Name: Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj szybką metodę monitorowania metylacji cytozyny w zarodkach Danio rerio. Ta technika umożliwia wykrywanie zmian epigenetycznych wywołanych czynnikami chemicznymi w sposób efektywny kosztowo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie badawcze zostało zapewnione przez UCR Graduate Division Fellowship dla SAB, stypendium NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) dla SAB, a także grant National Institutes of Health (R01ES027576) i USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) dla DCV.

Dorośli hodowcy byli traktowani zgodnie z zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokołem użytkowania zwierząt (#20180063) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside.
1. Pobieranie zarodków danio pręgowanego i ekspozycja chemiczna
<ol>
	<li>Dodaj pułapki hodowlane w zbiorniku do zbiorników zawierających dojrzałe płciowo i zdolne do reprodukcji dorosłe samce i samice danio pręgowanego. Dodaj co najmniej trzy pułapki na zbiornik o pojemności 6 litrów co najmniej 12 godzin przed zbiorem o godzinie ~9:00, co jest przybliżonym czasem zapłodnienia i tarła jaj w zbiornikach.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór ekspozycyjny rano w dniu pobrania. Roztwór ekspozycyjny przygotowuje się za pomocą pipety o pojemności 5 ml i dodając 5,0 ml wody systemowej wolnej od cząstek stałych do szklanej szalki Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	<li>Następnie za pomocą szklanej pipety mikrokapilarnej o pojemności 10 μl przenieść 10 μl nośnika (dimetylosulfotlenku lub DMSO) lub chemicznego roztworu podstawowego do wody systemowej w szklanym naczyniu.</li>
	<li>Zakręć szklaną szalką Petriego, aby upewnić się, że roztwór podstawowy się rozproszy. Dodaj kolejne 5,0 ml wody systemowej do szklanej szalki Petriego. Zamieszaj szklaną szalkę Petriego, aby homogenizować roztwór ekspozycyjny.</li>
	<li>Powtórzyć dla każdej grupy poddanej działaniu substancji w powtórzeniach po cztery, aby uzyskać cztery kontrpróby na badanie.</li>
	<li>Po przygotowaniu roztworów ekspozycyjnych przykryj szklane naczynia szklanymi pokrywkami, aby zminimalizować parowanie.</li>
	<li>Wyjmując pułapki hodowlane z każdego zbiornika, ostrożnie pozwól, aby woda z każdej pułapki spłynęła do zbiornika przed wyjęciem ze zbiorników. Upewnij się, że pułapki pozostają prawą stroną do góry.</li>
	<li>Przenieś pułapki hodowlane do zlewu laboratoryjnego i opłucz je za pomocą butelki ze spryskiwaczem wypełnionej wodą z odwróconej osmozy (RO) do siatki rybackiej uprzednio nasączonej 10% wybielaczem i spłukanej wodą. Opłucz zarodki, aż wszystkie zanieczyszczenia zostaną usunięte i pozostaną tylko czyste zarodki.</li>
	<li>Przenieś zarodki z sieci rybackiej za pomocą wypełnionej wodą butelki do zraszania RO do plastikowej szalki Petriego o średnicy 100 mm. Losowo posortuj 50 żywych zarodków po 0,75 godziny po zapłodnieniu (hpf) i usuń nadmiar wody RO.</li>
	<li>Za pomocą mikroszpatułki umieść posortowane zarodki w roztworze leczniczym. Wszystkie zarodki muszą znajdować się w roztworze do napełniania lub roztworze leczniczym nie wcześniej niż o godz. 9.45. Zakręć szklanymi naczyniami, aby upewnić się, że zarodki są równomiernie pokryte roztworem leczniczym.</li>
	<li>Po ustawieniu czterech powtórzonych szalek (N = 50 na kontrpróbę) dla każdej grupy poddanej działaniu substancji, umieścić szklaną pokrywkę na szalkach ekspozycyjnych i przenieść wszystkie szalki do inkubatora o kontrolowanej temperaturze ustawionej na 28 °C do uzyskania 2 hpf, 4 hpf, 6 hpf, 8 hpf lub 10 hpf.</li>
	<li>Przygotować świeży 4% paraformaldehyd (PFA) co najmniej 4 godziny przed zakończeniem ekspozycji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Włączyć płytę grzejną do 115 °C, przygotować 20 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (2 ml 10x PBS + 18 ml wody RO) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i odważyć 800 mg paraformaldehydu.</li>
		<li>W dygestorium chemicznym przenieść 1x roztwór PBS do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, dodać 800 mg paraformaldehydu, a następnie dodać 2 μl 10 N NaOH. Umieść termometr w kolbie, umieść kolbę na płycie grzejnej i obserwuj temperaturę podczas mieszania.</li>
		<li>Gdy temperatura osiągnie 62-65 °C, wyjmij 4% PFA z płyty grzejnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej (RT). Przechowywać 4% PFA w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po upływie czasu ekspozycji należy wyjąć zarodki z inkubatora i przenieść wszystkie żywe zarodki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Odessać roztwór resztkowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Nie odsysaj żadnych zarodków.</li>
	<li>Dodać 500 μl schłodzonego 4% PFA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wymieszać zarodki w 4% PFA, kilkakrotnie odwracając. Pozwól zarodkom związać się w 4% PFA przez noc. 
