Name: Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę oceny przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym. Technika ta umożliwia badanie chorób jelitowych, w tym martwiczego zapalenia jelit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Ashley Nelson z University of Rochester Medical Center za jej pomocną pomoc w pracy z naszym modelem enteroidu. Chcielibyśmy również podziękować Oddziałowi Chirurgii Dziecięcej Uniwersytetu w Oklahomie za wsparcie tego projektu. Praca ta była wspierana przez National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research oraz Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 przyznany Wydziałowi Chirurgii w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Oklahomy.

Obecne badania zostały przeprowadzone zgodnie z aprobatą Institutional Review Board (IRB, #11610, 11611) na Uniwersytecie Oklahoma. Przed pobraniem ludzkich próbek chirurgicznych wymagana była zgoda rodziców zgodnie ze specyfikacją IRB. Po zatwierdzeniu przez IRB i uzyskaniu zgody rodziców, ludzką tkankę jelita cienkiego pobrano od niemowląt (skorygowany wiek ciążowy (GA) w zakresie 36-41 tygodni w momencie pobierania próbki, wszystkie z historią przedwczesnego porodu w szacowanym GA 25-34 tygodni, 2:1 M:F) poddanych operacji NEC lub innej resekcji jelita, takiej jak usunięcie stomii lub naprawa atrezji. Enteroidy zostały wygenerowane z tkanki uzyskanej z jelita czczego lub jelita krętego.
1. Hodowle enteroidów pochodzące od niemowląt ludzkich: izolacja krypty i posiew z całej tkanki
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną, bufor chelatujący #1 i bufor chelatujący #2 (Tabela 1) zgodnie z poprzednim raportem4. chelatujące przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 48 godzin.</li>
	<li>Przygotować pożywkę dla ludzkiego minijelita (Tabela 1). Przed użyciem przechowywać bulion w temperaturze -20 °C i ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować 50% pożywki kondycjonowane L-WRN (CM) (Tabela 1). Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia. 
	UWAGA: 100% baza L-WRN dla kondycjonowanych pożywek jest opisana w protokole Miyoshi et al.12.</li>
	<li>Wygeneruj enteroidy z próbek tkanki jelita cienkiego uzyskanych z próbek chirurgicznych zgodnie z poprzednim raportem4. Umieść cztery dołki enteroidów w 24-dołkowej płytce z kawałka tkanki jelitowej o masie 0,75-2,5 g. 
	UWAGA: Enteroidy można z powodzeniem wytworzyć z tkanki przechowywanej w 30 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C przez okres do 48 godzin.</li>
	<li>Umieść 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do góry nogami na 15-20 minut, aby umożliwić polimeryzację kopuł BMM4.</li>
	<li>Dodaj 500 μl 50% L-WRN CM (zgodnie z opisem w kroku 1.3) z 0,5 μl Y-27632, inhibitora ROCK (RI, patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Po 2-3 dniach wymień na 50% L-WRN CM bez RI.</li>
</ol>
2. Generowanie enteroidów AO
<ol>
	<li>Hoduj enteroidy osadzone w BMM przez 7-10 dni z 50% L-WRN CM4.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i dodać 500 μl roztworu do odzyskiwania komórek (CRS, patrz tabela materiałów) do jednego dołka. Zeskrob kopułę, kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, a następnie dodaj roztwór CRS/enteroid/BMM do następnego dołka.</li>
	<li>Zeskrob kopułę, kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół i umieść roztwór w probówce do mikrowirówki. Dodaj 500 μl CRS do drugiego dołka, pipetuj w górę i w dół, a następnie dodaj do pierwszego dołka. Przenieść ten roztwór do tej samej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Powtórz krok 2.3, łącząc dwie studzienki w jednej probówce do mikrowirówki, aż cała zawartość studzienki znajdzie się w CRS. 
	UWAGA: Więcej niż dwie studzienki można połączyć w jedną większą stożkową probówkę o pojemności 15 ml, jeśli generują duże objętości enteroidów AO. Utrzymanie proporcji 500 μl CRS na studzienkę jest ważne, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność BMM.</li>
	<li>Umieścić probówki do mikrowirówek (krok 2.3) z zbiorczym roztworem CRS/enteroid/BMM na rotatorze na 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu rozpuszczenia BMM.</li>
	<li>Odwirować roztwór o sile 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4°C, następnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety, pozostawiając osad.</li>
	<li>Zawiesić osad enteroidalny w 1 ml 50% L-WRN CM (przygotowanym w kroku 1.3) w probówce mikrowirówki. Delikatnie odpipetować 500 μl ponownie zawieszonego roztworu enteroidu/pożywki do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej o bardzo niskim nasadce (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 dni przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
