Name: Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Poznaj protokół badań radiacyjnych z użyciem zarodków Danio rerio do oceny radiotoksyczności i skuteczności leków. Metoda umożliwia walidację radiosensybilizatorów i obrońców w radioterapii nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratorium SS i laboratorium RKS są finansowane z grantów DBT i SERB z Indii. APM jest stypendystą ICMR Fellowship Rządu Indii. DP jest stypendystą CSIR Rządu Indii. ONZ jest stypendystą DST-Inspire przyznawanym przez rząd Indii. Rysunek 2 został wygenerowany przy użyciu narzędzia Biorender (https://biorender.com).

Obecne badanie zostało przeprowadzone za uprzednią zgodą i zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu Etyki Zwierząt, Instytut Nauk Przyrodniczych, Bhubaneswar. Wszystkie czynności pielęgnacyjne i hodowlane danio pręgowanego przeprowadzono w pomieszczeniu do hodowli ryb w temperaturze 28,5 °C, a zarodki utrzymywano w inkubatorze z biologicznym zapotrzebowaniem na tlen (BZT) w temperaturze 28,5 °C. W tym przypadku użyto szczepu AB danio pręgowanego, a inscenizacja została przeprowadzona zgodnie z Kimmel et al.54. Promieniowanie rentgenowskie podawano przy 6 hpf (stadium tarczy), a różne fenotypy obserwowano do 120 hpf.
1. Hodowla i pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Ustaw zbiorniki hodowlane (wykonane z poliwęglanu, pojemność 1 l, patrz tabela materiałów). Wlać wodę systemową (pH, 6,8-7,5; przewodność, 500 μS; i temperaturę, 28,5 °C) do zbiorników hodowlanych, pokrywając prawie 40% jej objętości. Umieść przegrodę w zbiorniku, aby utworzyć dwie komory, jedną dla samic, a drugą dla samców.</li>
	<li>Ze zbiorników rodzicielskich ostrożnie zebrać dwie zdrowe samice i jednego zdrowego samca za pomocą siatki, umieścić je w odpowiednich połówkach i trzymać w ciemności przez noc (minimum 10 godzin) w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Następnego ranka usuń przegrodę i pozwól rybom łączyć się w pary, nie zakłócając pracy zbiorników hodowlanych. 
	UWAGA: Samice rozpoczną tarło, a jaja będą widoczne leżące na dnie zbiornika w ciągu 10-15 minut po tym, jak ryby będą mogły się kojarzyć56,57,58.</li>
	<li>Po tarle ryb należy umieścić z powrotem w zbiornikach, zebrać zarodki ze zbiornika hodowlanego za pomocą sitka, umyć je odpowiednio wodą systemową i przechowywać zebrane jaja na szalce Petriego z pożywką E-3 (4,94 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,43 mM CaCl2, 0,85 mM soli MgCl2, 1% w/v błękitu metylenowego, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Obserwować jaja pod mikroskopem preparacyjnym, usunąć niezapłodnione lub martwe zarodki za pomocą pipety Pasteura i przechowywać płytki Petriego zawierające zapłodnione jaja w pożywce E-3 w temperaturze 28,5 °C w inkubatorze w celu ich prawidłowego wzrostu i utrzymania. 
	UWAGA: Niezapłodnione jaja można zidentyfikować po mlecznobiałym wyglądzie ze skoagulowaną kosmówką lub z pękniętymi komórkami wewnątrz kosmówki. Wraz z niezapłodnionymi komórkami jajowymi, jaja nieulegające rozszczepieniu oraz jaja z deformacjami, takimi jak nieprawidłowości podczas rozszczepienia, np. asymetria, tworzenie się pęcherzyków, uszkodzenia kosmówki lub nierozwijające się aktywnie, muszą zostać odrzucone, aby utrzymać pobrane zarodki w zdrowiu i utrzymać podłoże w czystości7,56.</li>
</ol>
2. Monitorowanie embrionów i selekcja do eksperymentów radiacyjnych
<ol>
	<li>Monitoruj rosnące zarodki pod mikroskopem preparacyjnym, zidentyfikuj właściwy etap7,54 i usuń wszelkie martwe lub niezdrowe zarodki. Należy zapewnić odpowiednią ocenę zarodka, ponieważ dawki promieniowania i leków będą podawane na określonym etapie gastrulacji. 
	UWAGA: Codziennie sprawdzaj poziom i jakość pożywek w naczyniach hodowlanych. Zmieniaj pożywkę co 24 godziny, wraz z usuwaniem martwych zarodków. Pipety Pasteura są preferowane do pobierania zarodków lub zmiany podłoża.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ostrożnie rozprowadzić zdrowe zarodki na płytkach doświadczalnych za pomocą pipety Pasteura. Dla każdej grupy eksperymentalnej należy pobrać 15-20 zarodków. 
