Name: Podstawowe składniki testów transkrypcji in vitro Borreliella (Borrelia) burgdorferi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj metodę testów transkrypcji in vitro Borreliella burgdorferi do badania regulacji ekspresji genów i aktywności RNA polimerazy. Technika umożliwia przesiewowe wykrywanie inhibitorów enzymu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Fundusz Inwestycji Strategicznych Nauk o Zdrowiu Grant na Rozwój Wydziału Uniwersytetu Creighton. Szczep B. burgdorferi RpoC-His10X został dostarczony dzięki uprzejmości dr D. Scotta Samuelsa z University of Montana. Szczep E. coli zawierający plazmid pMAL-C5X kodujący allel rpoD znakowany białkiem wiążącym maltozę został dostarczony przez dr Franka Gherardini z Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

1. Oczyszczanie polimerazy RNA i przygotowanie materiału polimerazy RNA
<ol>
	<li>Zebrać osad komórkowy z 2-4 l B. burgdorferi RpoC-His10X hodowanego w pożywce BSKII w środowisku mikroaerofilnym (34 °C, 5% CO2, 3% O2) do gęstości 2-4 x 107 komórek/ml przy użyciu wcześniej opisanych protokołów pobierania komórek28,29. Przeprowadzić wirowanie przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut w butelkach odśrodkowych o pojemności 500 ml i odlać sklarowany nad osadem.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 30 ml lodowatego buforu HN (10 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0). Powtórzyć etap wirowania, jak opisano powyżej, używając probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i zdekantować supernatant. 
	UWAGA: Punkt zatrzymania. Zamrozić osad komórkowy w temperaturze -80 °C, aby przechowywać komórki do 2 tygodni lub natychmiast przystąpić do lizy komórek.</li>
	<li>Utrzymywać komórki, lizat i oczyszczone białka w temperaturze 4 °C lub na lodzie, dopóki nie zostaną zamrożone. Utrzymuj polimerazę RNA w środowisku redukującym, dodając świeżo przygotowany DTT w stężeniu 2 mM do każdego buforu użytego w tym protokole i utrzymuj pH 8,0.</li>
	<li>Przygotuj lizat z osadu komórkowego B. burgdorferi za pomocą dostępnego w handlu zestawu do lizy bakterii, postępując zgodnie z instrukcjami zestawu. Zawiesić osad w 10-15 ml roztworu B-PER o temperaturze pokojowej (RT) bez inhibitora proteazy i pozostawić na 5 minut lizę na lodzie. Objętość lizy zależy od wielkości osadu komórkowego, zgodnie z opisem w instrukcji zestawu.</li>
	<li>Dodać koktajl inhibitorów proteazy do roztworu do lizy, a następnie wykonać trzy rundy sonikacji, jak opisano w sekcji reprezentatywnych wyników. 
	UWAGA: Alternatywnie, zdaj komórki we francuskiej komorze ciśnieniowej, jak opisano wcześniej24. Pomiń krok 1.4. i krok 1.5.</li>
	<li>Sklarować lizat komórkowy za pomocą wirowania i filtracji za pomocą probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Napełnić objętość probówki do co najmniej 30 ml całkowitej objętości, dodając do roztworu bufor ładujący kolumnę kobaltu (Tabela 1). Osadzać resztki komórek przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 30 minut.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.</li>
	<li>Rozcieńczyć lizat w buforze ładującym kolumnę kobaltu (tabela 1) stosując końcowy stosunek rozcieńczenia 1:10.</li>
	<li>Przeprowadzić chromatografię powinowactwa na oczyszczonym supernatancie lizatu komórkowego przy użyciu kolumny kobaltowej lub niklowo-żywicznej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Przykład można znaleźć w sekcji reprezentatywnych wyników. Należy użyć wymienionych w tabeli 1. Pobrać próbki przepływowe, płuczące i elucyjne do analizy.</li>
