Name: Delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego Killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Naucz się delikatnej izolacji jąder z mózgu afrykańskiego turkusowego killifisha, modelu do badań nad starzeniem. Metoda umożliwia sekwencjonowanie RNA i ATAC-seq na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niektóre panele zostały wygenerowane za pomocą BioRender.com. Prace w naszym laboratorium były wspierane przez NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant dla B.T., grant Fundacji Simonsa w ramach Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, grant pilotażowy od Navigage Foundation oraz nagrodę Hanson-Thorell Family dla B.A.B.

<ol><li>Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The aging brain.</a> Annual Review of Pathology. 3 (1), 41-66 (2008).</li>
<li>Hu, C. K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+turquoise+killifish%3A+A+research+organism+to+study+vertebrate+aging+and+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause.</a> Aging Cell. 17 (3), 12757(2018).</li>
<li>McKay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+feeding+system+for+the+African+killifish+reveals+effects+of+dietary+restriction+on+lifespan+and+allows+scalable+assessment+of+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+affects+longevity+and+age-related+locomotor+and+cognitive+decay+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).</li>
<li>Vanhunsel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+killifish+visual+system+as+an+in+vivo+model+to+study+brain+aging+and+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Aging+and+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation.</a> NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22(2021).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Ziffra, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics+reveals+mechanisms+of+human+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development.</a> Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Kalish, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA+sequencing+of+mouse+auditory+cortex+reveals+critical+period+triggers+and+brakes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+surgically+resected+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), e61542(2020).</li>
<li>Saunders, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diversity+and+specializations+among+the+cells+of+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain.</a> Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).</li>
<li>Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k">https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k</a> (2021).</li>
<li>Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+nuclei+extraction+%28for+10xV3+snSEQ%29+V.2%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2.</a> protocols.io. , (2020).</li>
<li>Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression-">https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression-</a> (2022).</li>
<li>Rocks, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+chromatin+accessibility+analysis+in+the+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain.</a> Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do powtarzalnego generowania wysokiej jakości jąder z mózgów karpiów. Protokół ten musiał zostać specjalnie zaprojektowany dla mózgu karpia, ponieważ typowe protokoły izolacji jąder mózgowych ssaków stosowane do mózgów karpiów konsekwentnie skutkowały niską jakością jąder w naszych rękach. Podejrzewamy, że jest to spowodowane niższą względną zawartością mieliny w mózgu karpiowatego w porównaniu z ich ssaczymi odpowiednikami, które ulegają lizie i zlepiają się w odpowiedzi na trudne warunki wymagane do lizy komórek mózgowych ssaków. Protokół ten stanowi postęp w dziedzinie starzenia się i karpiów, ponieważ ułatwia badanie starzenia się mózgu na poziomie pojedynczej komórki w efektywnym kosztowo i czasowo modelu starzenia się mózgu kręgowców. 
Protokół ten jest odporny na świeże lub mrożone próbki, chociaż należy wziąć pod uwagę dalsze zastosowania w przypadku stosowania świeżej lub zamrożonej tkanki. Zamrożona tkanka jest często wygodna, ponieważ można ją zbierać i przechowywać przez wiele miesięcy podczas pobierania próbek. Takie próbki mogą być bezpiecznie wykorzystywane do zastosowań takich jak sekwencja snRNA. Jednak zamrożenie próbek może zakłócić strukturę jądrową, a tym samym zdolność do dokładnego pomiaru krajobrazu chromatyny za pomocą ATAC-seq21. W związku z tym w przypadku dalszych zastosowań, takich jak masowy ATAC-seq lub snATAC-seq, zaleca się używanie świeżo wypreparowanych mózgów zamiast zamrożonych. Ponadto, ponieważ wszystkie etapy po homogenizacji mózgu mogą być wykonywane równolegle, protokół ten umożliwia badanie wielu próbek w rozsądnym czasie, ograniczając w ten sposób degradację RNA spowodowaną długotrwałą inkubacją na lodzie.