	UWAGA: Na płytce doświadczalnej umieszczać tylko zdrowe zarodki w pożądanych stadiach rozwojowych. Załóżmy, że leczenie farmakologiczne musi być przeprowadzone na zarodkach w temperaturze 6 hpf, a następnie zacznij wysiewać je na płytki eksperymentalne co najmniej 30-60 minut wcześniej.</li>
</ol>
3. Leczenie odwykowe
<ol>
	<li>Dodaj leki o pożądanym stężeniu do zarodków danio pręgowanego. Pożywkę E-3 zawierającą lek należy przygotować z dużym wyprzedzeniem. Upewnij się, że roztwór podstawowy leku nie zawiera nierozpuszczonego leku przed przygotowaniem pożywki roboczej do leczenia zarodków danio pręgowanego.</li>
	<li>Przed dodaniem jakiegokolwiek leku do pożywki w celu badania przesiewowego promieniowania należy sprawdzić cytotoksyczne działanie leku wraz ze stopniami stężeń leku. Postępuj zgodnie z wytycznymi OECD, aby ocenić LC 50 ocenianych leków59,60,61. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas przesuwania talerzy i naczyń w czasie naświetlania lub obserwacji. Istnieje wiele szans, że płytki zostaną naruszone podczas tego obchodzenia się, powodując wyciek pożywki ze studzienek lub wylanie się zarodków z odpowiednich studzienek, potencjalnie zanieczyszczając pobliskie studnie i rujnując eksperyment.</li>
</ol>
4. Naświetlanie promieniowaniem rentgenowskim
<ol>
	<li>Przygotowując się do eksperymentu z promieniowaniem, należy uwzględnić grupę kontrolną/nienapromieniowaną i grupę tylko napromieniowaną. Podobnie, wykonując badanie przesiewowe leków, uwzględnij inną grupę, w której leki będą podawane w takim samym stężeniu, jak te podawane w eksperymencie przesiewowym wraz z promieniowaniem. 
	UWAGA: Oznacz zarówno pokrywkę, jak i podstawę płytek studzienkowych lub naczyń hodowlanych, aby pokrywki nie zostały zgubione.</li>
	<li>Rozmieścić zarodki w płytce studzienki, jeśli osłony przed promieniowaniem mogą zakryć i chronić dodatkowe studzienki przed promieniowaniem, podczas gdy inne studzienki są wystawione na działanie określonej dawki promieniowania; w przeciwnym razie należy użyć pojedynczych płytek lub krążków do wysiewu zarodków według dawki promieniowania.</li>
	<li>Włączyć promiennik promieniowania rentgenowskiego (patrz Tabela materiałów) i rozpocząć inicjalizację i rozgrzewanie urządzenia. 
	UWAGA: Wartość odległości od źródła do obiektu (SSD) musi wynosić 50 cm; można jeszcze raz korzystać z różnych dysków SSD, co wymaga standaryzacji.</li>
	<li>Umieść płytkę eksperymentalną pod promiennikiem wewnątrz urządzenia pośrodku, upewniając się, że płytka znajduje się bezpośrednio pod źródłem promieniowania rentgenowskiego, a następnie ustaw dawkę (np. 5 GY) i rozpocznij promieniowanie rentgenowskie. 
	UWAGA: Uszczelnij płytki folią parafinową, aby uniknąć niepożądanego rozlania lub zanieczyszczenia podczas transportu płytek z inkubatora do nagrzewnicy i z powrotem.</li>
	<li>Po zakończeniu naświetlania należy wyjąć płytki, wyłączyć program maszyny, wyłączyć maszynę i sprawdzić płytki pod mikroskopem natychmiast po napromieniowaniu. Usunąć martwe zarodki i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C. Zanotować liczbę martwych zarodków po ich ocenie pod mikroskopem preparacyjnym. 
	UWAGA: Napromieniać różne grupy zarodków wyznaczonymi dawkami promieniowania bez większej zwłoki między poszczególnymi grupami, ponieważ na efekt promieniowania może mieć znaczący wpływ różnica w stadium rozwoju. 
	UWAGA: Podczas obsługi aparatu rentgenowskiego należy podjąć odpowiednie środki ochronne.</li>
</ol>
5. Zbieranie, obrazowanie i analiza danych
<ol>
	<li>Zbieraj dane w określonych odstępach czasu, np. co 24 godziny po podaniu promieniowania. Zapisz wszystkie możliwe obserwacje, takie jak przeżywalność, wydajność wylęgu, etap rozwoju, liczba uderzeń serca, krzywizna ciała i ogona, obrzęk osierdzia, rozszerzenie woreczka żółtkowego, małogłowie, rozwój pęcherza pławnego, ogólna ruchliwość lub aktywność itp.62,63,64.</li>
	<li>Aby uchwycić obrazy, wybierz reprezentatywne zarodki na czystym szkiełku, sprawdź zarodki pod mikroskopem, ustaw je w określonym kierunku i kliknij obrazy. Zmień nazwy plików obrazów zgodnie z grupą i czasem. 
	UWAGA: Podczas robienia zdjęć w różnych odstępach czasu należy używać tego samego powiększenia i oświetlenia.</li>
</ol>

