Oddzielenie subpopulacji komórek odpornościowych w próbkach krwi obwodowej od dzieci z mononukleozą zakaźną

Metoda ta umożliwi scharakteryzowanie różnych komórek odpornościowych w tych samych stanach chorobowych osób z IM, co poszerzy naszą wiedzę na temat mechanizmu zakażenia EBV. Zabieg zademonstruje Linlin Zhang, lekarz z naszego laboratorium. Na początek weź PBMC wyizolowane wcześniej w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki i wiruj ją w temperaturze 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 80 mikrolitrach przygotowanego buforu. Następnie dodać 20 mikrolitrów mikrogranulek CD 14 do zawiesiny komórek, dobrze wymieszać pipetując i inkubować probówkę przez 15 minut na lodzie. Następnie umyć PBMC za pomocą jednego mililitra buforu i odwirować przy 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Odrzucić cały supernatant i ponownie zawiesić komórki z 500 mikrolitrami buforu. W celu separacji magnetycznej umieść kolumnę na magnetycznym separatorze kulkowym i zalej kolumnę, przemywając ją trzema mililitrami buforu. Następnie dodaj zawieszenie komórki do kolumny.

Pozwól mu przejść i zbierz nieoznakowane komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Przemyć kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami buforu i zebrać cały ściek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Teraz umieść kolumnę w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i dodaj pięć mililitrów buforu do kolumny.

Mocno wciśnij tłok do kolumny, aby przepłukać magnetycznie oznaczone ogniwa do probówki. Odwirować magnetycznie znakowane komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach PBS i przenieść zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej w celu późniejszego sekwencjonowania transkryptomu.

Zebrane nieoznakowane komórki osadzać przez odwirowywanie przy 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach PBS w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Następnie dodaj dwa mikrolitry każdego znakowanego przeciwciała do zawiesiny komórkowej i inkubuj na lodzie przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Następnie podwielokrotność 100 mikrolitrów zawiesiny komórek PBMC w 1,5 mililitrowych probówkach do mikrowirówek, aby ustawić próbkę kontroli ujemnej CD 3, CD 4, CD 8 i CD 19, pojedyncze próbki do barwienia oraz próbkę do barwienia CD 56 lub CD 16.

Następnie dodać dwa mikrolitry odpowiedniego przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie do każdej probówki i inkubować na lodzie przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Po inkubacji przemyć wszystkie komórki PBS, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesić w 500 mikrolitrach PBS. Otwórz system sortowania komórek i uruchom program włączania.

Następnie zainstaluj dyszę o średnicy 85 mikrometrów i otwórz strumień sortowania. Ustaw napięcie sortowania na 4 500 woltów, a częstotliwość na 47. Ustaw odstęp na 8 w oknie odłamywania i włącz tryb automatycznego sortowania sweet spot, aby automatycznie określić wartość amplitudy kropli.

Na koniec dostosuj opóźnienie kropli do 30,31 w bocznym oknie strumienia. Korzystając z wykresu punktowego rozproszenia do przodu i z boku, narysuj bramkę wielokątną P1, aby zidentyfikować nienaruszoną populację limfocytów. Następnie, używając wykresu punktowego obszaru rozproszenia do przodu w funkcji wysokości, narysuj bramkę wielokątną P2, aby zidentyfikować pojedyncze komórki i wykluczyć dublety.

Następnie, używając obszaru FITC CD 19 w porównaniu z wykresem kropkowym CD 3 na CPCY 5.5, narysuj prostokątną bramkę P3, aby wybrać limfocyty T CD 3 dodatnie i dodatnie limfocyty B CD 19. Następnie, używając wykresu punktowego obszaru CD 4 APCCY 7 w porównaniu z obszarem PE CD 8, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać dodatnie limfocyty T CD 4 i CD 8. Na koniec, używając bocznego obszaru rozproszenia w porównaniu z wykresem punktowym obszaru APC CD 56 lub CD 16, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać dodatnie komórki NK CD 56 lub CD 16.

W przypadku probówki kontroli ujemnej kliknij przycisk załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji i wybierz ustawienia cytometru w oprogramowaniu. W oknie inspektora kliknij kartę parametrów i dostosuj napięcia rozproszenia do przodu, rozproszenia bocznego i różnych barwników fluorescencyjnych. Po załadowaniu pojedynczych barwionych probówek do cytometru kliknij przycisk załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji, a następnie kliknij kartę kompensacji, aby dostosować kompensację, zgodnie z opisem w tekście.

Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek przed załadowaniem probówki do cytometru. Dodaj 200 mikrolitrów FBS do czterech probówek przepływowych do zbierania i wymieszaj probówki. Umieść je w komorze zbiorczej cytometru.

Zbierz różne typy komórek oddzielnie w czterech rurkach przepływowych. Odwiruj oddzielone komórki pod ciśnieniem 300 G przez pięć minut i dodaj 200 mikrolitrów odczynnika do izolacji RNA do palety komórek w celu sekwencjonowania transkryptomu. W niniejszym badaniu subpopulacje komórek odpornościowych z krwi obwodowej różnych próbek zostały skutecznie posortowane poprzez połączenie technik kulek immunomagnetycznych i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Co ważne w tym protokole, etap sortowania komórek został zoptymalizowany w celu poprawy żywotności komórek. Posortowane komórki odpornościowe wykazały zwiększony odsetek limfocytów T CD 3, CD 8 dodatnich u pacjentów z mononukleozą zakaźną w porównaniu zarówno ze zdrowymi nosicielami wirusa Epsteina-Barr, jak i próbkami niezakażonymi. Natomiast u pacjentów z mononukleozą zakaźną zaobserwowano zmniejszenie odsetka limfocytów T CD 3, CD 4 dodatnich i limfocytów B CD 19 dodatnich w porównaniu ze zdrowymi nosicielami EBV i dziećmi niezakażonymi EBV.

Ponadto u pacjentów z mononukleozą zakaźną zaobserwowano zmniejszenie odsetka komórek NK CD 56 lub CD 16-dodatnich w porównaniu z dziećmi niezakażonymi EBV. Utrzymanie żywotności komórek ma kluczowe znaczenie dla późniejszego eksperymentu. Trzymanie komórek na lodzie lub w lodówce podczas procesu sortowania jest korzystne dla żywotności komórek.