July 5th, 2022
To badanie przedstawia nowy protokół bezpośredniego przykładania siły mechanicznej do jądra komórkowego za pomocą mikrokulek magnetycznych dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.
W tej metodzie siła jest bezpośrednio przykładana do jądra. Powoduje to rozprzęgnięcie efektu przenoszenia siły z błony komórkowej i cytoszkieletu, ujawniając mechanizmy molekularne mechanodetekcji jądrowej. Siła jest przykładana do żywych komórek w sposób nieinwazyjny.
W porównaniu z pęsetą optyczną, pole magnetyczne i siła magnetyczna nie wpływają na funkcje komórki i mają większą przepustowość. Rozpocznij hodowlę komórek za pomocą mikrokulek magnetycznych, ważąc 0,2 grama mikrokulek karbonylowo-żelazowych o średniej średnicy siedmiu mikrometrów. Zawiesić mikrogranulki w jednym mililitrowym pożywce hodowlanej RPMI 1640 za pomocą pipety.
Następnie przenieś szalkę Petriego z komórkami B2B do szafki bezpieczeństwa biologicznego i szybko dodaj 200 mikrolitrów pożywki zawierającej mikrogranulki do szalki Petriego. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze, aż mikrogranulki zostaną zinternalizowane przez komórki. Otwórz odwrócony mikroskop i za pomocą konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego określ optymalny czas internalizacji linii komórkowych co sześć godzin, wizualizując granicę mikrokulki, jądra i komórki.
Zinternalizowane mikrogranulki będą obecne w granicach komórki. W przypadku aplikacji z małą siłą i obrazowania na żywo otwórz aplikację Elements. Aby zdefiniować konfigurację wyszukiwania magnetycznego, kliknij przycisk jeden na dwa, aby ustawić szybkość skanowania na jedną klatkę na dwie sekundy.
Ustaw rozmiar otworka na 1.2 Jednostka Airy. Sprawdź tylko kanał FITC i ustaw PMT HV na 70, przesunięcie na zero, intensywność lasera na 10. Aby zdefiniować konfigurację jądra magnetycznego YAP, ustaw prędkość skanowania na jedną klatkę na cztery sekundy, klikając przycisk jeden na cztery.
Następnie kliknij przycisk 1.2 Airy unit, aby ustawić rozmiar otworka na 1.2 Airy unit i sprawdź kanał FITC. Ustaw PMT HV na 70, przesunięcie na zero, intensywność lasera na 10. Aby zobrazować granicę jądra i intensywność barwienia jądrowego, sprawdź kanał cyjaniny 5.
Nie klikaj przycisku jednostki 1.2 Airy i ustaw PMT HV na 70, przesunięcie na zero i intensywność lasera na 10. Rozmiar otworka zostanie zoptymalizowany pod kątem trójwymiarowego obrazowania białek związanych z TAK. Następnie włącz DIA za pomocą Elements.
Otwórz widok wirowania, użyj jasnego pola i dostosuj ostrość obiektu, aby uzyskać wyraźny, ostry obraz komórek. Użyj obiektywu 10X, aby znaleźć odpowiednie wiele pojedynczych komórek w trzech warunkach, takich jak komórka z pojedynczą mikrokulką w środku, z wieloma mikrokulkami w środku i bez żadnej mikrokulki w środku. Następnie przełącz się na obiektyw 40X i nazwij tę pozycję odpowiednim numerem pozycji.
Otwórz Elementy, kliknij Znajdź magnetyczne, usuń blokadę, a następnie zeskanuj karty, a następnie wybierz górny i dolny przycisk, aby dostosować pozycję Z płaszczyzny ogniskowej w celu ustawienia dolnego i górnego limitu stosu Z wybranych komórek. Zatrzymaj skanowanie, klikając ponownie przycisk Skanuj. Przełącz się na konfigurację jądra magnetycznego YAP i ustaw nazwę pliku na before_small_force.nd2.