	<li>Natychmiast wymienić polimerazę RNA w roztworze buforu elucji na roztwór buforowy do przechowywania polimerazy RNA (tabela 1) za pomocą kolumny do wymiany buforowej zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotuj zapasy zamrażarki, zagęszczając polimerazę RNA za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących 10 kDa do stężenia 0,2-0,4 mg / ml oznaczonego za pomocą spektrofotometrii (A280 nm bez regulacji współczynnika ekstynkcji [1 abs na 1 cm = 1 mg·mL−1]).</li>
	<li>Zamrażarkę polimerazy RNA z podwielokrotnością 20-50 μl należy przechowywać w probówkach do PCR i przechowywać polimerazę RNA w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określić jakość chromatografii powinowactwa za pomocą SDS-PAGE i zmierzyć całkowitą wydajność białka za pomocą spektrofotometrii lub testu BCA. Próbki należy uruchomić na 7,5% żelu poliakrylamidowym pod napięciem 120 V przez 50 minut, aby uzyskać dobrą rozdzielczość za pomocą SDS-PAGE.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie rekombinowanego RpoD i przygotowanie materiału RpoD
<ol>
	<li>Hoduj i indukuj ekspresję rekombinowanego B. burgdorferi RpoD znakowanego białkiem wiążącym maltozę (MBP-RpoD) w BL21::MBP-RpoDBb, zgodnie z opisem w instrukcji obsługi systemu fuzji i oczyszczania białek wymienionej w Tabeli materiałów, a następnie zebrać komórki przez odwirowanie. 
	UWAGA: Punkt zatrzymania. Zamrozić granulki komórek w temperaturze -80 °C, aby przechowywać komórki przez okres do 2 tygodni lub natychmiast przystąpić do lizy komórek.</li>
	<li>Wykonaj lizę za pomocą komercyjnego zestawu do lizy komórek bakteryjnych lub francuskiej komory ciśnieniowej. Patrz przykładowy bufor do lizy w tabeli 1.</li>
	<li>Klarować lizat komórkowy za pomocą wirowania i filtracji. Osadzać resztki komórek przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 30 minut. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 μm.</li>
	<li>Ekstrakcja MBP-RpoD przy użyciu protokołu ekstrakcji białek dla systemu ekspresji. Zapoznaj się z sekcją reprezentatywnych wyników, aby zapoznać się z przykładowymi szczegółami wdrożenia i wynikami.</li>
	<li>Określić jakość procesu chromatografii powinowactwa i elucji za pomocą SDS-PAGE i zmierzyć wydajność białka za pomocą spektrofotometrii (A280nm bez regulacji współczynnika ekstynkcji [1 abs przy 1 cm = 1 mg·mL−1]). Użyj 10% żelu poliakrylamidowego pod napięciem 200 V przez 30 minut w celu separacji w SDS-PAGE.</li>
	<li>Skoncentrować MBP-RpoD za pomocą filtra odśrodkowego o stężeniu 10 kDa, do stężenia >2 mg/ml oznaczonego metodą spektrofotometrii.</li>
	<li>Rozszczepić MBP z RpoD w miejscu rozszczepienia czynnika Xa. Dodać CaCl2 do frakcji elucyjnych chromatografii powinowactwa zawierających MBP-RpoD w stężeniu 2 mM. Dodać 200 μg proteazy czynnika Xa na każde 30 mg oczyszczonego białka. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Potwierdź pełne rozszczepienie MBP z RpoD przez SDS-PAGE. Użyj 10% żelu poliakrylamidowego pod napięciem 200 V przez 30 minut w celu separacji w SDS-PAGE.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór zawierający MBP i RpoD w stosunku 1:10 buforem wiążącym heparynę.</li>
	<li>Oddziel MBP i RpoD w kolumnie heparyny za pomocą FPLC. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z ustawieniami FPLC.</li>
	<li>Określić jakość produktów chromatografii powinowactwa za pomocą SDS-PAGE i zmierzyć wydajność białka za pomocą spektrofotometrii. Użyj 10% żelu poliakrylamidowego pod napięciem 200 V przez 30 minut w celu separacji w SDS-PAGE.</li>
	<li>Zagęścić frakcje elucyjne zawierające RpoD za pomocą filtra odśrodkowego o masie 10 kDa do końcowej objętości 2-3 ml.</li>
	<li>Wymiana buforowa skoncentrowanych frakcji elucyjnych RpoD na bufor magazynowy za pomocą żelowej kolumny filtracyjnej.</li>
	<li>Zagęścić materiał podstawowy RpoD za pomocą filtra odśrodkowego o stężeniu 10 kDa do stężenia 0,2-0,8 mg/ml, określonego metodą spektrofotometrii.</li>
	<li>Porcję RpoD przechowywać w objętościach 20-50 μl w probówkach do PCR i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie matrycy DNA