Autorzy zadeklarowali brak sprzecznych interesów.

Danio pręgowany jest wykorzystywany jako cenne modele w wielu badaniach, w tym w kilku rodzajach badań nad rakiem. Model ten stanowi użyteczną platformę do badań przesiewowych narkotyków na dużą skalę67,68. Podobnie jak w przypadku każdej innej metody oceny toksyczności, ilościowa ocena głównych zmian biologicznych po napromieniowaniu i/lub leczeniu farmakologicznym jest najważniejszą częścią tego protokołu. W tego rodzaju badaniach przeżycie nie może być jedynym...

Danio rerio to dobrze znany model zwierzęcy, który był szeroko wykorzystywany w badaniach przez ostatnie 3 dekady. Jest to mała ryba słodkowodna, która jest łatwa w hodowli i rozmnażaniu w warunkach laboratoryjnych. Danio pręgowany był szeroko wykorzystywany do różnych badań rozwojowych i toksykologicznych1,2,3,4,5,6,7,8. Danio pręgowany ma wysoką płodność i krótkie pokolenie embrionalne; Zarodki nadają się do śledzenia różnych etapów rozwoju, są wizualnie przezroczyste i podatne na różne manipulacje genetyczne i platformy badań przesiewowych o wysokiej przepustowości9,10,11,12,13,14. Poza tym danio pręgowany zapewnia obrazowanie in toto i na żywo, dla którego jego proces rozwojowy i różne deformacje w obecności różnych substancji lub czynników toksycznych można łatwo zbadać za pomocą mikroskopii stereoskopowej lub fluorescencyjnej7,15,16.
Radioterapia jest jednym z głównych sposobów leczenia raka17,18,19,20,21,22,23,24. Jednak radioterapia nowotworów wymaga potencjalnych radioprotektorów, aby chronić normalne, zdrowe komórki przed śmiercią podczas zabijania komórek nowotworowych lub chronić zdrowie ludzkie podczas terapii z wykorzystaniem promieniowania o wysokiej energii25,26,27,28,29. Z drugiej strony, badane są również silne radiosensybilizatory w celu zwiększenia skuteczności promieniowania w zabijaniu komórek nowotworowych, zwłaszcza w terapiach celowanych i precyzyjnych30,31,32,33. W związku z tym, aby zweryfikować silne radioprotektory i uczulacze, bardzo pożądany jest model odpowiedni do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i mierzalnie wykazujący skutki promieniowania. Kilka dostępnych modeli jest wykorzystywanych w badaniach promieniowania i bierze udział w eksperymentach z badaniami przesiewowymi leków. Jednak wyższe kręgowce, a nawet najczęściej stosowany model in vivo, myszy, nie nadają się do badań przesiewowych leków na dużą skalę, ponieważ projektowanie takich eksperymentów przesiewowych przy użyciu tych modeli jest czasochłonne, kosztowne i trudne. Podobnie, modele hodowli komórkowych są idealne dla różnych odmian wysokoprzepustowych eksperymentów przesiewowych leków34,35. Jednak eksperymenty z udziałem hodowli komórkowej nie zawsze są pragmatyczne, wysoce powtarzalne lub wiarygodne, ponieważ komórki w hodowli mogą znacznie zmienić swoje zachowanie w zależności od warunków wzrostu i kinetyki. Również różne typy komórek wykazują zróżnicowane uczulenie na promieniowanie. Warto zauważyć, że systemy hodowli komórkowych 2D i 3D nie reprezentują całego scenariusza organizmu, a zatem uzyskane wyniki mogą nie odzwierciedlać rzeczywistego poziomu radiotoksyczności36,37. Pod tym względem danio pręgowany zapewnia kilka korzyści w badaniach przesiewowych pod kątem nowych radiosensybilizatorów i radioprotektorów. Łatwość obsługi, duży rozmiar sprzęgła, krótka żywotność, szybki rozwój embrionalny, przezroczystość zarodka i mały rozmiar ciała sprawiają, że danio pręgowany jest odpowiednim modelem do badań przesiewowych leków na dużą skalę. Dzięki powyższym zaletom eksperymenty można łatwo powtórzyć w krótkim czasie, a efekt można łatwo zaobserwować pod mikroskopem preparacyjnym na płytkach wielodołkowych. W związku z tym danio pręgowany zyskuje na popularności w badaniach przesiewowych leków, w tym w badaniach nad promieniowaniem38,39.