Ponadto konieczne jest przygotowanie świeżo (w ciągu kilku godzin) od przeprowadzenia ekstrakcji jąder. Stwierdziliśmy, że detergenty oraz BSA muszą być dodawane do bezpośrednio przed rozpoczęciem stosowania protokołu. zawierające tylko sole (PBS, NaCl itp.) mogą być sporządzane w postaci koncentratów, sterylizowane filtrem (0,22 μm) i przechowywane przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej. Roztwory podstawowe BSA mogą być przygotowywane, sterylizowane i przechowywane w temperaturze 4 °C w ciągu kilku dni od ekstrakcji jąder (jeżeli są przygotowane z proszku), ale zawsze powinny być dodawane do stosowanych w niniejszym protokole bezpośrednio przed zastosowaniem protokołu. Zalecamy jednak przygotowanie rozwiązań BSA w dniu sporządzenia protokołu. W przypadku korzystania z gotowych roztworów BSA od strony trzeciej, zaleca się używanie świeżych, nieotwartych butelek. Stosowanie świeżego BSA zazwyczaj prowadzi do mniejszej zawartości zanieczyszczeń w preparatach jądrowych.
Niezależnie od tego, czy jako dane wejściowe wykorzystywane są świeże, czy mrożone, ważna jest ocena jakości jąder po ich izolacji. Chociaż protokół ten został specjalnie zaprojektowany, aby uniknąć nadmiernej lizy, jest to najczęstsza przyczyna utraty jakości jąder. Nadmierna liza może wynikać ze zbyt długiego czasu spędzonego w buforze do lizy, zbyt ostrożnego obchodzenia się z jądrami, takiego jak nadmierne pipetowanie za pomocą końcówki pipety o standardowym otworze, lub zbyt długiego czasu spędzonego między izolacją jąder a dalszymi aplikacjami (>1 h). Nadmiernie zlizywane jądra często mają uszkodzone peryferie jądrowe, które przeciekają DNA i powodują zlepianie się (ryc. 2B). Doprowadzi to do zwiększenia liczby multipletów i przyczyni się do powstania kwasów nukleinowych w tle, które będą zakłócać dalsze zastosowania, zwłaszcza sekwencję snRNA. Obie cechy można ocenić za pomocą mikroskopii po izolacji jąder. W przypadku zaobserwowania nadmiernego zlepiania się jądra zaleca się skrócenie etapu inkubacji lizy, aby zmniejszyć ryzyko nadmiernej lizy. Jako alternatywna metoda zwiększania singletów jąder, sortowanie komórek wspomagane fluorescencją (FACS) może być stosowane do wzbogacania o pojedyncze miejsca po tym protokole. Zauważamy jednak, że podczas pracy z już kruchymi jądrami z zamrożonej tkanki, naprężenia ścinające występujące podczas sortowania mogą prowadzić do zwiększonego pękania jądra, a tym samym do zwiększenia temperatury RNA/DNA w otoczeniu. Ponadto zauważamy, że czas wymagany do przeprowadzenia sortowania FACS dla jąder podczas przetwarzania wielu próbek wymagałby, aby wszystkie próbki jąder pozostawały na lodzie przez wiele godzin, podczas gdy inne próbki są sortowane. W związku z tym wydłużony czas oczekiwania podczas przetwarzania wielu próbek równolegle z podejściem FACS może również prawdopodobnie prowadzić do ogólnego obniżenia jakości jąder i zwiększyć ryzyko degradacji RNA. Tak więc, jeśli FACS jest pożądany w celu zmniejszenia szybkości dubletów, zalecamy, aby zawartość zanieczyszczeń została ponownie sprawdzona po sortowaniu plonów i aby ewentualnie obniżona jakość RNA została uwzględniona w zastosowaniach sekwencyjnych RNA pojedynczych komórek jako potencjalne zastrzeżenie. 
Dokładne oszacowanie liczby jąder i proporcji singletów jest niezbędne dla prawie wszystkich dalszych zastosowań "omicznych" i ma ogromne znaczenie. Ze względu na możliwość łatwego bramkowania i liczenia jąder według wielkości, cytometria przepływowa jest najdokładniejszą metodą liczenia jąder, jaką oceniliśmy. Alternatywnie można określić ilościowo jądra za pomocą liczników komórkowych, takich jak Automatyczny licznik komórek Countess 2 FL firmy Invitrogen lub automatyczny licznik komórek DeNovix CellDrop. Warto zauważyć, że Countess 2 FL Automated Cell Counter firmy Invitrogen, a w znacznie mniejszym stopniu DeNovix, mają tendencję do zawyżania liczby jąder, licząc szczątki jako jądra, co oznacza, że może być wymagane ręczne bramkowanie rozmiaru. Ponadto cytometr przepływowy pozwala w łatwy sposób ocenić czystość jąder. Można dostrzec względną proporcję jąder singletowych w stosunku do jąder wielopletowych w sposób ilościowy, który jest trudny do zbadania przez mikroskopię. Ma to zasadnicze znaczenie dla snRNA-seq i snATAC-seq, ponieważ protokoły te będą cierpieć z powodu nadmiaru próbek wielokrotnych, które należy wykluczyć z dalszych analiz. Oprócz wielokrotności, względna proporcja "śmieci" (rozdrobnione jądra, szczątki komórkowe) może być określona ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej i musi być stosunkowo niska, ponieważ materiał ten często zawiera zanieczyszczające kwasy nukleinowe, które mogą przyczyniać się do sygnału tła i zniekształcać dane "omiczne" pojedynczego jądra. 
Podobnie jak w przypadku wcześniej opisanych protokołów izolacji jąder, proporcje typów komórek w oryginalnej tkance mogą nie być wiernie odtworzone w preparacji jąder19, a zatem powinny być interpretowane z ostrożnością. Należy zauważyć, że podobnie jak wszystkie teleosty, afrykańskie turkusowe karpiowate mają jądrzaste erytrocyty, które również mają być reprezentowane w przygotowaniu jąder. Jądra te można zidentyfikować w zestawach danych snRNA-seq i snATAC-seq na podstawie wyższej ekspresji/dostępności genów hemoglobiny i w razie potrzeby można je wykluczyć obliczeniowo.