	UWAGA: Nie zaleca się, aby zarodki pozostawały w PFA dłużej niż 12 godzin.</li>
</ol>
2. Dechorionacja zarodków
<ol>
	<li>Następnego dnia odessać 4% PFA, ponownie zawiesić zarodki w 1x PBS i delikatnie pipetować w górę iw dół przez 30 sekund. W razie potrzeby należy przerwać stosowanie protokołu na tym etapie i przechowywać zarodki w 1x PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 48 godzin.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej ostrożnie przenieś utrwalone zarodki do szklanego naczynia wypełnionego wodą RO i delikatnie obracaj przez 30 sekund. Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
	<li>Użyj igieł strzykawkowych w powiększeniu 5,0x przy użyciu standardowego mikroskopu stereoskopowego, aby ręcznie usunąć zakrętówkę wszystkich zarodków. Zrób to, używając końcówki igły, aby nakłuć kosmówkę i delikatnie oderwać ją od żółtka i masy komórkowej4.</li>
	<li>Po dekorionacji zarodków należy użyć szklanej pipety mikrokapilarnej, aby przenieść do 25 nienaruszonych zarodków do jednego kosza immunochemicznego (IHC) i umieścić kosz IHC na płytce 96-dołkowej. Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby zassać wodę RO z każdej studzienki.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia z użyciem przeciwciała specyficznego dla 5-mC
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić zarodki w 500 μl buforu blokującego (1x PBST + 2% surowicy owczej + 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej) na dołek i owinąć płytkę parafilmem i folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 godziny na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).</li>
	<li>Usuń folię parafilmową i aluminium i użyj pipety o pojemności 1 ml, aby zassać bufor blokujący z każdej studzienki. Zastąp go 500 μl monoklonalnego mysiego przeciwciała anty-5-mC w roztworze monoklonalnym 1:100 w buforze blokującym. Inkubować wszystkie zarodki z pierwszorzędowymi przeciwciałami, z wyjątkiem podzbioru zarodków kontrolnych na nośniku, które będą inkubowane z buforem blokującym w celu uwzględnienia szumu tła. Na tym etapie należy uważać, aby nie naruszyć integralności zarodków ani nie zasysać zarodków.</li>
	<li>Ponownie owinąć płytkę w parafilm i folię aluminiową i pozostawić płytkę do inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).</li>
	<li>Następnego dnia usuń pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z każdej studzienki i zastąp go 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Umyj każdą studzienkę trzy razy 1x PBST przez 15 minut na pranie na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).</li>
	<li>Zastąp 1x PBST rozcieńczeniem 1:500 koziego przeciwciała anty-mysiego IgG w buforze blokującym i inkubuj wszystkie zarodki z przeciwciałem drugorzędowym. Pozostawić płytkę do inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min).</li>
	<li>Następnego dnia usunąć przeciwciało wtórne i przemyć pozostały roztwór trzykrotnie 1x PBST przez 15 minut na przemycie na wytrząsarce orbitalnej (100 obr./min). 
	UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać zatrzymany na okres do 48 godzin, jeśli kosze IHC są przechowywane w czystych studzienkach wypełnionych 1x PBS.</li>
	<li>Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby odessać 1x PBST z każdej studzienki i umieść kosz IHC w szklanej szalce Petriego wypełnionej wodą RO. Pod standardowym mikroskopem stereoskopowym losowo posortuj nienaruszone zarodki na 96-dołkową płytkę, co daje jeden zarodek na dołek.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml usuń całą wodę RO z poszczególnych studzienek i zastąp ją 200 μl 1x PBS. Odwirować płytkę przez 3 minuty przy 1 x g.</li>
</ol>
4. Automatyczne obrazowanie zarodków na płytkach 96-dołkowych
<ol>
	<li>Zobrazuj zarodki za pomocą obiektywu 2x w świetle przechodzącym i FITC przy użyciu systemu badań przesiewowych o wysokiej zawartości (tabela materiałów). 