</ol>
3. Weryfikacja konformacji enteroidu AO za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego metodą całej góry
<ol>
	<li>Po inkubacji enteroidów w zawiesinie pożywki przez 3 dni, odpipetować zawiesinę enteroidu/pożywki z jednego dołka do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę enteroidu/pożywki o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Zawiesić enteroidy w 20 μl BMM. Pobrać pipetę 10 μl zawiesiny enteroidalnej na szkiełko mikroskopowe i rozprowadzić cienką warstwą o wymiarach około 1 cm na 1 cm kwadratowych. Powtórzyć czynność z pozostałymi 10 μl zawiesiny enteroidalnej na oddzielnej części tego samego szkiełka, tak aby pozostały dwa rozmazy zawiesiny enteroid/BMM.</li>
	<li>Pozostawić rozmazy enteroidu/BMM do zestalenia się w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 minut.</li>
	<li>Pracując w dygestorium, umieść szkiełko w słoiku do barwienia i napełnij 4% paraformaldehydem, aż pokryje rozmaz enteroidu/BMM (~ 30 ml na jedno szkiełko w przypadku użycia szklanego słoika do barwienia o pojemności 10 szkiełek). Odczekać 30 minut (w temperaturze pokojowej) na utrwalenie. 
	UWAGA: 4% paraformaldehydu jest niebezpieczny i może powodować uszkodzenie/podrażnienie oczu, podrażnienie skóry i raka. Podczas korzystania z niego zawsze pracuj pod wyciągiem. Podczas obchodzenia się z nim należy nosić rękawice ochronne i środki ochrony osobistej. Wyrzuć go do zatwierdzonego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Wyrzuć 4% paraformaldehydu do odpowiedniego pojemnika na odpady. Dodać 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do słoika do barwienia lub do momentu, gdy PBS pokryje rozmazy enteroidowe/BMM. Pozostaw na 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzuć PBS do butelki na odpady paraformaldehydu. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.</li>
	<li>Napełnij nowy słoik do barwienia 30 ml 0,5% Triton X-100 rozcieńczony w PBS. Umieścić szkiełko z rozmazami enteroidalnymi/BMM w roztworze Triton i pozostawić do przepuszczalności przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzuć 0,5% Triton X-100 rozcieńczony w PBS. Dodaj 30 ml PBS do słoika do barwienia i pozostaw na 3 minuty. Usunąć PBS przez dekantację.</li>
	<li>Delikatnie przetrzyj szkiełko wokół rozmazów enteroidowych/BMM, uważając, aby ich nie naruszyć. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego (barierowego pisaka PAP, patrz Tabela materiałów), narysuj okrąg wokół każdego z rozmazów enteroidu/BMM. Przygotować 20% surowicę, specyficzną dla zwierzęcia, u którego wyhodowano przeciwciało drugorzędowe (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Połóż szkiełko mikroskopowe płasko na stole laboratoryjnym. Zatkać szkiełko na 1 godzinę w temperaturze 4 °C, odpipetowując 100 μl specyficznej 20% surowicy z kroku 3.9 na każdy z rozmazów enteroidalnych/BMM otoczonych przez hydrofobowy pisak barierowy.</li>
	<li>Przygotować 100 μl roztwór z rozcieńczeniami 1:100 i 1:200 odpowiednio pierwszorzędowych przeciwciał β-kateniny i ZO-1, rozcieńczonych w PBS. 
	UWAGA: Każde przeciwciało pierwszorzędowe musi pochodzić od innego zwierzęcia, aby zapewnić, że będą miały odrębne kanały immunofluorescencyjne podczas obrazowania. W niniejszym badaniu wykorzystano mysie przeciwciało β-kateninowe i królicze przeciwciało ZO-1 (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Postukaj w szkiełko na blacie, aby usunąć 20% serum i delikatnie wytrzyj do sucha, uważając, aby nie zakłócić rozmazów enteroidowych/BMM. Odpipetować 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego β-kateniny/ZO-1 na jeden z rozmazów enteroidowych/BMM. Odpipetować 100 μl PBS bez przeciwciała pierwszorzędowego na drugi rozmaz z enteroidu/BMM jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Wyłóż dno plastikowego pojemnika mokrym ręcznikiem papierowym, aby stworzyć nawilżony pojemnik. Umieścić szkiełko w pojemniku, uważając, aby nie naruszyć roztworów pokrywających rozmazy z enteroidu/BMM. Umieść pokrywkę na pojemniku, aby go uszczelnić, i przechowuj na płasko w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka. Upewnij się, że pojemnik jest zamknięty, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, dotknij szkiełka na liczniku, aby usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i PBS z rozmazów enteroidowych/BMM.</li>
	<li>Wykonaj etap mycia, umieszczając szkiełko w słoiku do barwienia i napełniając 30 ml PBS lub do momentu, gdy PBS pokryje rozmazy enteroidowe/BMM. Pozostaw na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Wyrzuć PBS i powtórz ten krok jeszcze dwa razy, w sumie trzy prania.</li>