Zrozumienie mechanizmów starzenia się mózgu kręgowców jest kluczowe dla rozwiązania problemów związanych z wiekiem chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i demencja1. Afrykański turkusowy killifish (Nothobranchus furzeri) jest najkrócej żyjącym kręgowcem, który może być hodowany w niewoli, a ze względu na krótką długość życia i związane z wiekiem upośledzenie funkcji poznawczych jest doskonałym modelem starzenia się mózgu2,3,4,5. Niedawne pojawienie się technologii "omicznych" pojedynczych komórek, takich jak sekwencjonowanie pojedynczych jąder RNA (snRNA-seq) i test pojedynczych jąder dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem (snATAC-seq), pozwoliło naukowcom na zbadanie starzejącego się mózgu w niespotykanej dotąd rozdzielczości6,7,8. Metody te opierają się na izolacji jąder, ponieważ odzyskanie komórek mózgowych, takich jak neurony, jest często zbyt trudne do wyizolowania6,7,8,9,10. Jednak większość opublikowanych protokołów izolacji jąder jest zoptymalizowana pod kątem organizmów modelowych ssaków11,12,13,14,15. W związku z tym, że obecnie istnieje niezaspokojona potrzeba izolowania jąder mózgowych u karpiowatych jako nowego organizmu modelowego w dziedzinie badań nad starzeniem się2, celem tego protokołu jest ustalenie metody izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonej tkanki mózgowej karpia.
Tutaj ustanowiono usprawniony i solidny przepływ pracy, który wykorzystuje powszechnie dostępne materiały do izolowania wysokiej jakości jąder z mózgów karpiów. Protokół ten został zmodyfikowany z 10-krotnego protokołu Genomics dla mózgów myszy, aby uwzględnić niższą zawartość mieliny w mózgach afrykańskich turkusowych karpiów, kruchość zamrożonej tkanki i potrzebę zmniejszenia zawartości zanieczyszczeń otoczenia do zastosowań związanych z sekwencjonowaniem16. Rzeczywiście, wcześniej zoptymalizowane protokoły dla tkanki mózgowej ssaków17,18 prowadzą do złej jakości jąder (tj. nadmiernej lizy) i/lub wysokiej zawartości zanieczyszczeń, gdy są stosowane na zamrożonych mózgach karpiów, co czyni je nieodpowiednimi do stosowania z sekwencją snRNA-seq zgodnie z zaleceniami dla sekwencji RNA pojedynczych jąder przy użyciu mikrofluidyki (rysunek uzupełniający 1).
Oprócz izolacji jąder, pokazujemy, jak oceniać jakość i wydajność jąder za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. W tym artykule przedstawiono przykłady zarówno optymalnych, jak i nieoptymalnych wyników oraz omówiono rozwiązywanie problemów. Protokół ten został zaprojektowany i zoptymalizowany dla mrożonych mózgów karpiów, ale może być również stosowany bez większych modyfikacji na świeżo wypreparowanych próbkach karpiów. Jądra mózgu Killifish wyizolowane tą metodą zostały zoptymalizowane do stosowania w sekwencji RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq) jako dalsze zastosowanie, ale powinny być również możliwe do użycia w sekwencji snATAC i masowej sekwencji ATAC.

