Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców
25 sierpnia 2022
Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.
Protokół ten opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny leczenia różnymi lekami i promieniowaniem. Pomoże to czytelnikom w ustaleniu półwysokoprzepustowych badań przesiewowych leków obejmujących ekspozycję na promieniowanie rentgenowskie z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego, które pomogą w ocenie radiotoksyczności i skuteczności różnych stosowanych leków. Procedura ta może być stosowana do badań przesiewowych i walidacji lub oceny różnych leków jako potencjalnych radiouczulaczy lub ochronników, które mogą być dalej badane lub wykorzystywane w dziedzinie radioterapii nowotworów lub radiobiologii.
Na początek monitoruj rosnące zarodki pod mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj właściwy etap i usuń martwe lub niezdrowe zarodki. Upewnij się, że odpowiedni stopień zarodka to promieniowanie, a dawki leków zostaną podane na określonym etapie gastrulacji.
Przed rozpoczęciem eksperymentu należy ostrożnie rozprowadzić zdrowe zarodki na płytkach doświadczalnych za pomocą pipety Pasteura. Dla każdej grupy eksperymentalnej należy pobrać od 15 do 20 zarodków. Przygotowując się do eksperymentu z promieniowaniem, należy uwzględnić grupę kontrolną nienapromieniowaną i grupę tylko napromieniowaną.
Rozmieścić zarodki w płytce studzienki, jeśli osłony przed promieniowaniem mogą zakryć i chronić dodatkowe studzienki przed promieniowaniem, podczas gdy inne studzienki są narażone na określoną dawkę promieniowania. W przeciwnym razie należy użyć pojedynczych płytek lub krążków, aby zobaczyć zarodki w zależności od dawki promieniowania. Włącz promiennik rentgenowski i rozpocznij inicjalizację i rozgrzewkę urządzenia.
Umieść płytkę eksperymentalną pod promiennikiem wewnątrz urządzenia pośrodku, upewniając się, że płytka znajduje się bezpośrednio pod źródłem promieniowania rentgenowskiego. A następnie ustaw dawkę i rozpocznij prześwietlenie. Po zakończeniu naświetlania należy wyjąć płytki, wyłączyć program maszyny, wyłączyć maszynę i sprawdzić płytki pod mikroskopem natychmiast po napromieniowaniu.
Usuń martwe zarodki i zapisz ich liczbę po ocenie pod mikroskopem preparacyjnym. Włóż płytki do inkubatora w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Zbieraj dane w określonych odstępach czasu po podaniu promieniowania.
Zapisz wszystkie możliwe obserwacje, takie jak przeżywalność, wydajność wylęgu, etap rozwoju, liczba uderzeń serca, krzywizna ciała i ogona, obrzęk osierdzia i rozszerzenie woreczka żółtkowego, małogłowie, rozwój pęcherza pławnego, ogólna ruchliwość lub aktywność i tak dalej. Aby uchwycić obrazy, wybierz reprezentatywne zarodki na czystym szkiełku. Sprawdź zarodki pod mikroskopem, ustaw je w określonym kierunku.
Krzywa przeżycia dla zarodków napromieniowanych po sześciu godzinach od zapłodnienia wykazała, że w grupie kontrolnej i zarodkach narażonych na działanie 2 szarych i 5 szarych nie było znaczącej śmierci zarodków. Liczba uderzeń serca na minutę sugerowała, że częstość akcji serca ogromnie się zmniejszyła wraz ze wzrostem dawek promieniowania rentgenowskiego. W grupie kontrolnej w każdym 24-godzinnym interwale zaobserwowano wzrost częstości akcji serca.
Podejrzewa się poważną deformację układu sercowo-naczyniowego u zarodków narażonych na promieniowanie 15 grych i 20 szarych, ponieważ bicie serca znacznie spadło. Różne wady fenotypowe i rozwojowe są przedstawiane i oceniane dla zarodków narażonych na różne dawki promieniowania w różnych punktach czasowych. Przeprowadzono również obserwacje morfologiczne w kierunku zgięcia kręgosłupa lub ogona, wad rozwojowych głowy i małogłowia, wad rozwojowych, obrzęku osierdzia, deformacji woreczka żółtkowego, deformacji pęcherza pławnego oraz zmian w budowie oka W protokole, który wykazaliśmy, kluczem do tej procedury jest wybór zdrowych zarodków, prawidłowe umieszczenie zarodków w promienniku oraz właściwa ocena nieprawidłowości krzyżowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie embrionów danio pręgowanego w eksperymentach przesiewowych opartych na promieniowaniu. Przedstawia on podejścia obserwacyjne służące do oceny skutków różnych zabiegów oraz promieniowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Radiobiologia
- Badania nad rakiem
- Przesiewanie leków
Wstęp
- Zebrafish stanowią cenny model do badania efektów promieniowania.
- Protokół ten pomaga w ocenie radiotoksyczności oraz skuteczności leków.