<ol>
	<li>PCR amplifikuje region 500 pz otaczający miejsce promotora sterowane RpoD z genomowego DNA B. burgdorferi przy użyciu reakcji 200 μl (Tabela 3).</li>
	<li>Oczyść produkty PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR. Eluuj DNA w biologii molekularnej klasy H2O.</li>
	<li>Dostosować stężenie molowe matryc DNA wygenerowanych przez PCR do 100 nM przez rozcieńczenie w klasie biologii molekularnej H2O.</li>
</ol>
4. Wykonaj transkrypcję in vitro z włączeniem znakowanych radioaktywnie nukleotydów
<ol>
	<li>Przygotuj plan eksperymentu z transkrypcją in vitro. Określ stężenia polimerazy RNA, RpoD i matrycy DNA. Określić podwielokrotne objętości i kolejność pipetowania probówek reakcyjnych. Zobacz Tabelę 4 i Rysunek 1 dla przykładu. 
	UWAGA: W planie eksperymentalnym należy uwzględnić kontrole, takie jak reakcje niezawierające polimerazy RNA, alternatywna polimeraza, brak matrycy lub alternatywne matryce.</li>
	<li>Oblicz objętość α-32P-ATP wymaganą do eksperymentu. Uwzględnij to w planie eksperymentalnym. Zazwyczaj uwzględnia się 2 μCi aktywności na reakcję transkrypcji in vitro w celu wykrycia ekranu fosforowego.</li>
	<li>Przygotuj powierzchnie robocze, w tym stół radiologiczny, aby zmniejszyć ryzyko skażenia radiacyjnego.</li>
	<li>Rozmrozić świeże porcje polimerazy RNA, Rpo, 5-krotnego bufora NTP i matrycowych roztworów podstawowych na lodzie. Przed pipetowaniem dokładnie wymieszać wszystkie rozmrożone zamrożone buliony.</li>
	<li>Przygotować główną mieszaninę reakcyjną i oddzielną mieszaninę NTP dla nukleotydów znakowanych radioaktywnie zgodnie z planem doświadczalnym.</li>
	<li>Dozować reakcje kontrolne i zestawy doświadczalne do probówek PCR w ramach przygotowań do dodania radioznacznika w reakcji. Delikatnie dozowaćH2O, główną mieszaninę reakcyjną, polimerazę RNA i RpoD do wyznaczonych probówek PCR i mieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Przenieś przygotowane materiały na ławkę radiacyjną.</li>
	<li>Dodać α-32P-ATP do NTP i wymieszać delikatnie pipetując. 
	UWAGA: Podczas pracy z materiałem promieniotwórczym należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny i procedury postępowania z izotopami promieniotwórczymi.</li>
	<li>Dodać NTP do probówek zawierających mieszaniny reakcji transkrypcji in vitro z kroku 4.6.</li>
	<li>Rozpocznij reakcję transkrypcji in vitro od dodania matrycy DNA. Wymieszać objętość reakcji, delikatnie pipetując.</li>
	<li>Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 5 minut w termocyklerze lub bloku grzewczym.</li>
	<li>Usuń reakcje z termocyklera lub bloku grzewczego i dodaj barwnik ładujący 2x RNA zawierający 50% formamidu do równej objętości reakcji, aby zatrzymać reakcje transkrypcji in vitro.</li>
	<li>Denaturację enzymów przeprowadza się przez inkubację reakcji w temperaturze 65 °C przez 5 minut w termocyklerze lub bloku grzewczym.</li>
	<li>Oddzielić RNA w mieszaninie reakcji transkrypcji in vitro metodą elektroforezy żelowej przy użyciu 10%-15% żeli poliakryloamidowych mocznika TBE przy napięciu 180 V przez 30-45 min. 
	UWAGA: W zależności od warunków elektroforezy żelu, roztwór buforowy może być zanieczyszczony nukleotydami znakowanymi radioaktywnie lub żel może zawierać większość lub wszystkie znakowane radioaktywnie nukleotydy. Zaplanuj właściwe przechowywanie lub usuwanie promieniotwórczości.</li>
	<li>Zobrazuj znakowane radioaktywnie RNA za pomocą fosfoekranu po usunięciu jakiejkolwiek części żelu zawierającego nieinkorporowaną znakowaną radioaktywnie ATP. Wystawić żel na działanie fosfoekranu na noc (16 godzin) i wykonać obraz za pomocą imagera fosfoekranu (rozdzielczość 100 μm, napięcie lampy PMT 700 V).</li>
	<li>Analizuj dane przy użyciu metod densytometrii24.</li>
</ol>