	<li>Przygotować 200 μl przeciwciał drugorzędowych dla dwóch różnych kanałów immunofluorescencyjnych, przy czym każde przeciwciało ma rozcieńczenie 1:1000 w PBS (patrz tabela materiałów). Trzymaj roztwór z dala od światła.</li>
	<li>Pobrać pipetą 100 μl roztworu przeciwciał wtórnych na każdy z rozmazów enteroidowych/BMM. Umieść go w ciemności i pozostaw na 1 godzinę w temperaturze RT.</li>
	<li>Dotknij suwaka na liczniku, aby usunąć przeciwciała wtórne. Powtórz kroki prania opisane w kroku 3.15, upewniając się, że wszystkie prania są wykonywane w ciemności.</li>
	<li>Dodać kroplę podłoża mocującego 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (Fluoroshield z DAPI, patrz Tabela Materiałów) do każdego z rozmazów enteroidowych/BMM i nałożyć szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że oba rozmazy są odpowiednio pokryte. Unikaj uwięzienia pęcherzyków pod szkiełkiem nakrywkowym. Trzymaj szkiełko w ciemności, aż będzie gotowe do oglądania pod mikroskopem. 
	UWAGA: Natychmiastowe obrazowanie preparatów daje najbardziej optymalne wyniki; jednak szkiełka można przechowywać płasko w nawilżonym pojemniku w temperaturze 4 °C i obrazować przez okres do 1 tygodnia po dodaniu DAPI.</li>
</ol>
4. Indukcja eksperymentalnego NEC
<ol>
	<li>Upewnij się, że enteroidy AO znajdowały się w zawiesinie przez co najmniej 72 godziny przed użyciem.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować całą zawiesinę enteroidu/pożywki z każdej studzienki do probówki do mikrowirówki. 
	UWAGA: Wiele studzienek można połączyć w jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml, jeśli uzdatniana jest duża objętość studzienek. W przypadku tego protokołu zaleca się co najmniej trzy studzienki na grupę badaną.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 10 μl 5 mg/ml lipopolisacharydu (LPS, patrz tabela materiałów) do 500 μl 50% LWRN CM na studzienkę (końcowe stężenie 100 μg/ml LPS).</li>
	<li>Zawiesić enteroidy AO oznaczone jako grupa badana w 50% LWRN + LPS i podwielokrotności 500 μl zawiesiny na 24-dołkowej płytce o bardzo niskim stopniu mocowania. Zawiesić enteroidy AO oznaczone jako nieleczone kontrole w 500 μl 50% LWRN CM na studzienkę. Porcję 500 μl tej zawiesiny do oddzielnej 24-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim poziomie.</li>
	<li>Wywołać niedotlenienie w enteroidach AO traktowanych LPS za pomocą modułowej komory inkubatora (MIC) z 1% O2 , 5% CO2 i 94% N2 zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Leczyć enteroidy z hipoksją i LPS przez 24 godziny.</li>
	<li>Umieścić kultury niepoddane działaniu substancji i kultury poddane działaniu LPS + hipoksji, nadal w komorze MIC, w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 2 na 24 godziny.</li>
</ol>
5. Pomiar przepuszczalności parakomórkowej za pomocą LY
<ol>
	<li>Delikatnie odpipetować zawiesinę enteroidu/pożywki z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej. Ciepły DPBS i 50% LRWN CM w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę enteroid/pożywkę o sile 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjmij nośnik. Umyj enteroidy ciepłym 500 μl DPBS.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.3-5.4 jeszcze raz, w sumie dwa razy.</li>
	<li>Po umyciu dodaj 450 μl ciepłego 50% LWRN CM (przygotowanego w kroku 1.3).</li>
	<li>Dodaj 50 μl 2,5 mg/ml LY (końcowe stężenie wynosi 0,25 μg/μl, patrz tabela materiałów) do każdego dołka i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 2 godziny.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować zawiesinę enteroidu/pożywki z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, następnie usunąć supernatant, pozostawiając osad enteroidalny.</li>
	<li>Przemyć enteroidy 500 μl ciepłym DPBS.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant, pozostawiając osad enteroidalny.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.10-5.11 jeszcze trzy razy, co daje w sumie cztery prania.</li>
	<li>Ponownie zawiesić każdą granulkę w 1 000 μl zimnego DPBS i energicznie pipetować w górę iw dół, aby oddzielić enteroidy.</li>
	<li>Przygotować wzorce dla krzywej wzorcowej LY rozcieńczonej w DPBS (100 ng/ml; 50 ng/mL; 25 ng/mL; 12,5 ng/mL; 6,25 ng/mL; 3,13 ng/mL; 1,57 ng/mL; 0 ng/mL).</li>
	<li>Odpipetować 150 μl każdej próbki na basenik w trzech powtórzeniach na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję przy piku wzbudzenia 428 nm i piku emisji 536 nm na czytniku płytkowym zdolnym do odczytu fluorescencji (patrz tabela materiałów). Korzystając z oprogramowania statystycznego (patrz tabela materiałów), oblicz stężenia, interpolując krzywą wzorcową i używając krzywej czteroparametrowej.</li>
</ol>

