Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Nasze protokoły pomagają tworzyć genetycznie modyfikowane myszy, które wymagają zaawansowanych eksperymentów in vivo na myszach, takich jak wizualizacja ekspresji genów, humanizacja genetyczna i warunkowy nokaut genów. Przedstawiona tutaj technika edycji genomu zygoty myszy umożliwia bardzo wydajną, szybką i prostą indukcję zaawansowanych modyfikacji genetycznych, takich jak knock-in kasety genów i flox. Ponieważ genetycznie zmodyfikowane myszy są wykorzystywane w różnych dziedzinach badań, takich jak neurologia, immunologia, metabolizm, reprodukcja i choroby zakaźne, nasza przedstawiona tutaj technologia zasadniczo wspiera tę szeroką dziedzinę badań.

Procedurę zademonstrują Natsumi Iki, Miyuki Ishida i Yoko Tanimoto, pracownicy techniczni z mojego laboratorium. Na początek przygotuj dwie 35-milimetrowe szalki Petriego do hodowli zygoty i umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do użycia. Zbierz jajowody i umieść je w 20-mikrolitrowej kropli pożywki M2 zawierającej 0,75 miligrama na mililitr hialuronidazy na pokrywie szalki Petriego.

Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby podnieść jeden jajowód i przepuścić około 50 mikrolitrów pożywki M2 z hialuronidazą przez fimbrie. Po 30 sekundach, za pomocą szklanej kapilary, podnieś morfologicznie normalne zygoty niewielką ilością pożywki i umyj je, przenosząc je do świeżych kropelek pożywki M16. Następnie zbierz umyte zygoty na szalce Petriego i powtarzaj proces, aż wszystkie zygoty zostaną odzyskane.

Za pomocą programowalnego ściągacza do pipet wyciągnij kilka szklanych pipet. Złamać końcówkę igły do mikroiniekcji, uderzając w szklaną kulkę przymocowaną do końcówki mikrokuźni. Sprawdź rozmiar końcówki pod mikroskopem przy powiększeniu 1 000x i upewnij się, że rozmiar końcówki igły do mikroiniekcji ma średnicę około jednego mikrometra.

Użyj mikrokuźni, aby zgiąć igłę do mikroiniekcji w odległości około dwóch do trzech milimetrów od końcówki. Wstrzyknąć od 1 do 1,5 centymetra płynu operacyjnego w środek igły do mikroiniekcji i przymocować ją do ręcznego uchwytu mikroiniektora za pomocą siłownika piezoelektrycznego. Następnie przymocuj igłę przytrzymującą do przeciwległego ręcznego uchwytu mikroiniektora i stopniowo przesuwaj płyn operacyjny na końcówkę igły do mikroiniekcji.

Zamocuj ręczne uchwyty mikrowtryskiwaczy na mikromanipulatorze. Przygotować komorę iniekcyjną z trzema kroplami. Po pierwsze, z 10 mikrolitrami pożywki M2, po drugie, z pięcioma mikrolitrami 12% poliwinylopirolidonu w pożywce M2, a po trzecie, z pięcioma mikrolitrami mieszaniny crRNA, tracrRNA, białka Cas9 i roztworu DNA dawcy.

Przykryj kropelki olejem mineralnym i ustaw komorę iniekcyjną na odwróconym stoliku mikroskopu. Pod odwróconym mikroskopem przy 50-krotnym powiększeniu opuść pipetę do mikroiniekcji do kropli 12% PVP. Zassać i dozować 12% PVP, aby oczyścić wnętrze końcówki igły do mikroiniekcji i przenieść ją do kropli RNPD.

Umieść ręczny mikrowtryskiwacz pod podciśnieniem. Zassać roztwór RNPD do igły do mikroiniekcji i poczekać, aż zostanie odessana wystarczająca objętość. Przy 50-krotnym powiększeniu napełnij całe wnętrze igły do mikroiniekcji płynem.

Następnie należy przerwać pobieranie i pozwolić, aby roztwór RNPD był stopniowo wydalany, ustawiając ręczny mikrowtryskiwacz na nadciśnienie. Wsunąć końcówkę igły do mikroiniekcji do oleju. Umieść 50 zygot w kropli M2 i delikatnie opuść pipetę trzymającą do tej samej kropli.

Przenieść igłę do mikroiniekcji do kropli M2 zawierającej zygoty. Przełącz się na obiektyw 20x i skup się na końcówce pipety do mikroiniekcji. Po trzymaniu zygoty skup się na przedjądrzu, poruszając mikromanipulatorem.

Włóż igłę do mikroiniekcji do zygoty i zbliż końcówkę do przedjądrza. Gdy końcówka dotrze do błony przedjądrza, zastosuj impuls piezoelektryczny do przebicia. Gdy igła do mikroiniekcji nakłuje przedjądrze, wstrzyknij roztwór RNPD i obserwuj obrzęk przedjądrza.

Gdy przedjądrze zostanie całkowicie napompowane, szybko wyciągnij igłę i wykonaj tę samą procedurę zarówno na przedjądrzach żeńskich, jak i męskich. Rozróżnicuj zygoty przed i po wstrzyknięciu, przenosząc wstrzykniętą zygotę w inne miejsce w kropli M2 i kontynuuj wstrzykiwanie wszystkich zygot obecnych w kropli M2. Po wstrzyknięciu przenieść zygoty do świeżego naczynia M16.

Wybierz zygoty, które przeżyły, 10 minut po wstrzyknięciu. Usunąć zlizowane zygoty uszkodzone przez wstrzyknięcie i rozprowadzić ocalałe zygoty do każdej kropli w szalce M16. Umieść niewielką ilość pożywki hodowlanej, kilka pęcherzyków powietrza jako marker, a zygoty w pipecie do przeniesienia.

Za pomocą mikronożyc wykonaj nacięcie między bańką a fimbriami jajowodu. Wprowadzić zygoty do nacięcia i jednocześnie potwierdzić, że pęcherzyk powietrza został wprowadzony. Mediana wydajności produkcji 13 niezależnych myszy z kasetą z kasetami z genami wynosiła 20,8%, przy czym maksymalnie 39,5% i minimum 7,9%Mediana wskaźnika urodzeń w tym nieśmiertelnym stanie celowania w geny wyniosła 34,0%, przy maksimum 43,3% i minimum 15,9%Mediana wydajności produkcji 10 niezależnych myszy z klapkami wyniosła 7,7%, przy maksimum 20,7% i minimum 2,1%Chociaż funkcje kilku docelowych genów były nieznana, mediana wskaźnika urodzeń wynosiła 30,2%, przy czym maksimum wynosiło 43,8%, a minimum 17,3%Średnica końcówki igły do wstrzykiwań nie powinna być zbyt cienka, a ciśnienie wstrzykiwacza ręcznego powinno być dostosowane, aby zapewnić, że roztwór w igle zostanie wstrzyknięty, a przedjądrze będzie powoli napełniane.