Name: Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj precyzyjną edycję knock-in CRISPR-Cas9 w sercach Danio rerio z wykorzystaniem reportera fluorescencyjnego YFP. Metoda umożliwia modelowanie wariantów genetycznych związanych z zespołem długiego QT i badanie fenotypów kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant Canadian Institutes of Health Research Project (T.W.C.) oraz granty Discovery Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (T.W.C.).

<ol><li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+methods+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Genome editing methods in animal models.</a> Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+genome+editing+technology+in+animal+disease+modeling+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).</li>
<li>Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Little+fish%2C+big+data%3A+Zebrafish+as+a+model+for+cardiovascular+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease.</a> Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).</li>
<li>Kegel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+using+zebrafish+to+identify+new+genes+involved+in+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Oligodendrocytes%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination.</a> Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>González-Rosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+cardiac+disease%3A+From+fortuitous+mutants+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine.</a> Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).</li>
<li>Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+editing+of+the+Zebrafish+genome+made+simple+and+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient.</a> Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).</li>
<li>Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+CRISPR%2FCas9-based+knock-in+approaches+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish.</a> Methods. 121-122, 77-85 (2017).</li>
<li>Armstrong, G. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology+directed+knockin+of+point+mutations+in+the+zebrafish+tardbp+and+fus+genes+in+ALS+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 11 (3), 0150188(2016).</li>
<li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+modification+by+a+long+ssDNA+template+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish.</a> BMC Genomics. 21 (1), 67(2020).</li>
<li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+zebrafish+models+for+inherited+disorders+using+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429(2021).</li>
<li>Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+zebrafish+knock-in+reporter+lines+in+the+nefma+gene+by+Cas9-mediated+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination.</a> Genesis. 58 (1), 23340(2020).</li>
<li>Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4 (1), 6545(2014).</li>
<li>Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knock-in+tagging+in+zebrafish+facilitated+by+insertion+into+non-coding+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions.</a> Development. 148 (19), (2021).</li>
<li>Prykhozhij, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+knock-in+of+point+mutations+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Nucleic Acids Research. 46 (17), 102(2018).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Boel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+homology-directed+repair+by+ssODNs+in+zebrafish+induces+complex+mutational+patterns+resulting+from+genomic+integration+of+repair-template+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Tessadori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+CRISPR%2FCas9-based+nucleotide+editing+in+zebrafish+to+model+human+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+generating+somatic+point+mutations+with+germline+transmission+in+the+zebrafish+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).</li>
<li>Vornanen, M., Hassinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+heart+as+a+model+for+human+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology.</a> Channels. 10 (2), 101-110 (2016).</li>
<li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart%3F+An+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biology. 17 (1), 148(2016).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+3.+E.15%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%2C+Book+1%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Kossack, M. E., Draper, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+sex+determination+and+maintenance+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio).</a> Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+KCNH2+gene+mutations+of+type+2+long+QT+syndrome+in+larval+zebrafish+using+microscopy+and+electrocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography.</a> Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).</li>
<li>Dhillon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+embryonic+and+larval+ECG+measurement+in+zebrafish+for+quantifying+the+effect+of+QT+prolonging+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs.</a> PLoS One. 8 (4), 60552(2013).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+cardiac+conduction+phenotypes+in+developing+zebrafish+larvae%3A+Implications+to+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity.</a> Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).</li>
<li>Hurst, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+optimization+of+tools+for+embryonic+electrocardiograph+recording+for+heart+dysfunction+in+zebrafish%22">Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish</a>. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>Arnaout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+for+human+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model for human long QT syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).</li>
<li>Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+that+induce+repolarization+abnormalities+cause+bradycardia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish.</a> Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).</li>
<li>Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+express+an+orthologue+of+HERG+and+are+sensitive+toward+a+range+of+QT-prolonging+drugs+inducing+severe+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).</li>
<li>MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%3A+In+vivo+screening+in+the+zebrafish+to+overcome+complexity+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Inżynieria precyzyjnych edycji genów przy użyciu CRISPR-Cas9 jest wyzwaniem ze względu na niską wydajność mechanizmów HDR i ich skuteczne wykrywanie. W tym miejscu opisano podejście oparte na CRISPR-Cas9 do zastępowania eksonów dwoma sgRNA, które zapewnia precyzyjne edycje u danio pręgowanego z prostym wizualnym wykrywaniem pozytywnych edycji. Skuteczność tego podejścia wykazano poprzez generowanie precyzyjnych edycji w genie zkcnh6a . W pracy pokazano, w jaki sposób można ocenić czynność serca u larw danio pręg...