<ol><li>Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+in+a+time+of+enteroids+and+organoids%3A+How+the+human+gut+model+has+transformed+the+study+of+enteric+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens.</a> Gut Microbes. 12 (1), 1795492(2020).</li>
<li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%3A+Overview+on+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).</li>
<li>Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-based+modeling+approaches+for+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis.</a> Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).</li>
<li>Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+epithelial+enteroid+model+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59194(2019).</li>
<li>Co, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+epithelial+polarity%3A+A+human+enteroid+model+for+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions.</a> Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).</li>
<li>Buonpane, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK1+inhibitor+stabilizes+E-cadherin+and+improves+barrier+function+in+experimental+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis.</a> The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).</li>
<li>Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+epithelial+barrier+permeability+in+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56960(2017).</li>
<li>Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+heat+stress+affect+epithelial+integrity+in+a+Caco-2%2FHT-29+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture.</a> Scientific Reports. 11, 13186(2021).</li>
<li>Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lucifer+yellow+-+A+robust+paracellular+permeability+marker+in+a+cell+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lucifer yellow - A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e58900(2019).</li>
<li>Manabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorpheniramine+increases+paracellular+permeability+to+marker+fluorescein+lucifer+yellow+mediated+by+internalization+of+occludin+in+murine+colonic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).</li>
<li>Bardenbacher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+analyses+and+three+dimensional+imaging+of+interferon+gamma-induced+barrier+disintegration+in+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 35, 101383(2019).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Buonpane, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+modeling+of+necrotizing+enterocolitis+in+human+infant+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Surgery%22%5BJournal%5D)">Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids.</a> Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).</li>
<li>Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -T., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+between+tight+junction-dependent+and+tight+junction-independent+intestinal+barrier+loss+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+A+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo.</a> Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+cell+leak+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The epithelial cell leak pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677(2021).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8, 2871(2018).</li>
<li>Stroulios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+to+study+apical-specific+interactions+using+intestinal+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models.</a> Journal of Visualized Experiments. (169), e62330(2021).</li>
<li>Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+epithelial%2Fendothelial+barriers+in+transwells+and+microfluidic+bilayer+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices.</a> Micromachines. 10 (8), 533(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych praw własności ani interesów komercyjnych w żadnym z wymienionych produktów lub koncepcji omawianych w tym artykule.