	UWAGA: Fluorescencyjny obraz każdego zarodka został uchwycony automatycznie przy użyciu wyżej wymienionego powiększenia i filtra FITC19.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję Autofokus, aby upewnić się, że ostrość aparatu znajduje się na spodzie płyty i jest przesunięta o grubość dna.</li>
		<li>Wybierz długość fali FITC o czasie naświetlania 100 ms i ustaw autofokus na laser z przesunięciem Z. Obserwuj i potwierdź prawidłową akwizycję obrazu w kilku studzienkach przed rozpoczęciem akwizycji płytki. 
		UWAGA: Przyrząd automatycznie pobiera obrazy ze wszystkich wybranych studzienek zawierających zarodki. 96-dołkowa płytka wymagała około 30 minut na akwizycję obrazu i przechowywanie danych. Przez cały okres akwizycji temperatura wewnętrzna w systemie obrazowania była utrzymywana na poziomie RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pozyskaniu obrazu przeprowadź analizę danych przy użyciu systemu badań przesiewowych o wysokiej zawartości i niestandardowej procedury automatycznej analizy obrazu. Wybierz każdy zarodek na 96-dołkowej płytce do analizy pod kątem całkowitej powierzchni i zintegrowanej intensywności fluorescencji. 
	UWAGA: Analiza obejmowała dostarczenie obrazów, które zawierały nakładki punktów danych z analizy.</li>
	<li>Następnie uporządkuj punkty danych w tabelach i wyeksportuj je z systemu klasyfikowania o wysokiej zawartości, przechodząc do obszaru Miara i wybierając pozycję Otwórz dziennik danych do arkusza kalkulacyjnego. Fragmenty akwizycji płyt i analizy danych są przedstawione na <silna klasa="xfig">Rysunek 1.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Prześlij wyeksportowany arkusz kalkulacyjny do programu komputerowego, w którym pakiet deployer (dplyr) jest używany do sortowania, sumowania danych dla każdego dołka i filtrowania według numeru odwiertu. Pakiet writexl jest następnie używany do eksportowania zsumowanych danych do arkusza kalkulacyjnego. Kod programu 5mC jest pokazany w pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li>
<li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078(2022).</li>
<li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179(2021).</li>
<li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699(2019).</li>
<li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li>
<li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands%2C+cytosine+methylation%2C+and+the+metabolome+in+driving+tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li>
<li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li>
<li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li>
<li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation-mediated+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li>
<li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li>
<li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li>
<li>Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li>
<li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Podczas tego protokołu należy wykonać kilka kroków, które są krytyczne. Po pierwsze, podczas dekorionacji zarodków ważne jest, aby skierować igłę z dala od tkanki zarodka/woreczka żółtkowego/masy komórkowej, ponieważ te części rozwijającego się zarodka są bardzo delikatne i łatwe do nakłucia. Po drugie, przenosząc oznakowane zarodki do poszczególnych studzienek, użyj szklanej pipety do transferu zarodków, ponieważ będą one przylegać do plastikowej pipety. Po trzecie, podczas wykonywania całego montażu IHC należy upewnić ...