Strategie edycji genów oparte na CRISPR w modelach zwierzęcych umożliwiają badanie genetycznie dziedzicznych chorób, rozwoju i toksykologii na poziomie całego organizmu1,2,3. Danio pręgowany stanowi potężny model, który w wielu aspektach fizjologicznych jest bliższy ludziom niż modele komórek mysich lub pochodzących od ludzi4. Szeroki wachlarz narzędzi i strategii genetycznych został wykorzystany u danio pręgowanego zarówno dla forward5, jak i reverse genetic screening6. Kompleksowe mapowanie genetyczne i adnotacje u danio pręgowanego ułatwiły podejście do edycji genów jako podstawową technikę inżynierii celowanych nokautów genów (KO) i precyzyjnych knock-inów (KIs)7.
Pomimo tego, generowanie precyzyjnych edycji KI u danio pręgowanego jest ograniczone przez niską wydajność i trudność dokładnego wykrywania. Chociaż nukleazy efektorowe podobne do czynników transkrypcyjnych (TALEN) zostały z powodzeniem wykorzystane i zoptymalizowane pod kątem KIs8, CRISPR zapewnia ulepszoną strategię edycji genów z prostszym celowaniem w sgRNA. W licznych badaniach wykorzystano CRISPR do generowania precyzyjnych wskaźników KI u danio pręgowanego9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, chociaż te edycje wygenerowane przez naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR) za pośrednictwem CRISPR są zwykle nieefektywne z niskimi wskaźnikami wewnętrznej skuteczności, które wymagają genotypowania jako głównego ekranu9,10,14,21. Świadczy to o potrzebie wydajnego systemu KI CRISPR u danio pręgowanego, a także niezawodnego systemu o wysokiej przepustowości do wykrywania precyzyjnych edycji.
Celem tego badania było opisanie platformy do generowania precyzyjnego genu sercowego KI w sercach danio pręgowanego z prostym i wysokoprzepustowym wykrywaniem udanych edycji. Opisano podejście oparte na CRISPR-Cas9 do zastępowania eksonów dwoma sgRNA, które opiera się na podejściu TALEN8. Podejście to polega na wycięciu sekwencji docelowej przy użyciu dwóch przewodników sgRNA i zastąpieniu egzogenną sekwencją matrycy, która zawiera interesujący nas KI, a także genetycznie kodowany gen reporterowy intronowy (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Integracja genetycznie kodowanego reportera fluorescencyjnego w sekwencji intronowej genu docelowego umożliwia skuteczne wykrywanie edycji dodatnich. Następnie opisano platformę fenotypowania do oceny funkcji elektrycznej serca u larw danio pręgowanego w celu nieinwazyjnej charakterystyki wariantów genów związanych z dziedzicznym LQTS, zaburzeniem elektrycznym serca, które predysponuje osoby do nagłej śmierci sercowej.
Te podejścia zwiększą dostęp i wykorzystanie edycji genów KI danio pręgowanego do modelowania chorób dziedzicznych oraz rozwiązywania problemów biologicznych i fizjologicznych, takich jak mapowanie wzorców ekspresji genów i regulacja rozwoju. Ponieważ serca danio pręgowanego są lepiej równoległe do cech elektrofizjologicznych ludzkiego serca niż modele mysie, mogą być szczególnie atrakcyjne jako genetycznie podatny system do modelowania chorób serca7,22,23.