<table><tbody><tr><td>0,4% roztwór błękitu trypanowego</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa do grzechówek Conicle</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Młynek do tkanek</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>Homogenizator dounce</td></tr><tr><td>5 ml polistyrenu Probówka okrągłodenna</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M Chlorek sodu, Biologia molekularna klasy</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Roztwór płuczący</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Odpowiada to 1x PBS pH 7,2, 2 mM EDTA (używany do cytometrii przepływowej)</td></tr> <tr><td>Roztwór do usuwania zanieczyszczeń</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>Rurka DNA LoBInd Mikroskop</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Echo Revolve (wyposażony w obiektyw 60x)</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>Brak numeru katalogowego; Służy do wizualnej kontroli jąder.</td></tr><tr><td>Probówki z polistyrenu Falcon z okrągłym dnem, 5 ml</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>probówka FACS</td></tr><tr><td>Sitka komórkowe FLOWMI, 40 &mu; M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td><td>Określane jako filtry na końcówce w protokole</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258146-500 mL</td><td>Służy do obniżania pH TRIS z 8,0 do 7,4</td></tr><tr><td>Luneta sekcyjna Leica EZ4</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Brak numeru katalogowego</td></tr><tr><td>MACS BSA roztwór podstawowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu; M)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Cytometr przepływowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>Brak numeru katalogowego</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu, sześciowodny, klasa biologii molekularnej (proszek)</td><td>Millipore</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 16R Wirówka</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprowadnice Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Zamiennik</td><td>Roche</td><td>(Roche) 11332473001/ Katalog: 983739 P Kod: -102368106 (Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Surfact-Amps Roztwór detergentu</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Bez nukleaz HyPure Biologia molekularna Klasa</td><td>HyClone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNaza Inhibitor (50 000 U)</td><td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodku propidyny</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet TipOne RPT (o bardzo niskiej retencji, filtrowane) w 10 i mikro; L, 20 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1000 i mikro; Rozmiary L</td><td>USA Scientific</td><td>#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS 222)</td><td>Syndel</td><td>Tricaine10G</td><td>Syndel jest zatwierdzonym przez FDA dostawcą farmaceutycznej Tricaine</td></tr><tr><td>TRIS, 1 M, pH 8.0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr></tbody></table>

delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

Badanie starzenia się mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki w systemach kręgowców pozostaje wyzwaniem ze względu na koszty, czas i ograniczenia techniczne. Tutaj demonstrujemy protokół generowania bibliotek sekwencjonowania jednojądrowego RNA (snRNA-seq) z mózgów naturalnie krótko żyjących kręgowców afrykańskich turkusowych karpiów Nothobranchius furzeri. Afrykański turkusowy killifish żyje od 4 do 6 miesięcy i może być trzymany w opłacalny sposób, zmniejszając w ten sposób bariery kosztowe i czasowe związane z badaniem starzenia się mózgu kręgowców. Potrzebne są jednak dostosowane protokoły, aby wyizolować jądra o jakości wystarczającej do dalszych eksperymentów jednokomórkowych z mózgu młodych i starszych ryb. W tym miejscu demonstrujemy empirycznie zoptymalizowany protokół izolacji wysokiej jakości jąder z mózgu dorosłego afrykańskiego turkusowego killifisha, co jest kluczowym krokiem w generowaniu wysokiej jakości bibliotek omicznych pojedynczych jąder. Ponadto pokazujemy, że kroki mające na celu zmniejszenie zanieczyszczającego tła RNA są ważne dla wyraźnego rozróżnienia typów komórek. Podsumowując, protokół ten pokazuje wykonalność badania starzenia się mózgu w nietradycyjnych organizmach modelowych kręgowców.