Potencjał danio pręgowanego jako prawdziwego modelu do badania modyfikatorów promieniowania został wykazany w różnych badaniach40,41,42,43,44,45. Opisano radioprotekcyjne działanie potencjalnych modyfikatorów radiowych, takich jak nanocząstki DF1, amifostyna (WR-2721), białka naprawy DNA KU80 i ATM oraz przeszczepione hematopoetyczne komórki macierzyste, a także działanie radiouczulaczy, takich jak flawopiridol i AG1478, w modelu danio pręgowanego19,41,42,43,44,45,46. Korzystając z tego samego systemu, oceniono radioprotekcyjne działanie DF-1 (nanocząstki fulerenu) zarówno na poziomie ogólnoustrojowym, jak i specyficznym dla narządów, a także zbadano wykorzystanie zarodków danio pręgowanego do badań przesiewowych pod kątem radioprotektorów47. Niedawno doniesiono, że miód Kelulut jest radioprotektorem w zarodkach danio pręgowanego i stwierdzono, że zwiększa przeżywalność zarodków i zapobiega uszkodzeniom specyficznym dla narządów, uszkodzeniom DNA komórkowego i apoptozie48.
Podobnie, radioprotekcyjne efekty polimerów powstałych w wyniku reakcji Hantzscha zostały sprawdzone na zarodkach danio pręgowanego w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym, a ochrona była głównie zapewniona przez ochronę komórek przed uszkodzeniem DNA49. W jednym z poprzednich badań lipofilowa statyna fluwastatyna została uznana za potencjalny radiosensybilizator przy użyciu modelu danio pręgowanego z tym podejściem50. Podobnie, nanocząstki złota są uważane za idealny radiosensybilizator i były używane w wielu badaniach51,52.
Rozwój embrionalny u ryb zebry obejmuje rozszczepienie w ciągu pierwszych 3 godzin, podczas których jednokomórkowa zygota dzieli się na 2 komórki, 4 komórki, 8 komórek, 16 komórek, 32 komórki i 64 komórki, które można łatwo zidentyfikować za pomocą stereomikroskopu. Następnie osiąga stadium blastuli ze 128 komórkami (2,25 h po zapłodnieniu, hpf), gdzie komórki podwajają się co 15 minut i przechodzą przez następujące etapy: 256 komórek (2,5 hpf), 512 komórek (2,75 hpf) i osiągając 1,000+ komórek w zaledwie 3 godziny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Po 4 godzinach jajo osiąga stadium kuli, po którym następuje formowanie się kształtu kopuły w masie embrionalnej7,53,54. Gastrulacja u danio pręgowanego zaczyna się od 5.25 hpf54, gdzie osiąga etap tarczy. Tarcza wyraźnie wskazuje na szybki ruch konwergencji komórek na jedną stronę pierścienia zarodkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i jest wyraźną i wyraźną fazą gastrulatujących zarodków, którą można łatwo zidentyfikować53,54. Chociaż narażenie embrionów na promieniowanie może być przeprowadzone na każdym etapie ich rozwoju, narażenie na promieniowanie podczas gastrulacji może mieć bardziej wyraźne zmiany morfologiczne, co ułatwia lepsze odczyty toksyczności wywołanej promieniowaniem55; Podobnie, podawanie leków do zarodków można rozpocząć już od 2 HPF54.