Przepuszczalność jelit jest złożona i odzwierciedla funkcję bariery nabłonkowej. Bariera jelitowa składa się z pojedynczej warstwy komórek nabłonkowych, która pośredniczy w transporcie międzykomórkowym i parakomórkowym14. Przepuszczalność parakomórkowa opiera się na białkach ścisłego połączenia, które uszczelniają przestrzeń między komórkami nabłonkowymi14. W ramach tego transportu parakomórkowego istnieją trzy odrębne szlaki, przez które cząsteczki mogą się krzyżować: pory...

Enteroidy to trójwymiarowe (3D) struktury pochodzące z ludzkich komórek macierzystych jelitowych ograniczonych do narządów1,2. Składają się one w całości z linii nabłonkowej i zawierają wszystkie zróżnicowane typy komórek nabłonka jelitowego2. Enteroidy utrzymują również polaryzację komórkową składającą się z wierzchołkowej powierzchni świetlnej tworzącej wewnętrzny przedział i powierzchni podstawno-bocznej skierowanej w stronę otaczających mediów. Enteroidy są unikalnym modelem, ponieważ zachowują cechy gospodarza, z którego zostały wygenerowane3. Tak więc enteroidy generowane przez wcześniaki stanowią model, który jest przydatny do badania chorób, które dotykają przede wszystkim tę populację, takich jak martwicze zapalenie jelit (NEC).
Tradycyjny model enteroidalny jest hodowany w konformacji podstawno-bocznej (BO), gdzie enteroid jest zamknięty w kopule macierzy błony podstawnej (BMM). BMM indukuje enteroid do utrzymania struktury 3D z powierzchnią podstawno-boczną na zewnątrz. Enteroidy BO są odpowiednim modelem dla NEC, który wypełnia lukę między dwuwymiarowymi (2D) pierwotnymi liniami komórek ludzkich a modelami zwierzęcymi in vivo2,4. NEC jest indukowany w enteroidach poprzez umieszczenie patogenów, takich jak LPS lub bakterie, w pożywkach otaczających enteroidy, a następnie narażenie na warunki niedotlenienia2,3. Wyzwanie związane z enteroidalnym modelem NEC BO polega na tym, że nie pozwala on na skuteczne badanie interakcji gospodarz-patogen, które zachodzą na powierzchni wierzchołkowej in vivo. Zmiany w przepuszczalności jelit są spowodowane tymi interakcjami gospodarz-patogen. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób przepuszczalność wpływa na patofizjologiczne podłoże choroby, należy stworzyć model, który obejmuje leczenie powierzchni wierzchołkowej.
Co i in. jako pierwsi wykazali, że dojrzałe enteroidy BO mogą być indukowane do tworzenia konformacji wierzchołkowej (AO) poprzez usunięcie kopuł BMM i ponowne ich zawieszenie w mediach5. W artykule tym wykazano, że enteroidy AO utrzymują prawidłową polaryzację nabłonka, zawierają wszystkie typy komórek jelitowych, podtrzymują barierę nabłonkową jelit i umożliwiają dostęp do powierzchni wierzchołkowej5. Wykorzystanie enteroidów AO jako modelu NEC pozwala na fizjologiczne odtworzenie procesu chorobowego i badanie interakcji gospodarz-patogen.
Jednym z głównych czynników wpływających na patofizjologię NEC jest zwiększona przepuszczalność jelit6. Zaproponowano kilka cząsteczek jako sposób badania przepuszczalności jelit in vitro7. Wśród nich żółcień lucyferowa (LY) jest barwnikiem hydrofilowym o pikach wzbudzenia i emisji odpowiednio przy 428 nm i 540 nm8. Ponieważ przechodzi przez wszystkie główne szlaki parakomórkowe, został wykorzystany do oceny przepuszczalności parakomórkowej w różnych zastosowaniach, w tym barier nabłonka krew-mózg i jelit8,9. Tradycyjne zastosowanie LY wykorzystuje komórki hodowane w monowarstwach na półprzepuszczalnej powierzchni10. LY nakłada się na powierzchnię wierzchołkową i przechodzi przez parakomórkowe białka ścisłego połączenia, aby zgromadzić się po stronie podstawno-bocznej. Wyższe stężenia LY w przedziale podstawno-bocznym wskazują na zmniejszenie białek połączeń ścisłych, a następnie na rozpad bariery komórkowej nabłonka jelitowego i zwiększoną przepuszczalność10. Zostało to również opisane w modelach enteroidalnych 3D BO, w których LY dodano do pożywki, a poszczególne enteroidy zobrazowano pod kątem wychwytu LY do klasy lumen<sup='xref'>11. Chociaż pozwala to na analizę jakościową poprzez wizualizację wychwytu LY, analiza ilościowa jest ograniczona. Protokół ten przedstawia unikalną technikę, która wykorzystuje LY do oceny przepuszczalności parakomórkowej przy użyciu modelu enteroidalnego NEC in vitro w enteroidach AO przy zachowaniu orientacji 3D. Metoda ta może być stosowana zarówno do jakościowej, jak i ilościowej analizy przepuszczalności.

