klikając przycisk jeden na cztery.Następnie kliknij przycisk 1.2 Airy unit, aby ustawić rozmiar otworka na 1.2 Airy unit i sprawdź kanał FITC. Ustaw PMT HV na 70, przesunięcie na zero, intensywność lasera na 10. Aby zobrazować granicę jądra i intensywność barwienia jądrowego, sprawdź kanał cyjaniny 5.Nie klikaj przycisku jednostki 1.2 Airy i ustaw PMT HV na 70, przesunięcie na zero i intensywność lasera na 10. Rozmiar otworka zostanie zoptymalizowany pod kątem trójwymiarowego obrazowania białek związanych z TAK. Następnie włącz DIA za pomocą Elements.Otwórz widok wirowania, użyj jasnego pola i dostosuj ostrość obiektu, aby uzyskać wyraźny, ostry obraz komórek. Użyj obiektywu 10X, aby znaleźć odpowiednie wiele pojedynczych komórek w trzech warunkach, takich jak komórka z pojedynczą mikrokulką w środku, z wieloma mikrokulkami w środku i bez żadnej mikrokulki w środku. Następnie przełącz się na obiektyw 40X i nazwij tę pozycję odpowiednim numerem pozycji.Otwórz Elementy, kliknij Znajdź magnetyczne, usuń blokadę, a następnie zeskanuj karty, a następnie wybierz górny i dolny przycisk, aby dostosować pozycję Z płaszczyzny ogniskowej w celu ustawienia dolnego i górnego limitu stosu Z wybranych komórek. Zatrzymaj skanowanie, klikając ponownie przycisk Skanuj. Przełącz się na konfigurację jądra magnetycznego YAP i ustaw nazwę pliku na before_small_force.nd2.Kliknij przycisk uruchamiania z nagranym stosem Z. Przełącz się na prawą ścieżkę światła i włącz DIA. Otwórz widok wirowania i kliknij przycisk nagrywania.Przesuń magnes na 46 milimetrów nad dnem szalki Petriego, obracając pokrętło urządzenia do poruszania magnesem. Zapisz i sprawdź wideo, aby potwierdzić przemieszczenie mikrogranulek wywołane siłą magnetyczną. Powtórz procedurę skanowania, ustawiając nazwę pliku na after_small_force.nd2.Następnie przełącz się na prawą ścieżkę światła, włącz DIA i otwórz widok wirowania przed kliknięciem przycisku nagrywania. Zakręć pokrętłem urządzenia do przesuwania magnesu do 120 milimetrów nad dnem szalki Petriego i zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu. Powtórz kroki skanowania, ustawiając nazwę pliku na before_large_force.nd2.Mikrokulki nie mogą emitować fluorescencji pod wpływem wzbudzenia laserowego w kanale FITC lub cyjaniny 5. W ten sposób zinternalizowane mikrogranulki zostały zidentyfikowane przez ciemne zagłębienie znajdujące się w obrazowaniu konfokalnym fluorescencji białka i jądra związanego z YES. Obiegowość jądrowa nie wykazała znaczącej różnicy między komórkami kontrolnymi a komórkami z internalizacją mikrokulek.Stosunek jądra komórkowego białka do cytoplazmy związany z YES w komórkach kontrolnych hodowanych wspólnie z mikrokulkami, ale bez internalizacji oraz komórek z internalizacją mikrokulek również nie wykazał istotnej różnicy. Deformacja jądra i depolimeryzacja aktyny były spowodowane siłą ściskającą wywieraną przez mikrogranulki w komórkach zawierających cytoszkielet. Krzywa kalibracji analizy obrazowania ilościowego zapewniona przez ilościową zależność siły przemieszczenia AFM.Na podstawie tej zależności oszacowano siłę przyłożoną do koralików. Deformację jądra i translokację białka związaną z YES obserwowano po zastosowaniu lub uwolnieniu siły magnetycznej. Zmiany intensywności białka związanego z YES w kanale zielonym i brak zmian w barwieniu jądra w kanale czerwonym potwierdziły, że deformacja jądrowa wywołana siłą magnetyczną wywołana translokacją białka związanego z YES.Kwantyfikacja zmiany netto stosunku jądra białka do cytoplazmy związanej z YES w dwóch grupach potwierdziła, że siła magnetyczna przyłożona do mikrogranulek w cytoplazmie indukowała translokację białka związanego z YES i zmieniała stosunek jądra białka do cytoplazmy związanej z YES. Przed przyłożeniem siły i obrazowaniem upewnij się, że komórki zinternalizowały mikrokulki magnetyczne, a kulki znajdują się w granicach komórki.

combining-3d-magnetic-force-actuator-multi-functional-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Przedstawiamy dwa niezależne narzędzia oparte na mikroskopii, służące do pomiaru indukowanych odkształceń jądra i cytoszkieletu w pojedynczych, żywych komórkach przylegających w odpowiedzi na globalne lub lokalne przyłożenie naprężenia. Techniki te są wykorzystywane do określenia sztywności jądra (tj. odkształcalności) oraz do badania wewnątrzkomórkowej transmisji sił pomiędzy jądrem a cytoszkieletem.

Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Ostatnio opracowano wiele biosensorów siły opartych na FRET, które umożliwiają specyficzne dla białek rozwiązywanie siły wewnątrzkomórkowej. W tym protokole pokazujemy, w jaki sposób jeden z tych czujników, zaprojektowany dla łącznika białka kompleksu nukleoszkielet-cytoszkielet (LINC) Nesprin-2G, może być wykorzystany do pomiaru sił aktomiozyny w jądrowym kompleksie LINC.

Protokół wykorzystania biosensorów Förster Resonance Energy Transfer (FRET) do pomiaru sił mechanicznych w jądrowym kompleksie LINC

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Odkryj metodę bezinwazyjnego badania mechanobiologii jądra komórkowego z wykorzystaniem mikrokulek magnetycznych i obrazowania fluorescencyjnego. Technika ta pozwala analizować mechanosensing jądra oraz szlaki sygnałowe w żywych komórkach.

Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

Przeglądaj więcej filmów