Synteza mikroprzepływowa mikrożelowych bloków budulcowych do rusztowania cząstek wyżarzonych mikroporowato

Wysokowydajne wytwarzanie monodyspersyjnych mikrożelowych bloków budulcowych do rusztowań z mikroporowatymi cząstkami wyżarzonymi zapewnia lepszą kontrolę porowatości rusztowań. Może to mieć wpływ na wielkość porów i późniejsze wyniki integracji tkanek. Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustowe podejście mikroprzepływowe do generowania dużych ilości monorozproszonych mikrożeli, czego nie można osiągnąć innymi metodami, takimi jak mikrofluidyka skupiająca przepływ, emulsja wsadowa i elektronatryskiwanie.

Powstałe mikrożele można formować w mikroporowate rusztowania z cząstkami wyżarzonych, które są korzystne w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej ze względu na porowatość skali komórkowej, która pozwala na szybki wzrost tkanki i wzrostu. Zacznij od przygotowania jednego szkiełka podstawowego na urządzenie mikroprzepływowe PDMS. Użyj taśmy, przefiltrowanego powietrza lub płynów do płukania alkoholem izopropylowym, aby usunąć kurz ze szkiełka.

Umieść szklane szkiełko w szkiełku o konstrukcji urządzenia PDMS, obok siebie na 96-dołkowej pokrywie płytki i umieść je w myjce plazmowej. Zamknij drzwiczki i zawór przepływu powietrza i włącz pompę próżniową. Pozwól mu działać przez co najmniej 30 sekund, a następnie wyłącz go.

Podłącz rurkę gazową butli tlenu do zaworu przepływu powietrza. Pozwól, aby komora plazmowa napełniła się tlenem przez 30 sekund, a następnie wyłącz tlen i zamknij zawór przepływu powietrza. Włącz pompę próżniową i ustaw poziom częstotliwości radiowej na wysoki.

Poczekaj, aż komora zmieni kolor na fioletowo-różowy i odczekaj 30 sekund. Gdy timer się wyłączy, wyłącz plazmę i odkurzanie, a następnie powoli otwórz zawór przepływu powietrza, aby uwolnić podciśnienie. Wyjmij tackę z urządzenia do czyszczenia plazmowego.

Delikatnie obróć urządzenie PDMS na szklane szkiełko, aby je połączyć. W miarę wiązania należy zwrócić uwagę na niewielką różnicę w przezroczystości PDMS. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przechowuj połączone urządzenia w temperaturze 60 stopni Celsjusza do momentu bezpośrednio przed użyciem.

Przygotuj obróbkę powierzchni, rozcieńczając PFOCTS i olej Novec i użyj jednego mililitra na trzy do czterech urządzeń. Przenieść objętość do strzykawki o pojemności jednego mililitra i założyć igłę o rozmiarze 25. Wytnij od 10 do 12 centymetrów rurki Tygon na urządzenie.

Wytnij kawałek rurki PEEK o długości około jednego cala. Włóż kilka milimetrów rurki PEEK do końca rurki Tygon, aby zapobiec przebiciu przez igłę wlotów rurki Tygon. Wyjmij urządzenia z podgrzewanej komory i włóż końcówkę rurki Tygon bez PEEK do wodnego otworu wlotowego.

Włóż igłę strzykawki do obróbki powierzchni do rurki PEEK i zakryj otwór wylotowy komory olejowej. Wstrzykiwać lek powoli i upewnić się, że wypełnia on urządzenie bez pęcherzyków. Poczekaj, aż najpierw wypełnią się komory wodne, następnie mniejsze kanały, a następnie komora olejowa.

Wyjmij rurkę Tygon z urządzenia. Po napełnieniu urządzenia odstaw je na 10 minut w temperaturze pokojowej. Napełnij pięciomililitrową strzykawkę samym olejem i przymocuj igłę o rozmiarze 25.

Zassać obróbkę powierzchniową z urządzenia przez wloty i wyloty. Włóż rurkę Tygon do wlotu wody wodnej. Włóż strzykawkę z olejem do rurki PEEK i przepłucz każde urządzenie olejem.

Odessać olej z urządzenia. Powtórz dwukrotne płukanie olejem i wyjmij rurkę Tygon. Włóż końcówkę rurki Tygon bez PEEK do wlotów urządzeń mikroprzepływowych.

Włóż pozostały kawałek rurki Tygon bez rurki PEEK na końcu do wylotu urządzenia mikroprzepływowego. Dodaj co najmniej trzy mililitry oleju do pięciomililitrowej plastikowej strzykawki i przymocuj ją do igły o rozmiarze 25. Ostrożnie włóż igłę do rurki PEEK na jednym z wlotów Tygon.