<table><tbody><tr><td>[leu] 15-gastryna 1</td><td>milipor Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>100 &mikro; m sterylne sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>100% kondycjonowane LWRN</td><td>Wykonane we własnym zakresie zgodnie z Miyoshi et al.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa, przezroczysta płyta dolna</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R& D Systems</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-królik wtórny ab, 1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 koza anty-mysz wtórna ab, 1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-zonula occludens-1 królik pierwotny ab, 1:200</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>#D6L1E</td><td></td></tr><tr><td>Anty-&beta;-katenina mysz pierwotna ab, 1:100</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td># 14-2567-82</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 bez witaminy A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Barierowy długopis PAP</td><td>Laboratorium urządzeń naukowych</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>BMM (Matrigel)</td> <td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354270</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>preparacyjne</tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-190-144</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Milipor Sigma</td><td>GF144</td><td></td></tr><tr><td>Etylenodiaminotetraoctowy kwas (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>EVOS m7000 System obrazowania</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-525</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield z DAPI</td><td>Kleszcze</td><td></td> Millipore Sigma F6057-20mL <td></td></tr><tr><td></td> Gentamycyna Thermo Fisher Scientific <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>15-750-060</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Lucyfer Żółty CH, Sól Litowa</td><td>Invitrogen</td><td>L453</td><td></td></tr><tr><td>Modułowa komora inkubatora</td><td>Billups Rothenberg Inc.</td><td>MIC101</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>suplement Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy (HEPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Millipore Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td>z chłodzeniem z wahadłowym</tr> wiadrem <tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td>stołowa z chłodzeniem</tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td> Czytnik mikropłytek <td>Millipore Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Molekularny urządzenia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver Rotator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88881001</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-low attachment 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632, inhibitor ROCK (RI)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Determining Intestinal Permeability Using Lucifer Yellow in an Apical-Out Enteroid Model

Enteroidy są nowym narzędziem badawczym w badaniach nad chorobami zapalnymi jelit, takimi jak martwicze zapalenie jelit (NEC). Są tradycyjnie uprawiane w konformacji podstawno-bocznej (BO), gdzie wierzchołkowa powierzchnia komórki nabłonka jest skierowana w stronę wewnętrznego światła. W tym modelu dostęp do powierzchni świetlnej enteroidów w celu leczenia i eksperymentów jest trudny, co ogranicza możliwość badania interakcji gospodarz-patogen. Aby obejść ten problem, stworzono model neonatal apical-out (AO) martwiczego zapalenia jelit. Ponieważ zmiany przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego są patologiczne dla NEC, protokół ten określa użycie żółcieni lucyferowej (LY) jako markera przepuszczalności parakomórkowej. LY przenika przez barierę nabłonkową jelit przez wszystkie trzy główne szlaki parakomórkowe: porowe, nieszczelne i nieograniczone. Wykorzystanie LY w modelu AO pozwala na szersze badanie przepuszczalności w NEC. Po uzyskaniu zgody IRB i rodziców, pobrano próbki chirurgiczne tkanki jelitowej od wcześniaków. Jelitowe komórki macierzyste pobrano za pomocą izolacji krypty i wykorzystano do hodowli enteroidów. Enteroidy hodowano do dojrzałości, a następnie przekształcano w AO lub pozostawiano w konformacji BO. Pacjenci ci albo nie byli leczeni (kontrola), albo byli leczeni lipopolisacharydem (LPS) i poddawani warunkom niedotlenienia w celu indukcji NEC in vitro. Do oceny przepuszczalności użyto LY. Barwienie immunofluorescencyjne białka wierzchołkowego zonula occludens-1 i białka podstawnobocznego β-kateniny potwierdziło konformację AO. Zarówno enteroidy AO, jak i BO leczone LPS i hipoksją wykazały znacznie zwiększoną przepuszczalność parakomórkową w porównaniu z kontrolą. Zarówno enteroidy AO, jak i BO wykazywały zwiększony wychwyt LY do światła leczonych enteroidów w porównaniu z kontrolami. Wykorzystanie LY w modelu enteroidu AO pozwala na badanie wszystkich trzech głównych szlaków przepuszczalności parakomórkowej. Dodatkowo pozwala na badanie interakcji gospodarz-patogen i ich wpływu na przepuszczalność w porównaniu z modelem enteroidalnym BO.

Konformacja AO 
Enteroidy zawieszone w 50% pośrodku LWRN przez 72 h przyjmują konformację AO (Rycina 1). Potwierdzono to poprzez barwienie immunofluorescencyjne całych preparatów enteroidów w celu wykrycia białka apikalnego, zonula occludens-1 (ZO-1), oraz białka bazolateralnego, β-kateniny (Rycina 1). Enteroidy AO wykazują obecność ZO-1 (zielony) na zewnętrznej powierzchni apikalnej enteroidu, podczas gdy β-katenina (czerwony) znajd...

Obecny protokół przedstawia metodę, która wykorzystuje żółć lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym do określenia przepuszczalności jelit. Metodę tę można zastosować do określenia przepuszczalności parakomórkowej w enteroidach, które modelują choroby zapalne jelit, takie jak martwicze zapalenie jelit.

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Enteroids are an emerging research tool in the study of inflammatory bowel diseases such as necrotizing enterocolitis (NEC). They are traditionally grown ...

Zastosowanie Lucifer Yellow do pożywki enteroidów wierzchołkowych zapewnia prostą metodę analizy ilościowej i jakościowej wszystkich trzech głównych parakomórkowych szlaków przepuszczalności jelit w modelu 3D. Jest to stosunkowo prosta technika, która pozwala nam ocenić przepuszczalność za pomocą modelu enteroidalnego. Pracujemy z tą techniką w naszych badaniach nad martwiczym zapaleniem jelit.Jednak ta technika może być przydatna w badaniu każdej choroby jelit u ludzi, wykorzystując model enteroidalny. Dzisiejsze procedury zademonstrują nasi doktoranci, dr Tyler Leiva i dr Alena Golubkova, a także Camille Schlegel, asystent kierownika badań z naszego laboratorium. Aby rozpocząć, hoduj Androidy osadzone w BMM przez siedem do 10 dni za pomocą 50% pożywki kondycjonowanej LWRN dla generacji enteroidów wierzchołkowych lub AO.Usuń pożywkę z okolic kopuł BMM i dodaj 500 mikrolitrów roztworu do odzyskiwania komórek lub CRS do jednej studzienki. Zeskrob kopułę, odpipetuj ją kilka razy w górę i w dół, aby homogenizować CRS z enteroidami osadzonymi w kopułach BMM i dodaj ten roztwór do następnego dołka. Ponownie zeskrob kopułę i odpipetuj ją kilka razy w górę iw dół przed przeniesieniem roztworu do probówki mikrowirówkowej.Dodaj 500 mikrolitrów CRS do drugiego dołka, pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać i przenieś do pierwszego dołka. Z pierwszego dołka połącz roztwór enteroidu BMM CRS w tej samej 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej i powtórz to łączenie dla pozostałych studzienek, aż zawartość wszystkich studzienek znajdzie się w CRS. Umieścić probówki do mikrowirówek zawierające zbiorczy roztwór CRS na rotatorze na jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie odwirować probówkę mikrowirówkową o sile 200 X g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed usunięciem supernatantu i ponownym zawieszeniem osadu enteroidalnego w jednym mililitrze 50% pożywki kondycjonowanej LWRN. Delikatnie przenieś 500 mikrolitrów ponownie zawieszonego roztworu enteroidu lub pożywki do każdej studzienki 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej o bardzo niskim mocowaniu. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez trzy dni przed eksperymentem.Upewnij się, że enteroidy AO są zawieszone na co najmniej 72 godziny przed użyciem. Delikatnie przenieść wszystkie enteroidy zawieszone w pożywce z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej. Wirować przy 300 X g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.Dodaj 10 mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr lipopolisacharydu lub LPS do 500 mikrolitrów 50% pożywki kondycjonowanej LWRN na studzienkę, aby przygotować mieszankę główną, i ponownie zawiesić osad enteroidowy AO z grupy poddawanej działaniu substancji do 500 mikrolitrów pożywki kondycjonowanej LPS plus 50% LWRN. Pipetuj w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać. Porcję 500 mikrolitrów zawiesiny do każdej studzienki 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu.Podobnie ponownie zawiesić enteroidy AO z nieleczonej grupy kontrolnej w 500 mikrolitrach 50% pożywki kondycjonowanej LWRN na studzienkę i podwielokrotnie 500 mikrolitrów tej zawiesiny do każdej studzienki oddzielnej 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Wywołaj niedotlenienie w enteroidach AO traktowanych LPS za pomocą modułowej komory inkubatora z 1% tlenem, 5% dwutlenkiem węgla i 94% azotem i inkubuj enteroidy z hipoksją