Opisany tutaj protokół izolacji jąder komórkowych z mózgu ryby killifish został zoptymalizowany specjalnie dla tego gatunku i został przedstawiony w podsumowaniu na Rysunku 1. Oprócz ekstrakcji jąder, protokół szczegółowo opisuje różne metody oceny jakości i ilości wyizolowanych jąder. Rysunek 2 przedstawia przykłady jąder zdrowych (Rysunek 2A) oraz niezdrowych (Rysunek 2B) w ocenie mikroskopowej. Zdrowe jądra odpowiednie do dalszych analiz (Rysunek 2A) występują jako pojedyncze jądra z nienaruszoną błoną. Jak pokazano na Rysunku 2B, najczęstszym powodem niepowodzenia tego protokołu (oraz innych protokołów izolacji jąder) jest powstawanie jąder nadmiernie lizowanych, które charakteryzują się uszkodzonymi błonami jądrowymi. Często prowadzi to do agregacji jąder i może przyczyniać się do sygnałów tła w późniejszych zastosowaniach z powodu wycieku kwasów nukleinowych z pękniętych jąder. W przypadku zaobserwowania nadmiernej agregacji zaleca się zachowanie większej ostrożności podczas etapów homogenizacji w homogenizatorze Dounce i/lub skrócenie czasu inkubacji w buforze lizującym.
Niniejszy protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego oznaczenia liczby wyizolowanych jąder oraz określenia względnej proporcji jąder multipletowych w próbce. Ponadto cytometria przepływowa może być użyta do oceny względnej zawartości zanieczyszczeń w postaci debris, często będących fragmentami pękniętych jąder i innymi szczątkami komórkowymi, które mogą niekorzystnie wpływać na dalsze analizy próbki jąder. Reprezentatywne dane z cytometrii przedstawiono na Rysunku 3. Wysokiej jakości procedura izolacji jąder powinna przynieść: 1) niewielką frakcję debris oraz 2) wysoką frakcję jąder singletowych w stosunku do multipletowych (&gt; 80% frakcji jąder). Zastosowanie barwienia PI, które barwi kwasy nukleinowe, pozwala na oddzielenie jąder singletowych od debris i jąder multipletowych. Rysunek 3A przedstawia przykład preparatu zanieczyszczonego debris, natomiast Rysunek 3B jest przykładem wysokiej jakości eksperymentu.
<img alt="Schemat sekcji mózgu ryby killifish i izolacji jąder komórkowych; analiza cytometryczna i mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat izolacji jąder komórkowych z mózgu ryby killifish. Schemat eksperymentalny izolacji jąder komórkowych z zamrożonych lub świeżych mózgów ryb killifish. Po wyizolowaniu i ocenie, jądra mogą być wykorzystane w różnych analizach typu „omics”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces podziału komórki na obrazie mikroskopowym pokazujący morfologię komórek w skali 10 µM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ocena jakości jąder za pomocą mikroskopii. Jądra zmieszano w stosunku 1:1 z roztworem 0,4% błękitu trypanowego i wizualizowano na mikroskopie Echo Revolve przy użyciu obrazowania w polu jasnym z powiększeniem 60x. (A) Przykład jądra wysokiej jakości. Jądro występuje jako singlet, a błona jądrowa jest nienaruszona. (B) Przykład jąder słabej jakości. Błony jądrowe są uszkodzone, a jądra łączą się w dublety, prawdopodobnie z powodu wycieku lepkiego DNA, który jest widoczny w górnej części najwyższego jądra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy cytometrii przepływowej przedstawiające detekcję jąder i zanieczyszczeń z usunięciem i bez usuwania zanieczyszczeń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie jąder i ocena czystości metodą cytometrii przepływowej. Próbki jąder zabarwiono roztworem PI w rozcieńczeniu 1:100 i analizowano na cytometrze przepływowym. Jądra występują w formie singletów i multipletów w prawym górnym kwadrancie (A,B), gdzie singlety stanowią najniższą chmurę zdarzeń, a następnie dublety, triplety itd. w kolejności rosnącej. Zanieczyszczenia są oznaczone zdarzeniami w dwóch lewym kwadrantach. (A) Przykład niskiej jakości preparatu jąder, w którym pominięto etap usuwania zanieczyszczeń, a zanieczyszczenia stanowią &gt;40% zdarzeń. (B) Przykład wysokiej jakości próbki jąder z zastosowanym etapem usuwania zanieczyszczeń. W tym przykładzie zanieczyszczenia stanowią &lt;10% wszystkich zdarzeń zarejestrowanych przez cytometr przepływowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typ próbki (2 mózgi)</td>
			<td>Średnia wydajność (4 niezależne preparaty)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mózgi 5-tygodniowych samców</td>
			<td> 3,59 ± 1,76 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mózgi 10-tygodniowych samców</td>
			<td> 6,41 ± 1,33 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mózgi 15-tygodniowych samców</td>
			<td>14,59 ± 2,05 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mózgi 5-tygodniowych samic</td>
			<td> 2,54 ± 0,75 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mózgi 10-tygodniowych samic</td>
			<td> 4,66 ± 1,29 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mózgi żeńskie w 15. tygodniu rozwoju</td>
			<td> 7,95 ± 3,51 x 105</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Średnie oczekiwane wydajności z dwóch mózgów afrykańskiego killifish turquoise w zależności od płci i wieku. Średnie wydajności wyrażone jako 105 jąder ± błąd standardowy średniej z czterech niezależnych preparatów jąder w każdej kategorii.
Rycina uzupełniająca 1: Porównanie jakości izolacji jąder komórkowych przy użyciu standardowych protokołów i naszego zoptymalizowanego protokołu w zamrożonych mózgach ryb z rodzaju killifish. (A) Ocena jakości jąder komórkowych za pomocą mikroskopii. Jądra zmieszano w stosunku 1:1 z roztworem 0,4% Trypan Blue i wizualizowano pod mikroskopem przy użyciu obrazowania w świetle przechodzącym z powiększeniem 60x. (B) Ilościowe oznaczenie jąder komórkowych i zawartości zanieczyszczeń za pomocą cytometrii przepływowej. Próbki jąder zabarwiono rozcieńczeniem 1:100 PI i analizowano na cytometrze przepływowym. (C) Podsumowanie wskaźników oceny jakości w mikroskopii i cytometrii przepływowej dla różnych benchmarkowych protokołów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Schematyczne przedstawienie etapów usuwania zanieczyszczeń. (A) Schemat warstwowania przed wirowaniem w celu usunięcia zanieczyszczeń. (B) Schemat usuwania nadsączu po wirowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół izolowania jąder z mózgów krótkotrwałego modelu kręgowców Nothobranchius furzeri do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra lub test pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z sekwencjonowaniem (ATAC-seq).

Delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego Killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się

Studying brain aging at single-cell resolution in vertebrate systems remains challenging due to cost, time, and technical constraints. Here, we ...

Jest to pierwszy zoptymalizowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder do eksperymentów sekwencjonowania pojedynczych jąder przy użyciu zamrożonych mózgów afrykańskich turkusowych karpiów, nowego modelu kręgowców do badań nad starzeniem się. Protokół ten bardzo delikatnie izoluje jądra, co odróżnia go od ostrzejszych protokołów zoptymalizowanych dla innych organizmów z bardziej zmielinizowanymi mózgami, które powodują degradację jąder, gdy są stosowane u karpiów. Ta metoda będzie miała zasadnicze znaczenie dla zrozumienia starzenia się mózgu na poziomie pojedynczej komórki.Powinno to dobrze przekładać się na inne tkanki wymagające delikatniejszej izolacji jąder. Ten protokół jest przyjazny dla użytkownika. Najbardziej wymagającym zadaniem jest wirowanie gradientowe w celu usunięcia zanieczyszczeń, w którym lepiej jest być powolnym i dokładnym niż szybkim i niechlujnym.Procedurę zademonstrują Ari Adler i Brian Teefy, technik laboratorium badawczego i doktor habilitowany z laboratorium Benayoun. Po wypreparowaniu killifish rozmrażaj zamrożoną tkankę mózgową na lodzie przez 10 minut i zanurz mózg w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy jąder w dwumililitrowym homogenizatorze z odcinkowania. Podczas lizy próbki należy utrzymywać homogenizator na lodzie i unikać wytwarzania pęcherzyków.Odbić tkankę zgodnie z opisem w manuskrypcie i pozostawić próbkę na lodzie w homogenizatorze do odbijania przez dwie minuty. Następnie przecedź próbkę przez 70-mikrometrowy filtr komórkowy do 15-mililitrowej stożkowej rurki wstępnie pokrytej 5% BSA. Dodać cztery mililitry buforu do przemywania jąder do próbki, pipetując bufor do przemywania przez filtr komórkowy o średnicy 70 mikrometrów i wymieszać, delikatnie odwracając probówkę pięć razy.Za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego odwirować próbkę o sile 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant, delikatnie wlewając go do pojemnika na odpady płynne. Utrzymuj próbkę w pozycji pionowej i usuń pozostały bufor do płukania za pomocą pipety P1000.Natychmiast ponownie zawiesić jądra w jednym mililitrze buforu do przemywania jąder za pomocą końcówki do pipety P1000 o szerokim otworze. Następnie doprowadzić próbkę do pięciu mililitrów, dodając cztery mililitry buforu do płukania jąder i wymieszać, jak pokazano wcześniej. Osadzaj komórkę przez odwirowanie.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić jądra w jednym mililitrze buforu do przemywania jąder za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze. Teraz przenieś jądra do probówki do cytometrii przepływowej. Dodać 300 mikrolitrów roztworu do usuwania zanieczyszczeń do zawiesiny komórek i dokładnie wymieszać, pipetując końcówką o szerokim otworze, aż mieszanina będzie jednorodna.Trzymaj probówkę pod niewielkim kątem i delikatnie nałóż jeden mililitr buforu do płukania jąder na wierzch roztworu jąder za pomocą pipety P1000. Odwirować próbkę w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 3000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Całkowicie wyrzuć dwie górne fazy za pomocą pipety P1000.Przenieś dolną warstwę do 15-mililitrowej stożkowej rurki wstępnie pokrytej 5% BSA. Następnie doprowadzić objętość do 15 mililitrów za pomocą buforu do płukania jąder i wymieszać, trzykrotnie odwracając probówkę. Odwiruj probówkę o sile 1000G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wirniku kubełkowym.Ostrożnie usunąć supernatant i natychmiast ponownie zawiesić osad w 150 mikrolitrach buforu do przemywania jąder za pomocą końcówki do pipet o szerokim