<ol><li>Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of Borrelia burgdorferi.</a> Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).</li>
<li>Kingry, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+for+and+discovery+of+Borrelia+Species+in+US+patients+suspected+of+tickborne+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness.</a> Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).</li>
<li>Cutler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsing+fever+Borreliae%3A+A+global+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relapsing fever Borreliae: A global review.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).</li>
<li>Barbour, A. G., Hayes, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Borrelia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of Borrelia species.</a> Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).</li>
<li>Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+infection+with+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Biology of infection with Borrelia burgdorferi.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).</li>
<li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+ticks%2C+mice+and+men%3A+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li>
<li>Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+Lyme+disease+spirochete+with+its+tick+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector.</a> Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).</li>
<li>Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+organic+acids+decrease+Borrelia+burgdorferi+cytoplasmic+pH%2C+eliciting+an+acid+stress+response+and+impacting+RpoN-+and+RpoS-dependent+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1734(2017).</li>
<li>Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+different+virulence-related+regulatory+pathways+in+Borrelia+burgdorferi+are+directly+affected+by+osmotic+fluxes+in+the+blood+meal+of+feeding+ixodes+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791(2016).</li>
<li>Bugrysheva, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+RelBbu+Regulon+in+Borrelia+burgdorferi+reveals+modulation+of+glycerol+metabolism+by+%28p%29ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp.</a> PLoS One. 10 (2), 0118063(2015).</li>
<li>Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+pH+on+membrane+proteins+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).</li>
<li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Borrelia+burgdorferi+RelA%2FSpoT+homolog+and+stringent+response+regulate+survival+in+the+tick+vector+and+global+gene+expression+during+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation.</a> PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160(2015).</li>
<li>Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Borrelia+burgdorferi+alters+its+gene+expression+and+antigenic+profile+in+response+to+CO2+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels.</a> Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).</li>
<li>Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acids+alter+metabolic+and+virulence+attributes+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).</li>
<li>Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolved+oxygen+levels+alter+gene+expression+and+antigen+profiles+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).</li>
<li>Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-related+differential+expression+of+antigens+in+the+Lyme+disease+spirochete%2C+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).</li>
<li>Troxell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+and+zinc+regulate+virulence+determinants+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi.</a> Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+environmental+factors+influencing+reciprocal+patterns+of+gene+expression+in+virulent+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi.</a> Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).</li>
<li>Samuels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene regulation and transcriptomics.</a> Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).</li>
<li>Fraser, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequence+of+a+Lyme+disease+spirochaete%2C+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi.</a> Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).</li>
<li>Iyer, R., Schwartz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+comparative+genomic+and+transcriptome+analysis+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays%22%5BJournal%5D)">Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi.</a> Microarrays. 5 (2), 9(2016).</li>
<li>Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+global+alterations+in+the+transcriptomes+of+Lyme+disease+spirochetes+during+tick+feeding+and+following+mammalian+host+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation.</a> Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).</li>
<li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DksA-dependent+regulation+of+RpoS+contributes+to+Borrelia+burgdorferi+tick-borne+transmission+and+mammalian+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity.</a> PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072(2021).</li>
<li>Boyle, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+RNA+polymerase+transcription+system%3A+a+new+tool+to+study+transcriptional+activation+in+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8246(2020).</li>
<li>Silar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vitro+transcription+system+for+analysis+of+Corynebacterium+glutamicum+promoters+recognized+by+two+sigma+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors.</a> Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).</li>
<li>Maciag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcription+profiling+of+the+sigmaS+subunit+of+bacterial+RNA+polymerase%3A+re-definition+of+the+sigmaS+regulon+and+identification+of+sigmaS-specific+promoter+sequence+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements.</a> Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).</li>
<li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRENDA%2C+the+ELIXIR+core+data+resource+in+2021%3A+New+developments+and+updates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates.</a> Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).</li>
<li>Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+and+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation and complementation.</a> Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).</li>
<li>Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Borrelia burgdorferi.</a> Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).</li>
<li>Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+a+large+Borrelia+burgdorferi+motility+operon+which+is+initiated+by+a+consensus+sigma70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter.</a> Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).</li>
<li>Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase-dependent+modification+of+RNA+polymerase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli.</a> Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).</li>
<li>Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+purification+of+RNA+nanoparticles+by+preparative+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).</li>
<li>Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+components+sigma+and+y+of+the+DNA-dependent+RNA+polymerase+of+Lactobacillus+curvatus+in+promotor+selection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).</li>
<li>Stetter, K. O., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+in+lactobacillaceae.+DNA-dependent+RNA+polymerase+from+Lactobacillus+curvatus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus.</a> European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).</li>
<li>Borbley, G., Schneider, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Cyanobacteria.</a> Methods in Enzymology. 167, 3(1988).</li>
<li>Svetlov, V., Artsimovitch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+bacterial+RNA+polymerase%3A+Tools+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).</li>
<li>Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+whole+set+of+constitutive+promoters+recognized+by+RNA+polymerase+RpoD+holoenzyme+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (3), 90447(2014).</li>
<li>Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling-circle+RNA+synthesis%3A+Circular+oligonucleotides+as+efficient+substrates+for+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).</li>
<li>Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of in vitro transcription.</a> Nucleic Acids Research. 32 (9), 72(2004).</li>
<li>Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+bacterial+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for bacterial RNA polymerases.</a> Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Testy transkrypcyjne in vitro skonstruowane przy użyciu przedstawionego protokołu zostały niedawno wykorzystane do zbadania roli czynnika transkrypcyjnego u B. burgdorferi i mogą być stosowane do budowy podobnych eksperymentów z wykorzystaniem innych czynników transkrypcyjnych, czynników sigma i cząsteczek23. Po uzyskaniu aktywnej polimerazy RNA z B. burgdorferi i wykryciu jej aktywności, składniki i warunki w testach transkrypcji in vitro mogą być modyfikowane....