Delikatnie przepłucz rurkę i urządzenie olejem. Zbierz olej z wylotu do stożkowej rurki. Powtórz płukanie olejem na drugim wlocie Tygon.

Ustawić pompy strzykawkowe na żądane natężenia przepływu. Podłącz strzykawkę zawierającą środek powierzchniowo czynny do wlotu oleju za pomocą igły o rozmiarze 25 i delikatnie dozuj wystarczającą ilość oleju, aby zalać rurkę i kanał olejowy urządzenia mikroprzepływowego. Po ustawieniu urządzenia i wlotów oleju dodaj 0,5 mililitra oleju do nowej pięciomililitrowej strzykawki, która będzie zawierała prekursor żelu.

Użyj tej niewielkiej ilości oleju, aby pomóc przepłukać roztwór prekursora przez urządzenie mikroprzepływowe. W stożkowej rurze połącz 1,5 mililitra roztworu szkieletu PEG i 1,5 mililitra roztworu sieciującego. Wirować przez 30 sekund i szybko przenieść połączony roztwór prekursora żelu do pięciomililitrowej strzykawki.

Połączyć strzykawkę z roztworem prekursora żelu z wlotem wody za pomocą igły o rozmiarze 25G. Delikatnie dozuj wystarczającą ilość roztworu, aby zalać rurkę i kanał wodny. Zacisnąć strzykawki na pompkach strzykawkowych i nacisnąć przycisk RUN.

Szukaj cząstek o jednolitej wielkości w kanałach. Zbierz mikrożele z wylotu do stożkowej tuby. Po zakończeniu żelowania użyj pipety, aby ostrożnie usunąć fazę olejową z dna probówki.

Zdeponuj je w odpowiednim pojemniku na odpady fluorowane. Dodaj więcej oleju do probówki do zbierania mikrożelu. Wymieszaj, delikatnie odwracając probówkę zbiorczą.

Pozwól probówce zbiorczej osiąść na pięć minut, aby umożliwić rozdzielenie faz. Poszukaj fazy olejowej na dole i wodnej fazy mikrożelowej na górze. Powtórz płukanie olejem co najmniej dwa razy więcej.

Dodaj więcej oleju z żelem, jak pokazano wcześniej, a następnie dodaj PBS do żelu. Odwróć, aby wymieszać kilka razy. Aby oddzielić warstwy, odwiruj probówkę o temperaturze 2 000 RCF przez około 30 sekund.

Poszukaj fazy olejowej na dole tubki, żelu w środku i PBS na górze. Usuń fazę olejową za pomocą pipety i wyrzuć ją do pojemnika na odpady. Powtórz dwukrotne mycie olejem i PBS.

Poczekaj, czy żel zmieni się z nieprzezroczystego w przezroczysty do ostatniego prania. Usuń cały olej. Nie wyjmuj PBS z rurki stożkowej.

W dygestorium chemicznym użyj szklanej pipety, aby dodać heksany do rurki w objętości równej PBS. Obracaj stożkową rurkę przez 30 sekund lub do momentu, gdy dokładnie się wymiesza. Wirować przy 4 696 RCF przez pięć minut.

Po oddzieleniu poszukaj heksanów w górnej warstwie, PBS w środku i żelu na dole. Usuń warstwę heksanu i wyrzuć ją do pojemnika na odpady organiczne. Zassać PBS.

Powtórz heksan w praniu PBS co najmniej dwa razy lub do momentu, gdy żel stanie się prawie przezroczysty. Ponownie umyj żel PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe pozostałości heksanu. Wirować przy 4 696 RCF przez pięć minut i zasysać warstwę PBS.

Około 67-75% 20-kilodaltonowego maleimidu PEG zostało zmodyfikowane grupami funkcyjnymi metakrylamidu, aby zapewnić wysoką wydajność wyżarzania. Procentową modyfikację określono poprzez analizę pików widm 1H NMR. Początek żelowania dostarczył informacji na temat czasu wytwarzania mikrożelu mikroprzepływowego.

Zaleca się wybór pH prekursora żelu, który może zainicjować żelowanie w ciągu od 30 minut do dwóch godzin. Po oczyszczeniu i spęcznieniu mikrożele miały jednolitą wielkość i wskaźnik polidyspersyjności między 1,00 a 1,02, zdefiniowany jako populacja monorozproszona. Po wyżarzaniu mikrożele utworzyły porowate rusztowanie uwidocznione za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Prawidłowe przyklejenie urządzenia PDMS do szkiełka podstawowego i prawidłowa obróbka powierzchni urządzenia ma kluczowe znaczenie dla najlepszej wydajności urządzenia mikroprzepływowego. Technika ta pozwala na szybkie wytwarzanie jednolitych bloków budulcowych mikrożelu w celu utworzenia rusztowań mapowych, które mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań regeneracyjnych in vivo, w tym do gojenia się ran.