otworze. Zmień końcówkę do pipet na standardową o pojemności 300 mikrolitrów. Odpipetować całą próbkę, a następnie przymocować 40-mikrometrowy filtr na końcówce do końca końcówki pipety.Przefiltruj próbkę, mocno wyrzucając próbkę przez filtr do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej wiązalności DNA. W probówce FACS ponownie zawiesić 10 mikrolitrów przefiltrowanej próbki jąder w 90 mikrolitrach zalecanego buforu cytometrii przepływowej. Wybarwić próbki jodkiem propidyny w końcowym stężeniu jednego mikrograma na mililitr.Po skonfigurowaniu obszaru roboczego zgodnie z opisem w rękopisie uruchom przepływ, naciskając ikonę odtwarzania w prawym dolnym rogu. Sprawdź, czy w próbce nie ma pęcherzyków powietrza lub grudek, używając obszaru bocznego rozproszenia w porównaniu z HDRT. Sprawdź również wykres punktowy z boku i do przodu, aby sprawdzić, czy zdarzenia kumulują się w granicach okna.Aby uzyskać powiększony widok, kliknij dwukrotnie boczny obszar punktowy w stosunku do wykresu PerCP-Vio700-A. Kliknij przycisk w lewym górnym rogu paska narzędzi z prostopadłą linią, aby wybrać bramę kwadrantową. Następnie kliknij w dowolnym miejscu bocznego obszaru rozproszenia w stosunku do wykresu PerCP-Vio700-A, a kwadranty pojawią się wewnątrz wykresu.Kliknij w dowolnym miejscu na liniach podziału kwadrantu i przesuń kursor, aby zmodyfikować położenie kwadrantu. Umieść ćwiartki tak, aby lewy górny kwadrant zawierał szczątki, a prawy górny kwadrant zawierał jądra. Kliknij kwadratową, szarą ikonę I, aby otworzyć okno właściwości.Przejdź do zakładki funkcji regionu i upewnij się, że obok górnego elementu znajduje się zielony znacznik wyboru, wskazujący, że zaznaczony jest cały wykres. Pod listą funkcji kliknij liczbę na mikrolitr, aby wyświetlić zielony znacznik wyboru. Kliknij przycisk OK, a w każdym kwadrancie zostanie wyświetlona liczba danych na mikrolitr.Wybierz liczbę i sumę procentową na karcie funkcji regionu, aby wyświetlić nieprzetworzone liczby i wartości procentowe w razie potrzeby. Narysuj wielokątną bramę wokół tej populacji, klikając przycisk wielokąta na lewym górnym pasku narzędzi. Następnie kliknij jeden raz i przesuń mysz, aby narysować liniowy segment bramy.Kliknij ponownie, aby zakończyć i rozpocząć następny, a następnie kliknij dwukrotnie, aby zakończyć bramę. Kliknij obramowanie bramy i przesuń mysz, aby zmienić położenie bramy. Kliknij wierzchołki bramy, aby zmodyfikować kształt, a pojawi się liczba na mikrolitr bramkowanej populacji.Zdrowe jądra, które pojawiły się jako jądra singletowe z nienaruszonymi błonami, nadają się do dalszej analizy. Jednak niezdrowe jądra charakteryzują się uszkodzonymi błonami jądrowymi, co prowadzi do zlepiania się jąder i może przyczyniać się do sygnałów tła w dalszych zastosowaniach. Jądra występują w formie singletowej i wielopletowej w prawym górnym kwadrancie, przy czym najniższą chmurą zdarzeń są singlety, a następnie dublety i trójki w porządku rosnącym.Szczątki są oznaczone zdarzeniami w dwóch skrajnych lewych kwadrantach w preparacji jąder niskiej jakości, w których pominięto etap usuwania gruzu. Śmieci stanowią ponad 40% zdarzeń. Jednak w eksperymencie wysokiej jakości szczątki stanowią mniej niż 15% wszystkich zdarzeń.Konieczne jest całkowite usunięcie środkowej warstwy po etapie wirowania usuwania zanieczyszczeń, aby zmniejszyć zanieczyszczenie tła RNA Jądra wyizolowane przy użyciu tego protokołu mogą być używane do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder lub sekwencjonowania ATAC w celu uzyskania informacji transkryptomicznej i epigenetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Technika ta pozwoli naukowcom zbadać regulację genów mózgu na poziomie pojedynczej komórki u afrykańskich turkusowych karpiów, naturalnie krótko żyjących kręgowców będących organizmem modelowym do badań nad starzeniem się.