Modyfikacje enzymatyczne napędzają aktywną metylację i demetylację cytozyny do 5-metylocytozyny (5-mC), a następnie utlenianie 5-mC do 5-hydroksymetylcytozyny, 5-formylocytozyny i 5-karboksylcytozyny1,2. Fosforan tris(1,3-dichloro-2-propylu) (TDCIPP) jest szeroko stosowanym środkiem zmniejszającym palność w Stanach Zjednoczonych, który, jak wykazano wcześniej, zmienia trajektorię metylacji cytozyny po wczesnej ekspozycji embrionalnej od 0,75 godziny po zapłodnieniu (HPF) do wczesnej gastrulacji (6 HPF)3,4,5,6,7,8. U kręgowców 5-mC i jego zmodyfikowane pochodne mają kluczowe znaczenie dla regulacji wczesnego rozwoju embrionalnego9. Zapłodnienie zarodka wyzwala demetylację rodzicielskiego DNA, a następnie degradację mRNA matki, aktywację genomu zygotycznego i remetylację genomu zygotycznego9. Biologicznie istotne procesy wykorzystujące metylację cytozyny obejmują modyfikację histonów, rekrutację maszynerii transkrypcyjnej, metylację RNA, przeprogramowanie epigenetyczne i określenie struktury chromatyny10,11. Metylacja cytozyny jest również zachowana wśród gatunków kręgowców, co podkreśla znaczenie zrozumienia i zbadania, w jaki sposób nieprawidłowa metylacja cytozyny może wpływać na trajektorię rozwoju organizmu11. Co więcej, rozwój in utero jest wrażliwy na narażenie matki i może powodować niekorzystne skutki, takie jak natychmiastowe konsekwencje fenotypowe, długoterminowy wpływ na podatność na choroby dorosłych i międzypokoleniowe skutki dziedzicznych cech epigenetycznych12,13,14.
Długie odcinki par cytozyna-guanina, czyli wyspy CpG, były głównymi ogniskami badaczy, którzy dążą do scharakteryzowania dynamiki metylacji cytozyny w całym genomie15,16,17. Strategie oparte na wodorosiarczynach, takie jak sekwencjonowanie wodorosiarczynów w całym genomie, sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji i sekwencjonowanie amplikonów wodorosiarczynowych, stanowią złoty standard w badaniu metylacji cytozyny w rozdzielczości par zasad. Jednak podejścia oparte na sekwencjonowaniu są zbyt kosztowne i jako takie wykluczają możliwość monitorowania metylacji cytozyny na różnych etapach rozwoju, wielu stężeń na substancję chemiczną i replikacji zarodków podczas leczenia. Ponadto podejścia oparte na sekwencjonowaniu nie dostarczają informacji o lokalizacji przestrzennej, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia potencjalnie dotkniętych typów komórek i obszarów w rozwijającym się zarodku. Podobnie, globalne testy metylacji DNA, takie jak analiza restrykcyjna zależna od metylacji, testy immunologiczne sprzężone z enzymami 5-mC (ELISA) i chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas 5-metylo-2'-deoksycytydyny (5-mC) (LC-MS) opierają się na homogenatach komórkowych lub tkankowych i jako takie wykluczają możliwość monitorowania lokalizacji i wielkości metylacji cytozyny w przestrzeni i czasie w nienaruszonych próbkach12,18.
Ze względu na łatwość zautomatyzowanego obrazowania in vivo, manipulacji genetycznych, szybkiego czasu rozwoju ex utero i hodowli podczas embriogenezy, zarodki danio pręgowanego są nadal szeroko stosowane jako fizjologicznie nienaruszone modele do odkrywania ścieżek za pośrednictwem ksenobiotyków, które przyczyniają się do niekorzystnych wyników podczas wczesnego rozwoju embrionalnego. W związku z tym, wykorzystując komercyjnie dostępne przeciwciała swoiste dla 5-mC, poniższy protokół opisuje opłacalną strategię szybkiego i wydajnego czasoprzestrzennego monitorowania metylacji cytozyny w pojedynczych, nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego poprzez wykorzystanie immunohistochemii całościowej (IHC), zautomatyzowanego obrazowania o wysokiej zawartości i wydajnego przetwarzania danych przy użyciu języka programowania przed analizą statystyczną.