Kliknij przycisk uruchamiania z nagranym stosem Z. Przełącz się na prawą ścieżkę światła i włącz DIA. Otwórz widok wirowania i kliknij przycisk nagrywania.
Przesuń magnes na 46 milimetrów nad dnem szalki Petriego, obracając pokrętło urządzenia do poruszania magnesem. Zapisz i sprawdź wideo, aby potwierdzić przemieszczenie mikrogranulek wywołane siłą magnetyczną. Powtórz procedurę skanowania, ustawiając nazwę pliku na after_small_force.nd2.
Następnie przełącz się na prawą ścieżkę światła, włącz DIA i otwórz widok wirowania przed kliknięciem przycisku nagrywania. Zakręć pokrętłem urządzenia do przesuwania magnesu do 120 milimetrów nad dnem szalki Petriego i zapisz sekwencję obrazów lub wideo w jasnym polu. Powtórz kroki skanowania, ustawiając nazwę pliku na before_large_force.nd2.
Mikrokulki nie mogą emitować fluorescencji pod wpływem wzbudzenia laserowego w kanale FITC lub cyjaniny 5. W ten sposób zinternalizowane mikrogranulki zostały zidentyfikowane przez ciemne zagłębienie znajdujące się w obrazowaniu konfokalnym fluorescencji białka i jądra związanego z YES. Obiegowość jądrowa nie wykazała znaczącej różnicy między komórkami kontrolnymi a komórkami z internalizacją mikrokulek.
Stosunek jądra komórkowego białka do cytoplazmy związany z YES w komórkach kontrolnych hodowanych wspólnie z mikrokulkami, ale bez internalizacji oraz komórek z internalizacją mikrokulek również nie wykazał istotnej różnicy. Deformacja jądra i depolimeryzacja aktyny były spowodowane siłą ściskającą wywieraną przez mikrogranulki w komórkach zawierających cytoszkielet. Krzywa kalibracji analizy obrazowania ilościowego zapewniona przez ilościową zależność siły przemieszczenia AFM.
Na podstawie tej zależności oszacowano siłę przyłożoną do koralików. Deformację jądra i translokację białka związaną z YES obserwowano po zastosowaniu lub uwolnieniu siły magnetycznej. Zmiany intensywności białka związanego z YES w kanale zielonym i brak zmian w barwieniu jądra w kanale czerwonym potwierdziły, że deformacja jądrowa wywołana siłą magnetyczną wywołana translokacją białka związanego z YES.
Kwantyfikacja zmiany netto stosunku jądra białka do cytoplazmy związanej z YES w dwóch grupach potwierdziła, że siła magnetyczna przyłożona do mikrogranulek w cytoplazmie indukowała translokację białka związanego z YES i zmieniała stosunek jądra białka do cytoplazmy związanej z YES. Przed przyłożeniem siły i obrazowaniem upewnij się, że komórki zinternalizowały mikrokulki magnetyczne, a kulki znajdują się w granicach komórki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Niniejsze badanie bada nowy protokół stosowania siły mechanicznej bezpośrednio na jądro komórkowe przy użyciu magnetycznych mikrokuli w żywych komórkach, umożliwiając jednocześnie obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek. Ta technika ujawnia wgląd w mechanizmy mechanosensoryczne jądra, funkcjonujące bez zakłócania procesów komórkowych.
Direct mechanical interrogation of the cell nucleus using 3D magnetic force actuators and live-cell fluorescence imaging enables precise, non-invasive analysis of nuclear mechanotransduction. This approach addresses a critical gap in understanding how nuclear mechanics influence cellular signaling, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. The method's quantitative outputs and real-time readouts position it as a strategic asset for mechanistic de-risking and portfolio triage in biopharma R&D.
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling direct, quantitative assessment of nuclear mechanotransduction, supporting both hypothesis-driven research and assay development.