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Infrastructure</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>Europejski Instytut</td><td></td><td></td>Bioinformatyki</tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>Open Source (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>Nowa Anglia Biolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm szalka Petriego</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 Kamera</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5415C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu EZNA</td><td>Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7 Zestaw do transkrypcji</td><td>Inkubator Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000</td> Zestaw do miniprepu <td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr> Zestaw do <tr><td>transkrypcji</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 Ultra</td> Spektrofotometr <td></td> Invitrogen <td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000</td><td>Zestaw do oczyszczania Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A Picoinjector</td><td>Aparat</td><td></td><td></td>Harvard</tr><tr><td>PowerPac Podstawowy zasilacz</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Steroskop</td> System elektroforezy <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec Obudowa danio pręgowanego System</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Synthesis</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sekwencjonowanie</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10&beta; Kompetentne komórki</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Bufor PCR</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Mieszanina nukleotydów</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI Endonukleaza z buforem</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI Endonukleaza z buforem</td><td>Plazmid NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 (XL1 Niebieski bakteryjny agar stab)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI Endonukleaza z buforem</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII Endonukleaza z buforem</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Plazmid Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 (XL1 Niebieski bakteryjny agar stab)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (Trikaina)</td>Plazmid <td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 (DH5 i alfa; bakteryjny agar stab)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI Endonukleaza z buforem</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza SalI z buforem</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza z buforem</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimeraza</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE Bufor</td><td>Chlorowodorek Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Endonukleaza</td><td></td> Sigma XhoI z buforem NEB<td></td><td></td></tr><tr><td>RECIPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>Solution Dostawca składników <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do wyżarzania (pH 7,5-8,0)</td><td>10 mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 Media (pH 7,2)</td><td>5 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,17 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM MgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do iniekcji (pH 7,5)</td><td>20 mM HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

precyzyjne edycje knock-in za pośrednictwem crispr-cas9 w sercach danio pręgowanego

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) w modelach zwierzęcych umożliwiają precyzyjną manipulację genetyczną w celu badania zjawisk fizjologicznych. Danio pręgowany został wykorzystany jako skuteczny model genetyczny do badania wielu kwestii związanych z chorobami dziedzicznymi, rozwojem i toksykologią na poziomie całego narządu i organizmu. Dzięki dobrze opisanemu i zmapowanemu genomowi danio pręgowanego opracowano liczne narzędzia do edycji genów. Jednak skuteczność generowania i łatwość wykrywania precyzyjnych edycji knock-in za pomocą CRISPR jest czynnikiem ograniczającym. Opisano tutaj podejście knock-in oparte na CRISPR-Cas9 z prostym wykrywaniem precyzyjnych zmian w genie odpowiedzialnym za repolaryzację serca i związanym z zaburzeniem elektrycznym, zespołem długiego odstępu QT (LQTS). To podejście oparte na dwuprzewodnikowym RNA (sgRNA) wycina i zastępuje sekwencję docelową oraz łączy genetycznie kodowany gen reporterowy. Użyteczność tego podejścia wykazano poprzez opisanie nieinwazyjnych pomiarów fenotypowych funkcji elektrycznych serca u larw danio pręgowanego typu dzikiego i z edytowanymi genami. Takie podejście umożliwia efektywne badanie wariantów związanych z chorobą w całym organizmie. Co więcej, strategia ta oferuje możliwości wprowadzania wybranych sekwencji egzogennych, takich jak geny reporterowe, ortologi lub edytory genów.

Skuteczność zastosowania tej metody CRISPR do wymiany eksonu z użyciem dwóch sgRNA została potwierdzona poprzez wprowadzenie i prostą detekcję precyzyjnej edycji w celu stworzenia wariantu R56Q związanego z LQTS w genie zkcnh6a u rybek zebrafish. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywną larwę w 3 dpf, która na etapie jednej komórki embrionu została wstrzyknięta komponentami CRISPR zgodnie z powyższym opisem. Rysunek 6A pokazuje ekspresję genu reporterowego...