gentle-isolation-nuclei-from-brain-tissue-adult-african-turquoise

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół opisuje technikę izolowania fluorescencyjnie znakowanych komórek nowotworowych ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) komórek nowotworowych z dorosłego danio pręgowanego i ilościowego oznaczania ich za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego.

Fluorescencyjnie znakowana izolacja komórek T-ALL: metoda izolacji komórek T-ALL od dorosłych danio pręgowanego

Ten film opisuje protokół izolacji neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego poprzez mechaniczne niszczenie tkanki mózgowej. Oczyszczone populacje komórek można następnie wykorzystać do analizy genomicznej.

Izolacja komórek mózgowych z larw danio pręgowanego: technika uzyskiwania nienaruszonych neuronów, makrofagów i mikrogleju z tkanki mózgowej danio pręgowanego

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Tutaj oferujemy powtarzalną metodę badania neurogenezy u dorosłych za pomocą testu neurosfery pochodzącego z całego mózgu lub z obszaru kresomózgowia, tektalu lub móżdżku mózgu dorosłego danio pręgowanego. Dodatkowo opisujemy procedurę manipulowania ekspresją genów w neurosferach danio pręgowanego.

Izolacja i hodowla neurosfer mózgowych dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje syntezę, charakterystykę i wstrzykiwanie monomerycznych peptydów amyloidu-β42 do generowania toksyczności amyloidu u dorosłych ryb pręgowanego w celu stworzenia modelu choroby Alzheimera, a następnie analizy histologiczne i wykrywanie agregacji.

Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Dodatkowo przetestowano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Pomieszczenia laboratoryjne turkusowych ryb mogą być skalowane do hodowli i efektywnego hodowania tysięcy pojedynczych ryb w centralnym systemie filtracji wody, wykorzystując tę samą infrastrukturę, która jest używana w standardowych obiektach dla danio pręgowanego. Poniżej przedstawiamy listę ustandaryzowanych procedur, które pozwalają na efektywną hodowlę karpiów.

Protokół przetrzymywania w laboratoriach turkusowych ryb (Nothobranchius furzeri)

Przedstawiamy protokół izolowania neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Po wyizolowaniu RNA jest ekstrahowane z tych komórek w celu analizy ich profilu ekspresji genów. Protokół ten pozwala na zbieranie wysokiej jakości RNA do przeprowadzania dalszych analiz, takich jak qPCR i transkryptomika.

Izolacja i ekstrakcja RNA neuronów, makrofagów i mikrogleju z mózgów larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Naucz się delikatnej izolacji jąder z mózgu afrykańskiego turkusowego killifisha, modelu do badań nad starzeniem. Metoda umożliwia sekwencjonowanie RNA i ATAC-seq na poziomie pojedynczych komórek.

Delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego Killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się (Wideo) | JoVE Journal

Delikatna izolacja jąder od tkanki mózgowej dorosłego afrykańskiego turkusowego Killifisha, naturalnie krótkotrwały model do badań nad starzeniem się

Przeglądaj więcej filmów