<table><tbody><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>CLS3335</td><td>Polistyren</td></tr><tr><td>B.O.D Inkubator</td><td>Oswald</td><td>JRIC-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>10101-41-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik zewnętrzny do zbiornika hodowlanego 1,0 l</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTE</td><td>Poliwęglan</td></tr><tr><td>Szklane płytki</td><td>szklane Borosil</td><td>3165A75</td><td>Szkło</td></tr><tr><td>GraphpadPrism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>Wersja 5.01</td></tr><tr><td>Prowadnice wklęsłe Kline</td><td>Himedia</td><td>GW092-1PK</td><td>Szkło</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat błękitu metylenowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66720-100G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Tarsons</td><td>380020</td> Pipety Pasteura <td>z folią parafinową</td></tr><tr><td></td><td>Himedia</td><td>PW1212-1X500NO</td><td>Polietylen </td></tr><tr><td>Plastikowy perforowany zbiornik wewnętrzny do zbiornika hodowlanego 1,0 l</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTI</td><td>Poliwęglan</td></tr><tr><td>Przegroda z poliwęglanu do zbiornika hodowlanego 1,0 l</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTD</td><td>Pokrywa z poliwęglanu</td></tr> do <tr><td>zbiornika hodowlanego 1,0 l</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTL</td><td>Poliwęglan</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Granulat wodorotlenku sodu</td><td>SRL</td><td>1949181</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Leica M205FA</td><td>Leica</td><td>Model/PN MDG35/10 450 125</td><td></td></tr><tr><td>X-Rad 225 Precyzyjny aparat rentgenowski</td><td>X-RAD</td><td>225XL</td><td></td></tr></tbody></table>

larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Zebrafish Larvae as a Model to Evaluate Potential Radiosensitizers or Protectors

Danio pręgowany jest szeroko stosowany w wielu rodzajach badań, ponieważ są jednym z najłatwiejszych w utrzymaniu modeli kręgowców i wykazują kilka cech unikalnego i wygodnego systemu modelowego. Ponieważ wysoce proliferacyjne komórki są bardziej podatne na uszkodzenia DNA wywołane promieniowaniem, zarodki danio pręgowanego są pierwszym modelem in vivo w badaniach nad promieniowaniem. Ponadto model ten przewiduje wpływ promieniowania i różnych leków w krótkim czasie, wraz z głównymi zdarzeniami biologicznymi i związanymi z nimi reakcjami. W kilku badaniach nad rakiem wykorzystano danio pręgowanego, a protokół ten opiera się na zastosowaniu modyfikatorów promieniowania w kontekście radioterapii i raka. Metoda ta może być z łatwością stosowana do walidacji wpływu różnych leków na napromieniane i kontrolne (nienapromieniane) zarodki, identyfikując w ten sposób leki jako leki uczulające na promieniowanie lub ochronne. Chociaż metodologia ta jest stosowana w większości eksperymentów przesiewowych dotyczących leków, szczegóły eksperymentu i ocena toksyczności na tle ekspozycji na promieniowanie rentgenowskie są ograniczone lub omówione tylko pobieżnie, co utrudnia ich przeprowadzenie. W niniejszym protokole poruszono tę kwestię i omówiono procedurę oraz ocenę toksyczności wraz ze szczegółową ilustracją. Procedura opisuje proste podejście do wykorzystania zarodków danio pręgowanego do badań promieniowania i badań przesiewowych leków opartych na promieniowaniu, z dużą niezawodnością i powtarzalnością.

Ogólny schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 2. Wpływ promieniowania oraz charakterystykę zależną od dawki oceniono za pomocą następujących analiz.
Ocena toksyczności indukowanej promieniami rentgenowskimi 
Przy użyciu stereomikroskopu oceniono i scharakteryzowano następujące nieprawidłowości po podaniu leku i/lub napromieniowaniu. Zgodnie z wytycznymi OECD61, w celu oceny toksyczności u ryb, do an...

Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Zebrafish are extensively used in several kinds of research because they are one of the easily maintained vertebrate models and exhibit several features ...

Protokół ten opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny leczenia różnymi lekami i promieniowaniem. Pomoże to czytelnikom w ustaleniu półwysokoprzepustowych badań przesiewowych leków obejmujących ekspozycję na promieniowanie rentgenowskie z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego, które pomogą w ocenie radiotoksyczności i skuteczności różnych stosowanych leków. Procedura ta może być stosowana do badań przesiewowych i walidacji lub oceny różnych leków jako potencjalnych radiouczulaczy lub ochronników, które mogą być dalej badane lub wykorzystywane w dziedzinie radioterapii nowotworów lub radiobiologii.Na początek monitoruj rosnące zarodki pod mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj właściwy etap i usuń martwe lub niezdrowe zarodki. Upewnij się, że odpowiedni stopień zarodka to promieniowanie, a dawki leków zostaną podane na określonym etapie gastrulacji.Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ostrożnie rozprowadzić zdrowe zarodki na płytkach doświadczalnych za pomocą pipety Pasteura. Dla każdej grupy eksperymentalnej należy pobrać od 15 do 20 zarodków. Przygotowując się do eksperymentu z promieniowaniem, należy uwzględnić grupę kontrolną nienapromieniowaną i grupę tylko napromieniowaną.Rozmieścić zarodki w płytce studzienki, jeśli osłony przed promieniowaniem mogą zakryć i chronić dodatkowe studzienki przed promieniowaniem, podczas gdy inne studzienki są narażone na określoną dawkę promieniowania. W przeciwnym razie należy użyć pojedynczych płytek lub krążków, aby zobaczyć zarodki w zależności od dawki promieniowania. Włącz promiennik rentgenowski i rozpocznij inicjalizację i rozgrzewkę urządzenia.Umieść płytkę eksperymentalną pod promiennikiem wewnątrz urządzenia pośrodku, upewniając się, że płytka znajduje się bezpośrednio pod źródłem promieniowania rentgenowskiego. A następnie ustaw dawkę i rozpocznij prześwietlenie. Po zakończeniu naświetlania należy wyjąć płytki, wyłączyć program maszyny, wyłączyć maszynę i sprawdzić płytki pod mikroskopem natychmiast po napromieniowaniu.Usuń martwe zarodki i zapisz ich liczbę po ocenie pod mikroskopem preparacyjnym. Włóż płytki do inkubatora w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Zbieraj dane w określonych odstępach czasu po podaniu promieniowania.Zapisz wszystkie możliwe obserwacje, takie jak przeżywalność, wydajność wylęgu, etap rozwoju, liczba uderzeń serca, krzywizna ciała i ogona, obrzęk osierdzia i rozszerzenie woreczka żółtkowego, małogłowie, rozwój pęcherza pławnego, ogólna ruchliwość lub aktywność i tak dalej. Aby uchwycić obrazy, wybierz reprezentatywne zarodki na czystym szkiełku. Sprawdź zarodki pod mikroskopem, ustaw je w określonym kierunku.Krzywa przeżycia dla zarodków napromieniowanych po sześciu godzinach od zapłodnienia wykazała, że w grupie kontrolnej i zarodkach narażonych na działanie 2 szarych i 5 szarych nie było znaczącej śmierci zarodków. Liczba uderzeń serca na minutę sugerowała, że częstość akcji serca ogromnie się zmniejszyła wraz ze wzrostem dawek promieniowania rentgenowskiego. W grupie kontrolnej w każdym 24-godzinnym interwale zaobserwowano wzrost częstości akcji serca.Podejrzewa się poważną deformację układu sercowo-naczyniowego u zarodków narażonych na promieniowanie 15 grych i 20 szarych, ponieważ bicie serca znacznie spadło. Różne wady fenotypowe i rozwojowe są przedstawiane i oceniane dla zarodków narażonych na różne dawki promieniowania w różnych punktach czasowych. Przeprowadzono również obserwacje morfologiczne w kierunku zgięcia kręgosłupa lub ogona, wad rozwojowych głowy i małogłowia, wad rozwojowych, obrzęku osierdzia, deformacji woreczka żółtkowego, deformacji pęcherza pławnego oraz zmian w budowie oka W protokole, który wykazaliśmy, kluczem do tej procedury jest wybór zdrowych zarodków, prawidłowe umieszczenie zarodków w promienniku oraz właściwa ocena nieprawidłowości krzyżowych.

zebrafish-larvae-as-model-to-evaluate-potential-radiosensitizers-or

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ponieważ wiele modeli chorób neurologicznych i nieneurologicznych u danio pręgowanego jest badanych na dorosłych rybach, a nie na zarodkach/larwach, opracowaliśmy ilościowy test regeneracyjny linii bocznej, który może być zastosowany do modeli chorób u dorosłych ryb danio pręgowanego. Test polegał na rozdzielczości na poziomie 1) neuromastu i 2) poszczególnych komórek rzęsatych.

Test do regeneracji linii bocznej u dorosłych danio pręgowanych

Tutaj przedstawiamy proces korzystania z systemu TetON w celu osiągnięcia specyficznej tkankowo ekspresji genów w dorosłej regenerującej się płetwie ogonowej danio pręgowanego.

Wykorzystanie systemu TetON do badania mechanizmów molekularnych regeneracji danio pręgowanego

Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj protokół badań radiacyjnych z użyciem zarodków Danio rerio do oceny radiotoksyczności i skuteczności leków. Metoda umożliwia walidację radiosensybilizatorów i obrońców w radioterapii nowotworów.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Przeglądaj więcej filmów