Ten protokół opisuje podejście ułatwiające precyzyjną edycję w zarodkach danio pręgowanego przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Przedstawiono proces fenotypowania, aby zademonstrować możliwość zastosowania tych technik do modelowania wariantu genu związanego z zespołem wydłużonego odstępu QT.

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

Nasz protokół zapewnia potok zarówno do precyzyjnej integracji, jak i prostego wizualnego wykrywania edycji CRISPR, a także przykład fenotypowania po edycji. Główną zaletą tego podejścia jest łatwość wykrywania edycji CRISPR, pozwalająca na sprawną i uproszczoną identyfikację udanych edycji. Takie podejście pozwala na proste generowanie i charakteryzowanie wariantów związanych z chorobą u danio pręgowanego.Tutaj badamy zespół wydłużonego odstępu QT. Możliwe jest wówczas przeprowadzenie dalszych badań nad terapiami farmaceutycznymi. Zacznij od zaprojektowania dwóch przewodników sgRNA, aby wyciąć sekwencję miejsca docelowego knock-in, identyfikując ortolog danio pręgowanego dla interesującego genu.Użyj Ensembl, aby zlokalizować miejsce docelowe w sekwencji genu będącej przedmiotem zainteresowania, w tym sekwencję flankującą dwie kilozasady użyte do wykonania matrycy. Użyj narzędzia do projektowania, takiego jak CRISPOR i wybierz gatunki Danio rerio i enzym Cas. W przypadku podejścia opartego na dwóch sgRNA należy wybrać jeden sgRNA przed docelowym eksonem i drugi sgRNA w bezpośrednim dopływie do celu.Upewnij się, że wybrane sgRNA mają wysoką swoistość i niskie przewidywane wiązanie poza celem. Użyj rankingów CRISPOR, aby zidentyfikować prowadnice z minimalnym wiązaniem niedocelowym. Teraz zidentyfikuj najbardziej prawdopodobne potencjalne miejsca niedocelowe dla genotypowania sekwencjonowania Sangera opartego na PCR.Po wybraniu dwóch sgRNA uzyskaj odwrotny dopełniacz dla każdego z nich, dwóch komplementarnych oligonukleotydów, które poprzedzają mutację i dwóch komplementarnych oligonukleotydów znajdujących się poniżej mutacji. Dodaj kompatybilne miejsca restrykcyjne na każdym oligo, aby włączyć przewodnik do wybranego plazmidu. W celu zintegrowania wybranych sekwencji prowadzących z plazmidem DR274, należy utworzyć zwis za pomocą pięciu głównych miejsc restrykcyjnych BSA1 i zaprojektować miejsca rozpoznawania BSA1 na pięciu głównych końcach prowadnic.Następnie zaprojektuj egzogenny szablon HDR u danio pręgowanego, wybierając dwa fragmenty sekwencji, które będą flankować żylny gen reporterowy M YFP umieszczony w plazmidzie PKHR5. Podziel matrycę na dwa segmenty, aby wprowadzić ją po obu stronach żylnego genu reporterowego M YFP. Upewnij się, że podzielone miejsce znajduje się w intronie, aby uniknąć przecięcia sekwencji kodowania.Uwzględnij wszystkie wymagane modyfikacje wymienione w manuskrypcie, aby ułatwić klonowanie do plazmidu PKHR5. Wstrzyknąć zarodki w stadium jednokomórkowym po około 40 minutach od zapłodnienia. Po trzech dniach zapłodnienia znieczulij larwy danio pręgowanego, przenosząc je na 25-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 0,3% MS222, aż stracą odruch samoprostowania.Po znieczuleniu przenieś larwę do studzienki 24-dołkowej płytki. Za pomocą mikroskopu zdolnego do wykrywania GFP lub YFP należy przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem fluorescencji genu reporterowego w oczach larwy. Po zrobieniu zdjęć larwy należy udokumentować obecność lub brak ekspresji genu reporterowego.Aby potwierdzić dokładną i precyzyjną edycję genu HDR, należy przeprowadzić genotypowanie, najpierw