Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Zastosowanie Lucifer Yellow do pożywki enteroidów wierzchołkowych zapewnia prostą metodę analizy ilościowej i jakościowej wszystkich trzech głównych parakomórkowych szlaków przepuszczalności jelit w modelu 3D. Jest to stosunkowo prosta technika, która pozwala nam ocenić przepuszczalność za pomocą modelu enteroidalnego. Pracujemy z tą techniką w naszych badaniach nad martwiczym zapaleniem jelit.

Jednak ta technika może być przydatna w badaniu każdej choroby jelit u ludzi, wykorzystując model enteroidalny. Dzisiejsze procedury zademonstrują nasi doktoranci, dr Tyler Leiva i dr Alena Golubkova, a także Camille Schlegel, asystent kierownika badań z naszego laboratorium. Aby rozpocząć, hoduj Androidy osadzone w BMM przez siedem do 10 dni za pomocą 50% pożywki kondycjonowanej LWRN dla generacji enteroidów wierzchołkowych lub AO.

Usuń pożywkę z okolic kopuł BMM i dodaj 500 mikrolitrów roztworu do odzyskiwania komórek lub CRS do jednej studzienki. Zeskrob kopułę, odpipetuj ją kilka razy w górę i w dół, aby homogenizować CRS z enteroidami osadzonymi w kopułach BMM i dodaj ten roztwór do następnego dołka. Ponownie zeskrob kopułę i odpipetuj ją kilka razy w górę iw dół przed przeniesieniem roztworu do probówki mikrowirówkowej.

Dodaj 500 mikrolitrów CRS do drugiego dołka, pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać i przenieś do pierwszego dołka. Z pierwszego dołka połącz roztwór enteroidu BMM CRS w tej samej 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej i powtórz to łączenie dla pozostałych studzienek, aż zawartość wszystkich studzienek znajdzie się w CRS. Umieścić probówki do mikrowirówek zawierające zbiorczy roztwór CRS na rotatorze na jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie odwirować probówkę mikrowirówkową o sile 200 X g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed usunięciem supernatantu i ponownym zawieszeniem osadu enteroidalnego w jednym mililitrze 50% pożywki kondycjonowanej LWRN. Delikatnie przenieś 500 mikrolitrów ponownie zawieszonego roztworu enteroidu lub pożywki do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej o bardzo niskim mocowaniu. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez trzy dni przed eksperymentem.

Upewnij się, że enteroidy AO są zawieszone na co najmniej 72 godziny przed użyciem. Delikatnie przenieść wszystkie enteroidy zawieszone w pożywce z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej. Wirować przy 300 X g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.

Dodaj 10 mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr lipopolisacharydu lub LPS do 500 mikrolitrów 50% pożywki kondycjonowanej LWRN na studzienkę, aby przygotować mieszankę główną, i ponownie zawiesić osad enteroidowy AO z grupy poddawanej działaniu substancji do 500 mikrolitrów pożywki kondycjonowanej LPS plus 50% LWRN. Pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Porcję 500 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu.

Podobnie ponownie zawiesić enteroidy AO z nieleczonej grupy kontrolnej w 500 mikrolitrach 50% pożywki kondycjonowanej LWRN na studzienkę i podwielokrotnie 500 mikrolitrów tej zawiesiny do każdej studzienki oddzielnej 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Wywołaj niedotlenienie w enteroidach AO traktowanych LPS za pomocą modułowej komory inkubatora z 1% tlenem, 5% dwutlenkiem węgla i 94% azotem i inkubuj enteroidy z hipoksją i LPS przez 24 godziny. Umieść kultury niepoddane działaniu substancji i LPS plus hipoksja w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla na 24 godziny.

Aby zmierzyć przepuszczalność parakomórkową za pomocą Lucifer Yellow lub LY, delikatnie przenieś zawiesinę enteroidu lub pożywki z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej. Ciepłe roztwory soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco lub DPBS i kondycjonowane w 50% LWRN w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 X g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Usunąć pożywkę i przemyć osad enteroidalny 500 mikrolitrami ciepłego DPBS przed odwirowaniem przy 300 X g przez trzy minuty. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i powtórzyć etap płukania DPBS jeszcze raz. Po umyciu DPBS dodaj 450 mikrolitrów ciepłej pożywki kondycjonowanej 50% LWRN i dodaj zawiesinę do płytki 24-dołkowej.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów po 2,5 miligrama na mililitr LY do każdej studzienki. Delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać, i umieść ją w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla na dwie godziny. Delikatnie odpipetować zawiesinę enteroidalną z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej.

Odwirować go i usunąć supernatant, pozostawiając osad enteroidalny. Umyj granulat za pomocą 500 mikrolitrów ciepłego DPBS i odwiruj go. Usunąć supernatant, pozostawiając osad.

Powtórzyć trzy płukania DPBS przed ponownym zawiesieniem osadu z 1000 mikrolitrów zimnego DPBS i oddzielić enteroidy przez energiczne mieszanie za pomocą pipety. Dla krzywej wzorcowej Lucyfera Żółtego należy przygotować wzorce rozcieńczone w DPBS zgodnie z opisem w tekście. Odpipetować 150 mikrolitrów każdej próbki na studzienkę w trzech kroplach na 96-dołkowej płytce.

Zmierz fluorescencję przy piku wzbudzenia 428 nanometrach i piku emisji 536 nanometrów na czytniku płytek fluorescencyjnych. Obliczyć stężenia za pomocą oprogramowania statystycznego i krzywej czteroparametrowej interpolującej krzywą wzorcową. Barwienie immunofluorescencyjne enteroidów zawieszonych w 50% pożywce LWRN przez 72 godziny wykazało Zo-1 na zewnętrznej powierzchni wierzchołkowej enteroidu, podczas gdy beta katenina jest widoczna na powierzchni podstawno-bocznej.

Wskazało to na oczekiwane odwrócenie polaryzacji enteroidów, potwierdzając konformację AO enteroidów. Enteroidy podstawno-boczne lub BO leczone LPS i niedotlenieniem wykazały znacznie zwiększoną przepuszczalność, co wykazano w teście Lucifer Yellow lub LY przez zwiększony wychwyt barwnika LY do światła enteroidu, w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Test Lucyfer Yellow wykazał również zwiększony wychwyt LY w świetle leczonych enteroidów AO w porównaniu z nieleczonymi kontrolami.

Potwierdziło to zwiększoną przepuszczalność enteroidów AO leczonych LPS i niedotlenieniem w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Ważne jest, aby dokładnie umyć granulki enteroidów, aby upewnić się, że cały pozaświetlny LY został usunięty. Pozwala to na dokładne ilościowe określenie pozostałego LY w obrębie światła przy obliczaniu przepuszczalności.

W celu analizy jakościowej enteroidy można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wychwytu LY do światła. Po inkubacji LY i kolejnych etapach płukania przed dysocjacją od odczytu mikropłytki.