Borelioza i nawracająca gorączka są wywoływane przez patogeny krętków w rodzajach Borrelia i Borreliella1,2,3. Borelioza jest główną chorobą przenoszoną przez wektory w Ameryce Północnej, w związku z czym Borreliella burgdorferi jest znaczącym organizmem modelowym do badania biologii krętków4,5. Badania nad mechanizmami regulacji transkrypcji B. burgdorferi mają na celu lepsze zrozumienie jego adaptacji do zmian w środowisku, gdy przechodzi między wektorem kleszcza a żywicielem ssaków6,7. Zmiany pH, temperatury, osmolarności, dostępności składników odżywczych, krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, kwasów organicznych oraz poziomu rozpuszczonego tlenu i dwutlenku węgla modulują ekspresję genów, które są ważne dla B. burgdorferi, aby przetrwać w wektorze stawonogów i zakażać zwierzęta8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Powiązanie tych reakcji na bodźce z mechanizmami regulacyjnymi było ważnym aspektem badań nad B. burgdorferi<sup class="xref">19.
Czynniki transkrypcyjne i czynniki sigma kontrolują transkrypcję genów, które przeprowadzają procesy komórkowe. Krętki boreliozy i nawracającej gorączki zawierają stosunkowo rzadki zestaw czynników transkrypcyjnych i alternatywnych czynników sigma. Mimo to zachodzą złożone zmiany transkrypcyjne kierujące odpowiedziami B. burgdorferi do środowiska20,21,22. Konkretne mechanizmy napędzające zmiany transkrypcyjne u B. burgdorferi w odpowiedzi na zmiany środowiskowe pozostają niejasne. Testy transkrypcji in vitro są potężnymi narzędziami do stosowania podejścia biochemicznego do oznaczania funkcji i mechanizmów regulacyjnych czynników transkrypcyjnych i czynników sigma23,24,25,26.
Niedawno ustanowiono system testów transkrypcji in vitro wykorzystujący polimerazę RNA B. burgdorferi<sup class="xref">24. Ponieważ bakterie często mają unikalną fizjologię komórkową, polimerazy RNA różnych gatunków i rodzajów różnie reagują na oczyszczanie enzymów, przechowywanie enzymów i warunki buforowania reakcji27. B. burgdorferi jest również genetycznie odległy od wielu gatunków bakterii, w których badano polimerazy RNA20. Aspekty przygotowania enzymów, takie jak warunki buforu do lizy, przemywania i elucji, bufor do przechowywania, bufor do reakcji transkrypcji in vitro oraz metoda budowy testu, mogą zmieniać aktywność polimerazy RNA. W niniejszym dokumencie przedstawiamy protokół oczyszczania polimerazy RNA i czynnika sigma RpoD, produkcji liniowej dwuniciowej matrycy DNA oraz budowy testów transkrypcji in vitro w celu ułatwienia odtwarzalności między laboratoriami korzystającymi z tego systemu. Szczegółowo opisujemy przykładową reakcję, aby zademonstrować zakres liniowy dla transkrypcji zależnej od RpoD oraz omawiamy ograniczenia i alternatywy dla tego podejścia.

