Podstawowe składniki testów transkrypcji in vitro Borreliella (Borrelia) burgdorferi

System testów transkrypcji in vitro dla Borreliella burgdorferi stanowi biochemiczne narzędzie dla badaczy do badania mechanizmów regulacji genów i czynników regulujących aktywność enzymatyczną polimerazy RNA. System pozwala nam przetestować, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne, kofaktory, stężenia soli i pH wpływają na funkcję polimerazy RNA Borreliella burgdorferi, co przyczynia się do naszego ogólnego zrozumienia mechanizmów regulacji genów. Ta potężna technika może również pozwolić nam na badania przesiewowe leków, które selektywnie hamują polimerazę RNA, otwierając drzwi do opracowania nowych leków do leczenia boreliozy z Lyme.

Na początek zbierz osad komórkowy z dwóch do czterech litrów Borreliella burgdorferi RpoC-His10X hodowany w pożywce BSKII w środowisku mikroaerofilnym do gęstości od dwóch do czterech razy 10 stałej na mililitr. Osadzać komórki w temperaturze 10 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 500-mililitrowych butelkach odśrodkowych i wyrzucić supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w 30 mililitrach lodowatego buforu HN, powtórz etap wirowania i zdekantuj supernatant.

Podczas pracy utrzymuj komórki, lizat i oczyszczone białka w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie, chyba że zamarzną. Utrzymuj polimerazę RNA w środowisku redukującym, dodając świeżo przygotowany ditiotreitol w stężeniu dwumilimolowym do każdego użytego buforu i utrzymuj pH 8,0. Przygotuj lizat z osadu komórkowego Borreliella burgdorferi za pomocą dostępnego w handlu zestawu do lizy bakteryjnej.

Ponownie zawiesić osad w 10 do 15 mililitrach roztworu B-PER bez inhibitora proteazy i pozostawić lizę na lodzie przez pięć minut. Dodaj koktajl inhibitorów proteazy do roztworu do lizy i kontynuuj trzy rundy sonikacji. Teraz sklaruj lizat komórkowy przez odwirowanie i filtrację za pomocą 50-mililitrowej probówki wirówkowej.

Dodaj bufor ładujący kolumnę kobaltową do roztworu, dzięki czemu całkowita objętość wzrośnie do 30 mililitrów. Osadzać resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 20 000 razy G przez 30 minut. Następnie przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,45 mikrometra i rozcieńczyć bufor ładujący lizatu i kobaltu do końcowego stosunku rozcieńczenia 1:10.

Przeprowadzić chromatografię powinowactwa na oczyszczonym supernatancie lizatu komórkowego przy użyciu kolumny z żywicą kobaltową lub niklową, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zapisz próbki przepływowe, myjące i eluowane do analizy. Natychmiast wymienić roztwór buforowy roztworu polimerazy RNA na roztwór buforowy do przechowywania za pomocą kolumny do wymiany buforowej zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie stęż polimerazę RNA do stężenia od 0,2 do 0,4 miligrama na mililitr za pomocą 10-kilodaltonów odśrodkowych jednostek filtrujących. Oznaczyć stężenie za pomocą spektrofotometru i przygotować zapasy do zamrażania. Podajcie od 20 do 50 mikrolitrów objętości polimerazy RNA do zamrażania w probówkach PCR i przechowujcie polimerazę RNA w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przygotuj powierzchnie robocze, w tym stanowisko radiologiczne, aby zmniejszyć zanieczyszczenie radiacyjne. Rozmrozić świeże zapasy polimerazy RNA i RpoD na lodzie i dokładnie wymieszać wszystkie rozmrożone zamrożone zapasy przed pipetowaniem Przygotować główną mieszaninę reakcyjną w oddzielnej mieszaninie NTP dla nukleotydów znakowanych radioaktywnie zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi. Dozować reakcje kontrolne w zestawach doświadczalnych do probówek PCR.

Po dozowaniu wody, mieszaniny reakcyjnej, polimerazy RNA i RpoD do wyznaczonych probówek PCR, wymieszaj odczynniki przez pipetowanie. Przenieś przygotowane materiały na stanowisko radiacyjne, dodaj ATP znakowane alfa-32P do NTP i wymieszaj przez delikatne pipetowanie. Dodać NTP do probówek zawierających mieszaniny reakcji transkrypcji in vitro i rozpocząć reakcję transkrypcji in vitro od dodania matrycy DNA.

Wymieszaj objętość reakcji, delikatnie pipetując i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut w termocyklerze lub bloku grzewczym. Usunąć reakcje z termocyklera lub bloku grzewczego i zatrzymać reakcje transkrypcji in vitro, dodając równą objętość barwnika ładującego 2X RNA zawierającego 50% formamidu do mieszaniny reakcyjnej. Denaturacja enzymów poprzez inkubację reakcji w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut w termocyklerze lub bloku grzewczym.

Za pomocą elektroforezy żelowej oddzielić transkrybowany RNA in vitro w żelach poliakryloamidowych mocznika TBE o stężeniu od 10% do 15% TBE pod napięciem 180 woltów przez 30 do 45 minut. Po usunięciu jakiejkolwiek części żelu zawierającej nieinkorporowane ATP znakowane radioaktywnie, należy wystawić żel na działanie badania przesiewowego fosfonowego przez noc i zobrazować znakowane radioaktywnie RNA za pomocą obrazowania fosfoekranowego. SDS-PAGE pokazał trzy prążki odpowiadające trzem peptydom, RpoC, RpoB i RpoA kompleksu polimerazy RNA.

Zaobserwowano również peptyd o mocy 115 kilodaltonów pasujący do wielkości rekombinowanego Borreliella burgdorferi RpoD znakowanego MBP. Rozszczepienie mieszaniny białkowej z proteazą czynnika XA doprowadziło do wytworzenia dwóch istotnych produktów, RpoD i MBP. Strona promotorska Borreliella burgdorferi FLGB została wygenerowana metodą PCR.

Dwukrotne rozcieńczenie stężenia RpoD powoduje obniżenie poziomu nagromadzonego produktu RNA. Niskie stężenie polimerazy RNA daje mniej produktów RNA w całym zakresie stężeń RpoD. Sygnał densytometryczny wykazał liniową zależność między ilością RpoD obecnego w reakcji w obu eksperymentach.

Aktywność enzymatyczna polimerazy RNA jest wrażliwa na różne czynniki podczas procesu oczyszczania, przechowywania i eksperymentowania. Świeży enzym i odczynniki, wraz z dobrym planowaniem, dają najlepszą możliwą szansę na sukces w tym protokole.