znieczulając larwę trzy dni po zapłodnieniu, jak wykazano wcześniej, i izolując genomowe DNA z klipsa ogonowego przy użyciu metody hotshot. Dodaj wycięty klips ogonowy do 15 mikrolitrów 25-milimolowego wodorotlenku sodu i inkubuj go w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 20 minut, a następnie zneutralizuj 1,5 mikrolitra kwasu solnego tris. Wirować przy 13 800 razy G przez 30 sekund i zachować supernatant zawierający wyekstrahowane genomowe DNA.Odzyskać larwę na pożywce E3 i zwrócić ją do systemu pomieszczeń, jeśli planowane są dalsze badania. Używając wyekstrahowanego genomowego DNA jako matrycy, wykonaj sekwencjonowanie Sangera oparte na PCR miejsc docelowych i potencjalnych poza celem. Upewnij się, że projekt startera na miejscu wychwytuje miejsce mutacji i najbliższe miejsce wiązania sgRNA.Zaprojektuj oddzielny starter sekwencjonowania, aby wykryć przejście od wstawionego ramienia homologii i genu docelowego, aby potwierdzić integrację z genem będącym przedmiotem zainteresowania. Zaprojektuj startery, aby zsekwencjonować trzy pierwsze potencjalne miejsca niedocelowe. Skompiluj genotypowanie na i poza celem, częstość akcji serca, wymiary osierdzia, fenotypowanie EKG i dane genów reporterowych identyfikowalne dla każdego danio pręgowanego.Na wyspach zaobserwowano ekspresję genu żylnego reporterowego YFP M, działającego jako pozytywny reporter udanej integracji matrycy. Stwierdzono, że ryby z dodatnim genem reporterowym mają precyzyjną edycję G2A, która wprowadza wariant R56Q do ZKCNH6A. Pomiar wymiarów osierdzia jako stosunku powierzchni oka pokazano tutaj.U larw z edytowanym genem R56Q zaobserwowano tendencję bradykardii z narastającym obrzękiem osierdzia związanym z zaburzeniami repolaryzacji serca u danio pręgowanego. Zapis EKG z serca larwy danio pręgowanego trzy dni po zapłodnieniu pokazano tutaj. Najważniejszym aspektem tego podejścia jest projektowanie przewodników, jak to często ma miejsce w procedurach CRISPR.Skuteczne przewodniki są niezbędne do udanej edycji CRISPR. Można zastosować alternatywne metody CRISPR, które pozwalają na większą precyzję lub inne funkcje. Dodatkowo można wprowadzić duże geny, takie jak główny kompleks edycyjny zapewniający indukowany system edycji in vivo.

crispr-cas9-mediated-precise-knock-in-edits-in-zebrafish-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół mikroiniekcji do edycji genów w zarodkach sumów kanałowych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. W tym protokole przewodnikowe RNA i białko Cas9 zostały mikrowstrzyknięte do żółtka jednokomórkowych zarodków. Protokół ten został zweryfikowany poprzez wyeliminowanie dwóch genów związanych z odpornością suma kanałowego.

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Wczesny rozwój zależy od produktów dziedziczonych po matce, a rola wielu z tych produktów jest obecnie nieznana. W tym miejscu opisaliśmy protokół, który wykorzystuje CRISPR-Cas9 do identyfikacji fenotypów efektu matczynego w jednym pokoleniu.

Określanie roli genów ulegających ekspresji matki we wczesnym rozwoju za pomocą matczynych chrupek

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj precyzyjną edycję knock-in CRISPR-Cas9 w sercach Danio rerio z wykorzystaniem reportera fluorescencyjnego YFP. Metoda umożliwia modelowanie wariantów genetycznych związanych z zespołem długiego QT i badanie fenotypów kardiologicznych.

Precyzyjne edycje Knock-In za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w sercach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów