Name: Szacowanie uzysku związków na płytce TLC za pomocą techniki oświetlenia niebieską diodą LED (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Odkryj metodę szacowania uzysku związków na płytce TLC za pomocą niebieskiej diody LED. Technika ta jest bezpieczna, skuteczna i ekonomiczna, umożliwiając jednoczesne pomiarowanie wielu próbek w badaniach biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).

Obecny protokół jest opisany na przykładzie lowastatyny. Lowastatyna została wyekstrahowana z tygodniowego Aspergillus terreus.
1. Ekstrakcja związków
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat ekstrakcji związków, zobacz Rysunek 1.
<ol>
	<li>Kultura Aspergillus terreus na agarze z dekstrozą ziemniaczaną (PDA, patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Suszyć kulturę w temperaturze 40 °C przez 24 godziny. Wysuszoną kulturę przenieść do probówki o pojemności 50 ml za pomocą wysterylizowanej pęsety i dodać 15 ml octanu etylu.</li>
	<li>Potrząsać mieszaniną energicznie, wirując przez 1 minutę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 40 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Sonikować mieszaninę za pomocą kąpieli ultradźwiękowej o częstotliwości 40 kHz (patrz tabela materiałów) w temperaturze 40 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę o stężeniu 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i przefiltrować przez bibułę filtracyjną o grubości 11 μm.</li>
	<li>Ekstrahować filtrat z równą objętością sterylnej wody w rozdzielaczu.</li>
	<li>Po rozdzieleniu faz zebrać warstwę organiczną, a następnie odparować w wyparce obrotowej (patrz Tabela materiałów). Rozpuścić pozostałość w 2 ml octanu etylu.</li>
</ol>
2. Oddzielenie surowego ekstraktu przez kolumnę adsorpcyjną fazy normalnej (NP)
<ol>
	<li>Wypełnij kolumnę żelem krzemionkowym NP jako fazą stacjonarną i użyj n-heksan: octan etylu: kwas trifluorooctowy (H: E: T; 80: 20: 0,1, v / v / v) jako fazę ruchomą.</li>
	<li>Załadować 2 ml ekstraktu (etap 1) do kolumny i dodać rozpuszczalnik fazy ruchomej o natężeniu przepływu 1 ml/min w celu wymycia ekstraktu. 
	UWAGA: Natężenie przepływu było regulowane ręcznie za pomocą kranu.</li>
	<li>Sprawdzić ścieki za pomocą TLC, aby potwierdzić obecność lowastatyny, a następnie odparować w wyparce obrotowej w temperaturze 45 °C, aż rozpuszczalnik zostanie usunięty. Ten krok trwa około 20-25 minut.</li>
	<li>Rozpuścić pozostałość w 1 ml octanu etylu, a następnie wymieszać z równą objętością 1% kwasu trifluorooctowego.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę o sile 5 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i zebrać warstwę organiczną do nowej szklanej probówki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i ładowanie płytek do chromatogramu cienkowarstwowego (TLC)
<ol>
	<li>Za pomocą pipety kapilarnej nanieść 5 μl próbek i wzorce lowastatyny (patrz tabela materiałów) na linię podstawową płytki do chromatyki do chromatyki do chromatyki TLC, pozostawiając 1 cm obwódkę po bokach płytki do chromatyki TLC.</li>
	<li>Suszyć płytkę TLC w dygestorium przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę delikatnie za pomocą kleszczyków w nasyconej szklanej komorze zawierającej rozpuszczalnik fazy ruchomej. Przykryj komorę szklaną pokrywką i pozwól płytce w pełni się rozwinąć.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z komory, gdy linia rozpuszczalnika osiągnie 1 cm od górnej krawędzi płytki.</li>
</ol>
4. Analiza przez oświetlacz niebieskiej diody LED
<ol>
	<li>Zaznacz linię rozpuszczalnika ołówkiem. Suszyć płytę w dygestoriach przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po wysuszeniu należy natychmiast namoczyć płytkę w rozpuszczalniku 10%H2SO4, a następnie suszyć w dygestorium przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść talerz na panelu grzewczym, aż pojawią się brązowe plamy. Upewnij się, że płytka nie jest przegrzana, ponieważ może to utrudnić wizualizację lowastatyny.</li>
	<li>Przenieś płytkę do oświetlacza z niebieską diodą LED i zeskanuj za pomocą kompatybilnego darmowego oprogramowania (MiBio Fluo) (patrz Tabela Materiałów).</li>
</ol>
5. Szacowanie plonów za pomocą modelu regresji
<ol>
	<li>Zmierz wymiary pasm za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Ustal model regresji przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (patrz tabela materiałów) w oparciu o malejące stężenia wzorców lowastatyny, w tym 1 mg/ml, 0,75 mg/ml, 0,5 mg/ml i 0,25 mg/ml.</li>
	<li>Zastosuj model regresji, aby oszacować wydajność próbek.</li>
</ol>

<ol><li>Pyka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+progress+of+selected+drugs+in+TLC%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Detection progress of selected drugs in TLC.</a> BioMed Research International. 2014, 732078(2014).</li>
<li>Hess, A. V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitally+enhanced+thin-layer+chromatography%3A+An+inexpensive%2C+new+technique+for+qualitative+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis.</a> Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).</li>
<li>Ullah, Q., Mohammad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamins+determination+by+TLC%2FHPTLC-a+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Planar+Chromatography+-+Modern+TLC%22%5BJournal%5D)">Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review.</a> Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).</li>
<li>Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+identification+of+xanthine+oxidase+inhibitor+and+antioxidant+from+Erycibe+obtusifolia+by+a+drug+discovery+platform+composed+of+multiple+mass+spectrometric+platforms+and+thin-layer+chromatography+bioautography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography.</a> Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).</li>
<li>Duncan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+separations%3A+A+comparison+of+HPLC+and+TLC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC.</a> Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).</li>
<li>Sherma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+in+food+and+agricultural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis.</a> Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).</li>
<li>Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+acetylsalicylic+acid+in+pharmaceutical+drugs+by+TLC+with+densitometric+detection+in+UV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV.</a> Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).</li>
<li>Poole, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+chromatography+at+the+turn+of+the+century%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Planar chromatography at the turn of the century.</a> Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).</li>
<li>Rapid Johnson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((simple+quantitation+in+thin-layer+chromatography+using+a+flatbed+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner.</a> Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).</li>
<li>El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+derivative+spectrophotometric%2C+TLC-densitometric%2C+and+HPLC+determination+of+acebutolol+HCL+in+presence+of+its+acid-induced+degradation+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).</li>
<li>Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase+ion-pair+HPLC+and+TLC-densitometric+methods+for+the+simultaneous+determination+of+ciprofloxacin+hydrochloride+and+metronidazole+in+tablets%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets.</a> Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).</li>
<li>Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+TLC-densitometric+method+for+the+quantification+of+a+steroidal+drug%2C+danazol+in+its+pharmaceutical+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Planar+Chromatography+-+Modern+TLC%22%5BJournal%5D)">Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations.</a> Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

W niniejszym badaniu opisano nowe podejście, oświetlacz z niebieską diodą LED, do ilościowego oznaczania związków bez użycia drogiego i specjalistycznego sprzętu, takiego jak metoda HPTLC, HPLC i GC, a metoda została porównana z testem biologicznym i metodami wykrywanymi w promieniowaniu UV w celu oceny wydajności kwantyfikacji. W rezultacie stwierdzono, że metoda oświetlenia niebieskimi diodami LED jest stosunkowo bezpiecznym i skutecznym protokołem stosowanym do ilościowego określania wydajności docelowych związków na ...

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest szeroko stosowana jako technika jakościowa i ilościowa w dziedzinie chemii organicznej1,2,3. Głównymi zaletami TLC jest to, że zapewnia szybkie wykrywanie, elastyczne wymagania dotyczące próbek i nie wymaga specjalistycznego sprzętu4. Do tej pory, mimo że opracowano wiele zaawansowanych podejść, TLC jest nadal główną metodą identyfikacji nieznanych próbek w mieszaninie. Wyzwaniem związanym z tym podejściem jest jednak brak bezpiecznego i niedrogiego sprzętu do ilościowego określania wydajności próbki, zwłaszcza w przypadku rozwijających się laboratoriów o ograniczonych budżetach. Niniejsze badanie miało zatem na celu opracowanie wydajnej, bezpiecznej i niedrogiej metody łączącej TLC w celu oszacowania wydajności próbek.
W przeciwieństwie do wysokowydajnej TLC (HPTLC), wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i chromatografii gazowej (GC) z surowymi wymaganiami dotyczącymi próbek, czasochłonnością i zaangażowaniem wieloetapowego przygotowania próbki1,5, TLC wykazało kilka zalet. Po pierwsze, w celu przygotowania próbki, HPLC i GC nie mogą wykryć surowego ekstraktu, ponieważ surowy ekstrakt może zatkać kolumnę HPLC i GC. Po drugie, gdy próbki nie są odpowiednie dla promieniowania UV (ważne dla analizy HPLC) lub mają niską lotność (ważne dla analizy GC), TLC można zastosować do tych próbek, a użycie odczynnika do wizualizacji sprawia, że izolowane próbki są widoczne na cienkich warstwach6,7,8. Po trzecie, w przypadku zwykłych użytkowników, HPLC i GC na ogół wymagają stosunkowo długiego czasu wstępnego szkolenia przed samodzielną pracą w porównaniu z TLC. Ponadto ilościowa analiza TLC, znana jako TLC o wysokiej wydajności (HPTLC), może digitalizować informacje na płytce TLC za pomocą bardzo czułego skanera. Jednak koszt systemu HPTLC jest stosunkowo wysoki. W związku z tym opracowanie opłacalnego i szybkiego podejścia do ilościowego oznaczania próbek na płytce TLC jest ważnym tematem.
Podobne metody zostały opracowane do oznaczania plonów TLC; na przykład, Johnson9 opisała technikę, która pozwala na ilościowe określenie próbek na płytce TLC za pomocą skanera płaskiego podłączonego do komputera. W 2001 roku El-Gindy i in.10 opracowali metodę densytometryczną TLC-, która została wykorzystana do wykrycia związku o gęstości optycznej, a technika ta została również zastosowana przez Elkady et al.11. W 2007 roku Hess2 zaprezentował metodę cyfrowo wzmocnioną TLC (DE-TLC) zastosowaną do wykrywania wydajności związku na płytce TLC za pomocą kamery cyfrowej w połączeniu ze światłem UV. Hess porównał również różnice w kosztach między metodą HPTLC i DE-TLC i doszedł do wniosku, że metoda DE-TLC może być stosowana w laboratoriach szkół średnich i studenckich ze względu na jej przystępny koszt2. Jednak koszt metody densytometrycznej TLC był nadal wysoki, a działanie światła ultrafioletowego wymaga odpowiedniego wcześniejszego przeszkolenia na wypadek, gdyby użytkownicy mogli być narażeni na promieniowanie ultrafioletowe. W związku z tym, zgodnie z TLC, pożądane jest opracowanie wydajnej, bezpiecznej i niedrogiej metody ilościowego określania wydajności próbki.
Niniejsze badanie opisało protokół wykrywania próbki na płytce TLC za pomocą oświetlacza niebieskiej diody LED i opracowało model regresji o wysokiej niezawodności (wysoka wartość R-kwadrat) do pomiaru wymiarów pasm, a następnie określenia wydajności złożonej. Ostatecznie stwierdzono, że metoda oświetlenia niebieskimi diodami LED jest stosunkowo bezpieczna (vs. Metoda wykrywania promieniowania UV), tanie (vs. GC, HPLC i HPTLC) oraz skuteczne (w porównaniu z metodą testu biologicznego) podejście do kwantyfikacji plonów.

<table><tbody><tr><td>Amerykański agar bakteriologiczny</td><td>Condalab</td><td>1802.00</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus terreus&nbsp; </td><td></td><td>ATCC 20542</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz Blue-LED</td><td>MICROTEK</td><td>Bio-1000F</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>HERAEUS Megafuge 8</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowa lampa</td><td>UVP</td><td>UVP UVGL-25</td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>MACRON</td><td>MA-H078-10</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna 125mm</td><td>ADVANTEC</td><td>60311102</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Freeware</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>standardu lowastatyny</td><td>ACROS</td><td>A0404262</td><td></td></tr><tr><td>MiBio Fluo&nbsp;</td><td>MICROTEK</td><td>V1.04</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>C-ECHO</td><td>HH3102-000000-72EC</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab</td><td>9.1</td><td>https://www.originlab.com/origin</td></tr><tr><td>Rosół z dekstrozy ziemniaczanej H</td><td>STBIO MEDIA</td><td></td><td></td></tr> 110533 <tr><td>Parownik obrotowy</td><td>EYELA</td><td>SB-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Fluka</td><td>30743-2.5L-GL</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy TLC 60 F254</td><td>MERCK</td><td>1.05554.0001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>10229873</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa maszyna wibracyjna</td><td>DELTA</td><td>DC600</td><td></td></tr></tbody></table>

szacowanie uzysku związków na płytce tlc za pomocą techniki oświetlenia niebieską diodą led

Estimating the Yield of Compounds on the TLC Plate via the Blue-LED Illumination Technique

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest dostępną techniką analityczną, która jest szeroko stosowana w badaniach chemii organicznej do ilościowego określania wydajności nieznanych próbek. W ramach niniejszego badania opracowano skuteczną, tanią i bezpieczną metodę szacowania wydajności próbek na płytce TLC przy użyciu oświetlacza z niebieską diodą LED. Lowastatyna wyekstrahowana z Aspergillus terreus była przykładem związku zastosowanego w niniejszym badaniu. Do oceny wydajności lowastatyny wykorzystano modele regresji oparte na standardzie lowastatyny. Porównano trzy metody: test biologiczny, detekcję UV i oświetlenie niebieskimi diodami LED. Wyniki pokazały, że metoda oświetlenia niebieskimi diodami LED jest znacznie bardziej efektywna czasowo niż metody wykrywania UV i testów biologicznych. Dodatkowo, niebieskie oświetlenie LED było stosunkowo bezpieczną opcją ze względu na obawy związane z zagrożeniami biologicznymi w metodzie testu biologicznego (np. infekcja mikrobiologiczna) i ekspozycją na promieniowanie ultrafioletowe w metodzie wykrywania UV. W porównaniu z drogimi metodami wymagającymi specjalistycznych przyrządów i długotrwałego szkolenia przed samodzielną pracą, takimi jak GC, HPLC i HPTLC, użycie oświetlacza z niebieską diodą LED było ekonomiczną opcją do oszacowania wydajności próbek z płytki TLC.

W niniejszej pracy przedstawiono metodę iluminacji niebieską diodą LED do szacowania wydajności związków; metoda ta została zwalidowana i porównana z metodą bioassay oraz metodami z detekcją UV (Tabela 1). W celu przewidzenia wydajności próbek opracowano modele regresji w oparciu o odpowiednio wymiary prążków oraz stężenia standardów dla trzech metod. Po pierwsze, w wynikach metody bioassay współczynnik R-kwadrat pomiędzy wymiarami strefy inhibicji a standardami lovastatyny wyniósł 0,99, a wydajność prób...

Obecny protokół opracował metodę szacowania wydajności związków na płytce TLC przy użyciu techniki niebieskiego oświetlenia LED. Zaletą tego podejścia jest to, że jest bezpieczne, skuteczne, niedrogie i pozwala badaczowi na jednoczesny pomiar wielu próbek.

Szacowanie uzysku związków na płytce TLC za pomocą techniki oświetlenia niebieską diodą LED

Thin-layer chromatography (TLC) is an accessible analytical technique that has been extensively used in organic chemistry research to quantify the yield ...

W ramach tego protokołu opracowano metodę szacowania wydajności związków na płytce TLC przy użyciu techniki oświetlenia niebieskimi diodami LED. Zaletą tej metody jest to, że technika oświetlenia niebieskimi diodami LED jest bezpieczną, skuteczną i tanią metodą, a także pozwala badaczowi na pomiar wielu próbek w tym samym czasie. Metoda ta może być również stosowana w biochemii i chemii produktów naturalnych.Na początek susz kulturę w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Przenieś wysuszoną kulturę do 50-mililitrowej probówki za pomocą wysterylizowanej pęsety i dodaj 15 mililitrów octanu etylu. Potrząsaj mieszaniną energicznie, wirując przez jedną minutę i inkubuj probówkę przez godzinę w temperaturze 40 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.Następnie sonikować mieszaninę za pomocą 40-kilohercowej łaźni ultradźwiękowej w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Następnie odwirować mieszaninę o sile 5 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i przefiltrować przez bibułę filtracyjną o grubości 11 mikrometrów. Ekstrahować filtrat z równą objętością sterylnej wody w rozdzielaczu.Po rozdzieleniu faz zbierz warstwę organiczną, odparuj ją w parowniku obrotowym i rozpuść pozostałość w dwóch mililitrach octanu etylu. Wypełnij kolumnę żelem krzemionkowym z normalną fazą jako fazą stacjonarną i użyj octanu etylu n-heksanu i kwasu trifluorooctowego jako fazy ruchomej. Załadować dwa mililitry ekstraktu na kolumnę i dodać rozpuszczalnik fazy ruchomej z szybkością przepływu jednego mililitra na minutę, aby wymyć ekstrakt.Po sprawdzeniu ścieków za pomocą TLC w celu potwierdzenia obecności lowastatyny, odparować w wyparce obrotowej w temperaturze 45 stopni Celsjusza, aż rozpuszczalnik zostanie usunięty. Rozpuść pozostałość w jednym mililitrze octanu etylu, a następnie wymieszaj z równą objętością 1% kwasu trifluorooctowego. Odwirować mieszaninę w temperaturze 5 000 G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i zebrać warstwę organiczną do nowej szklanej probówki.Za pomocą pipety kapilarnej nanieś pięć mikrolitrów próbek i wzorców lowastatyny na linię podstawową płytki TLC, pozostawiając granicę jednego centymetra po bokach płytki TLC. Następnie wysuszyć płytkę TLC w dygestorium przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Umieścić płytkę delikatnie za pomocą kleszczyków w nasyconej szklanej komorze zawierającej rozpuszczalnik fazy ruchomej.Przykryj komorę szklaną pokrywką i pozwól płytce w pełni się rozwinąć. Wyjmij płytkę z komory, gdy linia rozpuszczalników osiągnie jeden centymetr od górnej krawędzi płytki. Zaznacz linię rozpuszczalnika ołówkiem i wysusz płytkę w dygestoriach przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Po wysuszeniu należy natychmiast namoczyć płytkę w 10% rozpuszczalniku kwasu siarkowego, a następnie wysuszyć w dygestorium przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieść talerz na panelu grzewczym, aż pojawią się brązowe plamy. Przenieś płytkę do oświetlacza z niebieską diodą LED i zeskanuj za pomocą kompatybilnego darmowego oprogramowania.Wyniki uzyskane metodą testu biologicznego wykazały, że kwadrat R między wymiarami strefy inhibicji a wzorcami lowastatyny wynosił 0,99, a wydajność próbki wynosiła 0,56 miligrama, zgodnie z przewidywaniami modelu regresji. Metoda detekcji UV pokazuje, że kwadrat R między wzorcami lowastatyny a wymiarem prążków na płytce TLC wynosił 0,97, a wydajność próbki przewidywana przez model regresji wynosiła 0,53 miligrama. Krawędzie pasma były jednak rozmyte i obserwowano pasma o stosunkowo niskim natężeniu sygnału.W przypadku metody oświetlenia niebieskimi diodami LED kwadrat R między wzorcami lowastatyny a wymiarem opaski na płytce TLC wynosił 0,98, a wydajność próbki wynosiła 0,54 miligrama, zgodnie z przewidywaniami modelu regresji. Przewidywana wydajność przy użyciu oświetlacza z niebieską diodą LED była bliższa metodzie testu biologicznego i uzyskano przezroczyste pasma. Jeśli płytka jest przegrzana, wizualizacja lowastatyny może być trudna do zaobserwowania.

estimating-yield-compounds-on-tlc-plate-via-blue-led-illumination

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skład ekstraktów lipidów polarnych oraz skład kwasów tłuszczowych poszczególnych gliceryolipidów są określane w prostym i niezawodnym eksperymencie profilowania lipidów. W tym celu gliceryolipidy są izolowane za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, a następnie poddawane transmetylacji ich grup acylowych. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii gazowo-cieczowej.

Profilowanie polarnych glicerolipidów Arabidopsis thaliana za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) sprzężonej z chromatografią gazowo-cieczową (GLC)

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Opisano metody cienkowarstwowej chromatografii (TLC) separacji ekstraktów roślinnych i kontaktowej bioautografii w celu identyfikacji metabolitów przeciwbakteryjnych. Metody te stosuje się do badań przesiewowych związków fenolowych koniczyny czerwonej hamujących bakterie wytwarzające hiperamoniak (HAB) pochodzące ze żwacza bydła.

Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

Pochodzenie flawonolu jest kluczowe dla jego zastosowania w opiece zdrowotnej i przemyśle spożywczym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół biosyntezy flawonolu z flawanonu i omawiamy kluczowe etapy i jego zalety w porównaniu z innymi podejściami.

Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej

Ta metoda opisuje użycie nowatorskiej metodologii wysokoprzepustowej, opartej na reakcjach chemicznych kropelk, do szybkiej i ekonomicznej optymalizacji radiofarmaceutyków przy użyciu nanomolowych ilości odczynników.

Optymalizacja reakcji radiochemicznych z wykorzystaniem matryc kropelkowych

Tutaj przedstawiono protokół metabolicznego znakowania drożdży kwasem 14C-octowym, który jest sprzężony z chromatografią cienkowarstwową w celu oddzielenia obojętnych lipidów.

Analiza neutralnej syntezy lipidów w Saccharomyces cerevisiae za pomocą znakowania metabolicznego i chromatografii cienkowarstwowej

Prezentujemy technikę wstrzykiwania dosytniewnego u dorosłych rybek danio-ostrobramkowych. Używamy mikrosyringi NanoFil o pojemności 10 μl, sterowanej za pomocą kontrolera Micro4 oraz pompy UltraMicroPump III. Demonstracja obejmuje wykorzystanie zimnej wody jako środka znieczulającego.

Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury związane z nadekspresją i analizą małych GTPaz w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych z wykorzystaniem techniki mikroiniekcji.

Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Odkryj metodę szacowania uzysku związków na płytce TLC za pomocą niebieskiej diody LED. Technika ta jest bezpieczna, skuteczna i ekonomiczna, umożliwiając jednoczesne pomiarowanie wielu próbek w badaniach biochemicznych.

Szacowanie uzysku związków na płytce TLC za pomocą techniki oświetlenia niebieską diodą LED

Przeglądaj więcej filmów