- Wspiera on badanie radiosensybilizatorów i radioprotektorów.
- Określenie stadium rozwoju embrionu jest kluczowe dla zapewnienia dokładnego dawkowania.
Cel badania
- Walidacja potencjalnych modyfikatorów napromieniowania z wykorzystaniem zarodków rybek danio (zebrafish).
- Opracowanie metody przesiewowej leków o średniej przepustowości.
- Wsparcie oceny w radioterapii nowotworów.
Zastosowane metody
- Monitorowanie embrionów danio pręgowanego pod mikroskopem stereoskopowym.
- Identyfikacja i usuwanie niezdrowych embrionów.
- Podawanie dawek promieniowania i leków w określonych etapach gastrulacji.
- Przeprowadzanie eksperymentów przesiewowych w celu oceny efektów działania leków.
Główne wyniki
- Opracowanie protokołu przesiewowego dla leków z wykorzystaniem rybek zebrafish.
- Identyfikacja skutecznych metod leczenia radiotoksyczności.
- Walidacja potencjalnych radiouczulniaczy i radioprotektorów.
- Wytyczne dla przyszłych badań w zakresie radioterapii nowotworów.
Wnioski
- Model rybki zebrafish jest skuteczny w walidacji modyfikatorów promieniowania.
- Niniejszy protokół może usprawnić metodologie przesiewowe leków.
- Wyniki mogą przyczynić się do postępów w leczeniu nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Larwy danio pręgowanego stanowią szybką i skalowalną platformę in vivo do oceny potencjalnych radiouczulaczy i radioprotektorów, odpowiadając na krytyczną potrzebę wczesnego przesiewania funkcjonalnego w procesie poszukiwania leków stosowanych w radioterapii. Model ten umożliwia ilościową ocenę radiotoksyczności i skuteczności leków, co zwiększa pewność prognostyczną i pozwala na ograniczenie ryzyka mechanistycznego w punkcie zwrotnym walidacji przedklinicznej. Integracja testów opartych na danio pręgowanym z procesami odkrywania leków usprawnia selekcję projektów w portfolio i przyspiesza identyfikację obiecujących modyfikatorów promieniowania do zastosowań w onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną walidację potencjalnych radiouczulaczy i radioprotektorów w systemie kręgowców.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez powiązanie ekspozycji na lek z fenotypowymi i rozwojowymi skutkami po napromieniowaniu.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących efektów modyfikujących promieniowanie w kontekście całego organizmu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia platformę o średniej przepustowości do przesiewania bibliotek związków pod kątem aktywności radiomodyfikującej.
- Dostarcza powtarzalne, ilościowe punkty końcowe, takie jak przeżywalność, tętno i fenotypy morfologiczne.
- Umożliwia standaryzację warunków analizy w celu porównawczego zestawienia kandydatów na leki i kontroli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność z punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie toksyczności wywołanej promieniowaniem oraz ochrony in vivo.
- Wsparcie ciągłości procesu od wczesnego etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji modyfikatorów radiacyjnych.
- Dostarczenie informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o rozwoju portfeli leków onkologicznych ukierunkowanych na wzmocnienie radioterapii, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test z użyciem zarodków danio pręgowanego stanowi pomost pomiędzy wczesnym etapem odkryć a walidacją przedkliniczną, umożliwiając szybki screening i ocenę funkcjonalną modyfikatorów radiacji przed badaniami na ssakach.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotezy zerowej w zakresie indukowanej lekami modulacji odpowiedzi na promieniowanie.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnym, ilościowym wynikom fenotypowym.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie przeżywalności oraz punktów końcowych rozwoju i fizjologii w różnych grupach badawczych.
- Badania translacyjne: Modeluje radiotoksyczność in vivo i ochronę istotną dla programów onkologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowaną, skalowalną platformę do wielokrotnych przesiewów różnorodnych zestawów związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu modyfikatorów radioterapii.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, reprodukowalne i skalowalne przepływy pracy dla przesiewu in vivo.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w przypadku potencjalnych leków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój czynników modyfikujących odpowiedź na promieniowanie.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli rybek zebrafish, określania stadium rozwoju embrionów oraz oceny fenotypowej.
- Niezbędny jest dostęp do sprzętu do naświetlania promieniami rentgenowskimi oraz infrastruktury obrazowej do analizy punktu końcowego.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania testu, dawkowania i kryteriów oceny.
- Może być wymagana adaptacja dla konkretnych klas związków lub dawek promieniowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują limity przepustowości oraz konieczność starannego zarządzania grupą kontrolną.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:57
Monitoring Embryos and Selection for Radiation Experiments
1:28
X‐Ray Irradiation
2:38
Data Collection, Imaging, and Analysis
3:17
Results: Effect of Different Doses of X‐Ray Irradiation on 6 hpf Zebrafish Embryos
4:23
Conclusion