<table><tbody><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,45 mikrona</td><td>Thermo Scientific</td><td>726-2545</td><td>Krok 1,7 i 2,3</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>MidSci</td><td>C50B</td><td>Krok 1.3 i kolejne kroki</td></tr><tr><td>Szybkie probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>3119-0050PK</td><td>Krok 1.2</td></tr><tr><td>500 ml Butelki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120-9500PK</td><td>Krok 1.1</td></tr><tr><td>B-PER oraz instrukcja obsługi</td><td>Thermo Scientific</td><td>78248</td><td>Krok 1.4 i 2.2</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>Krok 2.6</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe 10 Kd odcięcie</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC8010</td><td>Krok 1.11 i 2.11</td></tr><tr><td>Żywica kobaltowa i instrukcja obsługi</td><td>Thermo Scientific</td><td>89969</td><td>Krok 1.9</td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Acros Organics</td><td>426380500</td><td>Krok 1.4 i kolejne kroki</td></tr><tr><td>Dnaza (nukleaza)</td><td>Milipore Sigma</td><td>70746</td><td>Krok 1.4 i 2.2</td></tr><tr><td>Czynnik Xa Proteaza&nbsp;</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCXA-0060</td><td>Krok 2.6</td></tr><tr><td>GE Typhoon 5 Phosphoimager</td><td>GE lifesciences</td><td>Wielokrotny</td><td>krok 4.15</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Bio-Rad</td><td>Mutiple</td><td>Krok 1.13 i kolejne etapy kontroli jakości</td></tr><tr><td>H2O do transkrypcji in vitro</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td>Krok 3.2 i 3.3</td></tr><tr><td>zestaw</td> <td>do PCR o wysokiej wiernościNew England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>Krok 3.1</td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Krok 1.1 i kolejne kroki</td></tr><tr><td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>17040601</td><td>Krok 2.8</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750-100G</td><td>Krok 1.9</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Thermo Scientific</td><td>90082</td><td>Krok 1.4 i 2.2</td></tr><tr><td>Magnez Chlorek&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25401</td><td>Krok 4.1</td></tr><tr><td>Chlorek manganu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25418</td><td>Krok 4.1</td></tr><tr><td>Mini protean tetra cell</td><td>Bio-Rad</td><td>Mutiple</td><td>Krok 1.13 i kolejne kroki kontroli jakości</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>85124</td><td>Krok 4.1</td></tr><tr><td>Mieszanina NTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td>Krok 4.1</td></tr><tr><td>PCR zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28506</td><td>Step 3.2</td></tr><tr><td>Probówki PCR</td><td>MidSci</td><td>PR-PCR28ACF</td><td>Step 1.12</td></tr><tr><td>PD-10 Kolumna wymiany buforowej Sephadex i instrukcja obsługi</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td>Step 1.10 i 2.10 (kolumna filtracji żelu)</td></tr> <tr><td>Instrukcja obsługi systemu fuzji i oczyszczania pMAL Protein Fusion and Purification</td><td>New England Biolabs</td><td>E8200S</td><td>Krok 2.1</td></tr><tr><td>Żele poliakrylamidowe AnyKD</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8125</td><td>Krok 1.13 i kolejne etapy kontroli jakości protien</td></tr><tr><td>Glutaminian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>Krok 4.1</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425</td><td>Krok 1.4 i 2.2</td></tr><tr><td>Znakowane radioaktywnie ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU503H</td><td>Krok 4.2</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący RNA, (2x)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>Krok 4.13</td></tr><tr><td>Inhibitor rnazy</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>Krok 4.1</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Biotek</td><td>Mutiple</td><td>Krok 1.13 i kolejne etapy kontroli jakości protien</td></tr><tr><td>Żele TBE-Mocznik 10 procent</td><td>Bio-Rad</td><td>4566033</td><td>Krok 4.14</td></tr></tbody></table>