i LPS przez 24 godziny. Umieść kultury niepoddane działaniu substancji i LPS plus hipoksja w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla na 24 godziny.Aby zmierzyć przepuszczalność parakomórkową za pomocą Lucifer Yellow lub LY, delikatnie przenieś zawiesinę enteroidu lub pożywki z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej. Ciepłe roztwory soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco lub DPBS i kondycjonowane w 50% LWRN w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 X g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Usunąć pożywkę i przemyć osad enteroidalny 500 mikrolitrami ciepłego DPBS przed odwirowaniem przy 300 X g przez trzy minuty. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i powtórzyć etap płukania DPBS jeszcze raz. Po umyciu DPBS dodaj 450 mikrolitrów ciepłej pożywki kondycjonowanej 50% LWRN i dodaj zawiesinę do płytki 24-dołkowej.Następnie dodaj 50 mikrolitrów po 2,5 miligrama na mililitr LY do każdej studzienki. Delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać, i umieść ją w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla na dwie godziny. Delikatnie odpipetować zawiesinę enteroidalną z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej.Odwirować go i usunąć supernatant, pozostawiając osad enteroidalny. Umyj granulat za pomocą 500 mikrolitrów ciepłego DPBS i odwiruj go. Usunąć supernatant, pozostawiając osad.Powtórzyć trzy płukania DPBS przed ponownym zawiesieniem osadu z 1000 mikrolitrów zimnego DPBS i oddzielić enteroidy przez energiczne mieszanie za pomocą pipety. Dla krzywej wzorcowej Lucyfera Żółtego należy przygotować wzorce rozcieńczone w DPBS zgodnie z opisem w tekście. Odpipetować 150 mikrolitrów każdej próbki na studzienkę w trzech kroplach na 96-dołkowej płytce.Zmierz fluorescencję przy piku wzbudzenia 428 nanometrach i piku emisji 536 nanometrów na czytniku płytek fluorescencyjnych. Obliczyć stężenia za pomocą oprogramowania statystycznego i krzywej czteroparametrowej interpolującej krzywą wzorcową. Barwienie immunofluorescencyjne enteroidów zawieszonych w 50% pożywce LWRN przez 72 godziny wykazało Zo-1 na zewnętrznej powierzchni wierzchołkowej enteroidu, podczas gdy beta katenina jest widoczna na powierzchni podstawno-bocznej.Wskazało to na oczekiwane odwrócenie polaryzacji enteroidów, potwierdzając konformację AO enteroidów. Enteroidy podstawno-boczne lub BO leczone LPS i niedotlenieniem wykazały znacznie zwiększoną przepuszczalność, co wykazano w teście Lucifer Yellow lub LY przez zwiększony wychwyt barwnika LY do światła enteroidu, w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Test Lucyfer Yellow wykazał również zwiększony wychwyt LY w świetle leczonych enteroidów AO w porównaniu z nieleczonymi kontrolami.Potwierdziło to zwiększoną przepuszczalność enteroidów AO leczonych LPS i niedotlenieniem w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Ważne jest, aby dokładnie umyć granulki enteroidów, aby upewnić się, że cały pozaświetlny LY został usunięty. Pozwala to na dokładne ilościowe określenie pozostałego LY w obrębie światła przy obliczaniu przepuszczalności.W celu analizy jakościowej enteroidy można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wychwytu LY do światła. Po inkubacji LY i kolejnych etapach płukania przed dysocjacją od odczytu mikropłytki.

determining-intestinal-permeability-using-lucifer-yellow-an-apical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Prezentujemy test fluorescencyjny, aby wykazać, że Lucyfer Żółty (LY) jest solidnym markerem do określenia pozornej przepuszczalności parakomórkowej monowarstw komórek hCMEC/D3, modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg. Użyliśmy tego testu do określenia kinetyki konfluentnego tworzenia się monowarstwy w hodowanych komórkach hCMEC / D3.

Lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Hemaglutynacja jest rodzajem aglutynacji, w której przeciwciała wiążą się z erytrocytami. Erytrocyty są łatwo dostępne, a wyniki można łatwo zaobserwować gołym okiem. Ten film prezentuje etapy przeprowadzania testu hemaglutynacji, interpretację wyników oraz wyznaczanie miana.

Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji

Poznaj metodę oceny przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym. Technika ta umożliwia badanie chorób jelitowych, w tym martwiczego zapalenia jelit.

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Przeglądaj więcej filmów