Zgodnie z aktualnym wiedzą, ta metoda jest pierwszą metodą monitorującą 5-mC w nienaruszonych zarodkach danio młodego. Metoda umożliwia wykrycie metylacji DNA w obrębie masy komórkowej, a także ma zdolność wykrywania metylacji cytozyny matczynych mRNA zlokalizowanych w żółtku podczas przejścia od matczynego do zygotycznego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta będzie przydatna do szybkiej identyfikacji substancji chemicznych, które mogą potencjalnie zakłócać metylację cytozyny in situ podczas przeprogramowania epigenetycznego.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>540225</td><td></td></tr><tr><td>10- i mikro; Szklana pipeta mikrokapilarna</td><td>L Fisher Scientific</td><td>211762B</td><td></td></tr><tr><td>100-mm plastikowa szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757100D</td><td></td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 1 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific 13690032</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Kolba Erlenmeyera</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501250</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690033</td><td></td></tr><tr><td>60-milimetrowa szklana szalka Petriego z pokrywkami</td><td>Fisher Scientific</td><td>08747A</td> 96-dołkowa <td></td></tr><tr><td>płytka</td><td>Fisher Scientific</td><td>720089</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-sprzężona kozia anty-mysia IgG przeciwciało&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP67110</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2311</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110016SH</td><td></td></tr><tr><td>Pułapki hodowlane w zbiornikach</td><td>Siedliska wodne</td><td>N/A</td><td>Ten produkt nie jest już dostępny po przejęciu Aquatic Habitats przez Pentair.&nbsp; Badacze mogą korzystać ze standardowych zbiorników hodowlanych poza systemem dostępnych u wielu dostawców.</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>N/A</td><td>Każdy system przesiewowy o wysokiej zawartości wyposażony w światło przechodzące i filtr FITC będzie odpowiedni.</td></tr><tr><td>Kosz do immunochemii (IHC)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wyprodukowano we własnym zakresie przy użyciu probówek do mikrowirówek z usuniętą stożkową częścią i dnem wyposażonym w siatkę, dozowaną do płytek 24- lub 48-dołkowych.</td></tr><tr><td>MetaXpress 6.0.3.1658&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Odpowiednie będzie dowolne oprogramowanie zdolne do ilościowego określenia całkowitej powierzchni i zintegrowanej intensywności fluorescencji.</td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne mysie przeciwciało anty-5-mC</td><td>Millipore Sigma</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50998290</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>18612139</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>1368050</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio</td><td>N/A</td><td>RStudio to oprogramowanie typu open source, które można pobrać ze strony https://www.rstudio.com.</td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3772-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>10450103</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z kontrolowaną temperaturą&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR505755L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Metylacja cytozyny jest wysoce konserwatywna wśród gatunków kręgowców i, jako kluczowy czynnik programowania epigenetycznego i stanu chromatyny, odgrywa kluczową rolę we wczesnym rozwoju embrionalnym. Modyfikacje enzymatyczne napędzają aktywną metylację i demetylację cytozyny do 5-metylocytozyny (5-mC), a następnie utlenianie 5-mC do 5-hydroksymetylocytozyny, 5-formylocytozyny i 5-karboksylcytozyny. Przeprogramowanie epigenetyczne jest krytycznym okresem podczas rozwoju in utero, a narażenie matki na chemikalia może potencjalnie przeprogramować epigenom u potomstwa. Może to potencjalnie powodować niekorzystne skutki, takie jak natychmiastowe konsekwencje fenotypowe, długoterminowy wpływ na podatność na choroby u dorosłych oraz międzypokoleniowe skutki dziedzicznych cech epigenetycznych. Chociaż sekwencjonowanie oparte na wodorosiarczynach umożliwia badaczom badanie metylacji cytozyny w rozdzielczości par zasad, podejścia oparte na sekwencjonowaniu są zbyt kosztowne i jako takie wykluczają możliwość monitorowania metylacji cytozyny na różnych etapach rozwoju, wielu stężeń na substancję chemiczną i replikacji zarodków na leczenie. Ze względu na łatwość zautomatyzowanego obrazowania in vivo, manipulacji genetycznych, szybki czas rozwoju ex utero i hodowlę podczas embriogenezy, zarodki danio pręgowanego są nadal wykorzystywane jako fizjologicznie nienaruszony model do odkrywania szlaków za pośrednictwem ksenobiotyków, które przyczyniają się do niekorzystnych skutków we wczesnym rozwoju embrionalnym. Dlatego, korzystając z dostępnych na rynku przeciwciał specyficznych dla 5 mC, opisujemy opłacalną strategię szybkiego i wydajnego czasoprzestrzennego monitorowania metylacji cytozyny w indywidualnych, nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego poprzez wykorzystanie immunohistochemii całościowej, zautomatyzowanego obrazowania o wysokiej zawartości i wydajnego przetwarzania danych przy użyciu języka programowania przed analizą statystyczną. Zgodnie z obecnym stanem wiedzy, metoda ta jest pierwszą, która z powodzeniem wykryła i określiła ilościowo poziomy 5-mC in situ w zarodkach danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju. Metoda umożliwia wykrycie metylacji DNA w obrębie masy komórkowej, a także ma zdolność wykrywania metylacji cytozyny matczynych mRNA zlokalizowanych w żółtku podczas przejścia od matczynego do zygotycznego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta będzie przydatna do szybkiej identyfikacji substancji chemicznych, które mogą potencjalnie zakłócać metylację cytozyny in situ podczas przeprogramowania epigenetycznego.