podstawowe składniki testów transkrypcji in vitro borreliella (borrelia) burgdorferi

Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays

Borreliella burgdorferi to patogen bakteryjny o ograniczonym repertuarze metabolicznym i genomowym. B. burgdorferi przemieszcza się zewnątrzkomórkowo między kręgowcami i kleszczami i dramatycznie przebudowuje swój profil transkrypcyjny, aby przetrwać w różnych środowiskach podczas infekcji. Badania nad B. burgdorferi koncentrują się na jasnym zrozumieniu, w jaki sposób bakteria reaguje na swoje środowisko poprzez zmiany transkrypcyjne. Testy transkrypcji in vitro pozwalają na biochemiczne przeanalizowanie podstawowych mechanizmów regulacji transkrypcji. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół opisujący oczyszczanie i przechowywanie polimerazy RNA B. burgdorferi, oczyszczanie czynnika sigma, generowanie matryc DNA oraz testy transkrypcji in vitro. W protokole opisano zastosowanie polimerazy RNA oczyszczonej z B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC to wcześniej opublikowany szczep zawierający znacznik 10XHis na genie rpoC kodującym największą podjednostkę polimerazy RNA. Testy transkrypcji in vitro składają się z polimerazy RNA oczyszczonej ze szczepu 5A4-RpoC, rekombinowanej wersji czynnika sigma RpoD oraz dwuniciowej matrycy DNA generowanej przez PCR. Podczas gdy techniki oczyszczania białek i podejścia do składania testów transkrypcji in vitro są koncepcyjnie dobrze poznane i stosunkowo powszechne, rozważania dotyczące obchodzenia się z polimerazami RNA często różnią się w zależności od organizmu. Przedstawiony tu protokół przeznaczony jest do badań enzymatycznych nad polimerazą RNA B. burgdorferi. Metodę można dostosować do badania roli czynników transkrypcyjnych, promotorów i modyfikacji potranslacyjnych na aktywność polimerazy RNA.

W reakcji transkrypcji in vitro, w której etapem ograniczającym szybkość reakcji jest inicjacja transkrypcji zapośredniczona przez czynnik sigma, aktywność transkrypcyjna powinna wzrastać liniowo wraz z ilością czynnika sigma. Przedstawiamy przygotowanie eksperymentów transkrypcji in vitro, w których testowano zakres stężeń RpoD wraz z dwoma stężeniami polimerazy RNA, aby zaobserwować wynikający z tego zmienny sygnał wbudowania znakowanych izotopowo nukleotydów do produktów RNA. Przedstawiono reprezenta...

Testy transkrypcji in vitro mogą rozszyfrować mechanizmy regulacji transkrypcji u Borreliella burgdorferi. Protokół ten opisuje etapy oczyszczania polimerazy RNA B. burgdorferi i przeprowadzania reakcji transkrypcji in vitro. Podejścia eksperymentalne wykorzystujące testy transkrypcji in vitro wymagają niezawodnego oczyszczania i przechowywania aktywnej polimerazy RNA.

Podstawowe składniki testów transkrypcji in vitro Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Borreliella burgdorferi is a bacterial pathogen with limited metabolic and genomic repertoires. B. burgdorferi transits extracellularly between ...

System testów transkrypcji in vitro dla Borreliella burgdorferi stanowi biochemiczne narzędzie dla badaczy do badania mechanizmów regulacji genów i czynników regulujących aktywność enzymatyczną polimerazy RNA. System pozwala nam przetestować, w jaki sposób czynniki transkrypcyjne, kofaktory, stężenia soli i pH wpływają na funkcję polimerazy RNA Borreliella burgdorferi, co przyczynia się do naszego ogólnego zrozumienia mechanizmów regulacji genów. Ta potężna technika może również pozwolić nam na badania przesiewowe leków, które selektywnie hamują polimerazę RNA, otwierając drzwi do opracowania nowych leków do leczenia boreliozy z Lyme.Na początek zbierz osad komórkowy z dwóch do czterech litrów Borreliella burgdorferi RpoC-His10X hodowany w pożywce BSKII w środowisku mikroaerofilnym do gęstości od dwóch do czterech razy 10 stałej na mililitr. Osadzać komórki w temperaturze 10 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 500-mililitrowych butelkach odśrodkowych i wyrzucić supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w 30 mililitrach lodowatego buforu HN, powtórz etap wirowania i zdekantuj supernatant.Podczas pracy utrzymuj komórki, lizat i oczyszczone białka

essential-components-borreliella-borrelia-burgdorferi-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Źródło: Eggers, C. H. Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przygotowanie genetycznie zmodyfikowanej kultury Borrelia burgdorferi zmodyfikowanej z uśpionym DNA bakteriofaga przenoszącym gen oporności na antybiotyki. Po selekcji i inkubacji antybiotyków induktor chemiczny wyzwala uszkodzenie DNA, prowadząc do wycięcia, replikacji i złożenia nowych wirionów zawierających gen oporności. Po drugim odwirowaniu i...

Przygotowanie i indukcja kultur Borrelia burgdorferi do produkcji cząstek wirusa

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Zagnieżdżony PCR to czuła, specyficzna i prosta technika, którą można zastosować do ekstraktów DNA kleszczy w celu zbadania Borrelia burgdorferi, czynnika wywołującego boreliozę. Początkowy eksperyment PCR wykorzystuje startery specyficzne dla genu do generowania długich amplikonów, które następnie stają się matrycami do późniejszej reakcji przy użyciu wewnętrznych starterów.

Wykrywanie krętka boreliozy, Borrelia burgdorferi, u kleszczy za pomocą zagnieżdżonego PCR

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji aktywnego ekstraktu jądrowego z larwalnego stadium 4 C. elegans i wizualizacji aktywności transkrypcyjnej w systemie in vitro.

Izolacja aktywnego ekstraktu jądrowego Caenorhabditis elegans i rekonstytucja do transkrypcji in vitro

Zdolność bakteriofaga do przenoszenia DNA między komórkami bakteryjnymi czyni je skutecznymi narzędziami do genetycznej manipulacji ich bakteryjnych gospodarzy. Przedstawiono tutaj metodologię indukcji, odzyskiwania i wykorzystania φBB-1, bakteriofaga Borrelia burgdorferi, do transdukcji heterologicznego DNA między różnymi szczepami krętka boreliozy.

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Hodowla in vitro to bezpośrednia metoda wykrywania obecności żywych bakterii. Protokół ten opisuje metody hodowli różnych krętków Borrelia, w tym tych z kompleksu Borrelia burgdorferi sensu lato, gatunków Borrelia z nawracającą gorączką i Borrelia miyamotoi. Gatunki te są wybredne i wolno rosnące, ale można je hodować.

Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia

Tu dostarczamy szczegółów dotyczących przygotowania lizatów i przeprowadzania in vitro translacji za pomocą Drosophila zarodków.

Wolnokomórkowa in vitro translacja mRNA w Drosophila Lizowaniu

Poznaj metodę testów transkrypcji in vitro Borreliella burgdorferi do badania regulacji ekspresji genów i aktywności RNA polimerazy. Technika umożliwia przesiewowe wykrywanie inhibitorów enzymu.

Podstawowe składniki testów transkrypcji in vitro Borreliella (Borrelia) burgdorferi

Przeglądaj więcej filmów