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest ustalenie, czy dana terapia wpływa na względną obfitość 5-mC poprzez ocenę całkowitego obszaru i względnej intensywności fluorescencji w utrwalonych i znakowanych zarodkach ryb zebrafish. Po zakończeniu protokołu można wykorzystać stereomikroskop fluorescencyjny, aby w pierwszej kolejności stwierdzić, czy immunohistochemia (IHC) całego preparatu przebiegła pomyślnie. W przypadku obserwacji znakowanych zarodków przy użyciu filtra FITC lub GFP, wynik dodatni jest wskazywany przez po...

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Protokół ten oferuje stosunkowo szybką i opłacalną metodę, a także zautomatyzowane pozyskiwanie i analizę, co pozwala na badanie przesiewowe 5-metylocytozyny o niskiej czułości, która jest powszechnym biomarkerem epigenetycznym. Główną zaletą tej techniki jest elastyczność, jaką oferuje eksperymentalny projekt, który użytkownicy mogą zoptymalizować do swojego modelu i etapu rozwoju. Technika ta może być wykorzystana do wykrycia, w jaki sposób narażenie na chemikalia zmienia względną obfitość 5-metylocytozyny w rozwijającym się organizmie, co normalnie można osiągnąć tylko za pomocą drogich metod o wysokiej zawartości trpA, takich jak sekwencjonowanie.Metoda ta jest przydatna we wszelkich badaniach, które mają na celu wykorzystanie metod NCG do zrozumienia zmian epigenetycznych 5-metylocytozyny w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Zacznij od przygotowania świeżego roztworu ekspozycyjnego rano w dniu pobrania. Dodaj pięć mililitrów wody systemowej wolnej od cząstek stałych do 60-milimetrowej szklanej szalki Petriego.Następnie użyj szklanej pipety z mikrolitrami o pojemności 10 mikrolitrów, aby przenieść 10 mikrolitrów dimetylosulfotlenku lub chemicznego roztworu podstawowego do wody

rapid-efficient-spatiotemporal-monitoring-normal-aberrant-cytosine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Somitogeneza to rytmiczny proces rozwojowy, który przestrzennie kształtuje oś ciała zarodków kręgowców. Wcześniej opracowaliśmy transgeniczne linie ryb danio pręgowanego, które wykorzystują fluorescencyjne reportery do obserwacji cyklicznych genów napędzających ten proces. Tutaj hodujemy rozproszone komórki z tych linii i obrazujemy ich oscylacje w czasie in vitro.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Opisane tutaj protokoły pozwalają na badanie właściwości elektrycznych komórek pobudliwych w najbardziej nieinwazyjnych warunkach fizjologicznych poprzez wykorzystanie zarodków danio pręgowanego w systemie in vivo wraz z genetycznie kodowanym wskaźnikiem napięcia (GEVI) opartym na rezonansie fluorescencyjnym (FRET), selektywnie wyrażanym w interesującym typie komórki.

Biodetekcja potencjału błonowego neuronu ruchowego w żywych zarodkach danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany był ostatnio używany jako system modelowy in vivo do badania czasu replikacji DNA podczas rozwoju. Poniżej znajdują się szczegółowe protokoły wykorzystania zarodków danio pręgowanego do profilowania czasu replikacji. Protokół ten można łatwo dostosować do badania czasu replikacji u mutantów, poszczególnych typów komórek, modeli chorób i innych gatunków.

Profilowanie czasu replikacji DNA przy użyciu danio pręgowanego jako systemu modelowego in vivo

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Badanie to ustanawia czułą metodę obrazowania opartą na immunofluorescencji do ilościowego określenia globalnej metylacji DNA w pojedynczych zarodkach danio pręgowanych. To podejście pokonuje wyzwanie ograniczonej ilości tkanek i pomija konieczność konwersji bisulfytów.

Wykrywanie globalnej metylacji DNA w sercach larw danio pręgowanych

Poznaj szybką metodę monitorowania metylacji cytozyny w zarodkach Danio rerio. Ta technika umożliwia wykrywanie zmian epigenetycznych wywołanych czynnikami chemicznymi w sposób efektywny kosztowo.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów